Analyse 3D des réponses multi-cellulaires aux gradients chemoattractant

Les différences entre les cultures in vitro 2D simplifiées et les environnements tissulaires 3D ont accru l’intérêt pour les systèmes 3D pour représenter la complexité spatiale et chimique des tissus vivants. Le processus de fabrication ne nécessite pas de techniques d’installation ou de photolithographie. Cependant, le dispositif PDMS 3D comprend les vecteurs nécessaires pour les applications de l’environnement physiologique 3D.

Pour la préparation de l’appareil mésofluidique, utilisez un logiciel de conception en trois dimensions approprié assisté par ordinateur pour concevoir le masque du moule pour l’appareil polydimethylsiloxane ou PDMS et imprimez le moule à l’aide d’un équipement de lithographie stéréo avec une résine thermorésistante. Lorsque le moule est prêt, mélanger environ trois millilitres de solution de monomère PDMS par moule avec un agent curatif à un rapport de 10 pour un et utiliser un vide pour dégazer le mélange dans un desiccateur sous vide pendant une heure. À la fin de la dessiccation, utilisez un morceau de ruban adhésif pour enlever toute poussière de la surface du moule et remplir soigneusement le moule avec la solution PDMS dégazée.

Ensuite, guérir le PDMS à 80 degrés Celsius pendant deux heures avant de laisser refroidir le moule à température ambiante. Lorsque le moule est refroidi au toucher, utilisez une lame pour couper la limite entre le moule et PDMS et peler soigneusement le PDMS du moule. Coupez le PDMS pour s’adapter à un coverslip de 22 par 22 millimètres et perforer un trou à l’entrée.

À l’aide de tissus à faible peluche et de 70 % d’éthanol, essuyez l’appareil et couvrez l’appareil avec un nouveau morceau de ruban adhésif pour éliminer les grosses particules de poussière. Ensuite, autoclave l’appareil PDMS et coverslip à 121 degrés Celsius pendant huit minutes humide et 15 minutes sèche et traiter la surface inférieure de la partie PDMS et coverslip avec un pistolet de décharge corona pendant cinq minutes dans une hotte de culture tissulaire avant de lier les morceaux ensemble. Pour charger l’appareil, réutilisez d’abord les cellules d’intérêt dans un volume approprié de milieu de croissance complété par 1% de pénicilline et de streptomycine et 1% d’insuline-transferrine-sélénium-x.

Mélangez ensuite 50 microlitres de la suspension mammaire de cellules de glande avec 425 microlitres de solution neutralisée fraîchement préparée de collagène et remplissez une pipette de 200 microlitres avec la suspension de cellule de collagène. Injecter la suspension par l’entrée dans le dispositif PDMS jusqu’à ce que toute la chambre soit remplie et placer l’appareil dans l’incubateur à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant une heure pour induire la gelation avant de remplir les réservoirs des deux côtés avec le milieu de croissance et de retourner l’appareil à l’incubateur jusqu’à l’imagerie confocale. Pour l’imagerie et la quantification 3D, installez une chambre de culture d’imagerie cellulaire vivante sur un microscope confocal et prédéfiniez la température et le dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius et 5 % respectivement.

Ajouter de l’eau au réservoir de la chambre d’imagerie pour humidifier la chambre, en plaçant des lingettes humides dans la chambre au besoin et placer le dispositif PDMS dans la chambre. Ajouter le facteur de croissance épidermique à l’un des réservoirs comme source du facteur dans la formation de gradient laissant l’autre réservoir servir de puits pour le développement de la distribution du facteur de croissance épidermique classé spatialement. Réglez ensuite la plage de la pile Z couvrant le volume d’organoïdes d’intérêt et démarrez l’imagerie.

À la fin de l’expérience, utilisez un programme d’analyse d’image approprié pour mesurer la longueur et l’angle des branches s’étendant des organoïdes ou la migration des cellules individuelles. Les tests silico et in vitro ont révélé la formation d’un gradient linéaire stable de facteur de croissance épidermique à travers la zone de culture cellulaire qui durent environ deux jours sans reconstitution de la source ou des réservoirs d’évier suggérant que le facteur de croissance épidermique, une protéine de 6,4 kilodalton, peut former un gradient stable basé sur la diffusion dans un gel de collagène préparé comme démontré sur une période relativement courte. Les organoïdes mammaires forment de multiples branches en présence d’un facteur de croissance épidermique épidermique de 2,5 nanomolaires uniforme s’il n’y a pas de biais directionnel pendant trois jours si un facteur de croissance épidermique est ajouté dans le gradient linéaire pour avoir 0,5 nanomolaire par millilitre.

Cependant, la formation de branche affiche un biais directionnel significatif. Il convient de noter que l’ajout d’inhibiteurs de jonction d’écart supprime la capacité des organoïdes à répondre au gradient. Le pH de la solution de collagène est critique pour la gelation et la viabilité cellulaire.

Si le collagène n’est pas neutralisé avant le mélange, la viabilité de la cellule sera faible. Cette méthode peut être étendue pour accueillir une modélisation tissulaire plus réaliste et pourrait accueillir la formation de réseau vasculaire à partir de cellules individuelles dans le gel.