In Vivo Deux-Couleur 2-Photon Imagerie des cellules de reporter génétiquement marqués dans la peau

Les changements morphologiques se produisent dans les cellules de fibroblaste sensibles au système immunitaire après l'activation et favorisent des changements dans le recrutement cellulaire. Utilisation de l'imagerie à 2 photons en conjonction avec une protéine génétiquement modifiée spécifique au fibroblaste 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed ^(TB/TB) ligne de souris et vert fluorescent marqué lipopolysaccharide-FITC, nous pouvons illustrer l'apport très spécifique de lipopolysaccharide dans les fibroblastes dermiques et les changements morphologiques in vivo.

Notre protocole nous permet de visualiser comment les cellules étiquetées fluorescentes réagissent à un stimulus périphérique inflammatoire chez un animal vivant en temps réel. L’imagerie 2-Photon permet la visualisation profondément dans le tissu d’un spécimen vivant, préservant l’intégrité de leurs cellules et de leur microenvironnement et fournissant une représentation précise du système biologique. La respiration déplace la patte au fil du temps, causant un flou et une perte du plan focal.

Assurez-vous d’apposer fermement la patte avec du ruban adhésif sur une surface stable avant l’imagerie. En cela, vous devez être en mesure de trouver le plan approprié d’intérêt, assurez-vous que l’objectif est proche de la patte sans toucher et est directement au-dessus du site d’injection. Avant de commencer la procédure, allumez le système multi-photons et sélectionnez le subjectif 25X.

Placez un appareil stéréotaxique sur la scène du microscope multi-photons et connectez l’appareil à une machine de livraison d’anesthésie. Placez un morceau de papier noir mat sur la surface de l’appareil comme point de connexion pour la patte de souris. Réglez le scanner de résonance avec une zone de balayage fixe de 512 par 512 micromètres.

Accordez les lasers excitation aux longueurs d’onde d’excitation de 930 et 1 100 nanomètres pour les signaux de protéines fluorescentes vertes et rouges respectivement. Utilisez un miroir dichroïque de 690 à 1050 nanomètres pour diriger la trajectoire lumineuse des deux lasers d’excitation vers l’objectif unique permettant au laser d’excitation réglé à 930 nanomètres d’être réfléchi au scanner principal et au laser réglé à 1 100 nanomètres de passer directement dans le scanner principal. Réglez ensuite la puissance laser de FITC à 5% et la protéine fluorescente verte à 20% et éteignez les lumières aériennes.

Pour l’imagerie in vivo, anesthésier la souris et décrite dans le protocole texte. Confirmez un manque de réponse au pincement des pieds chez la souris anesthésiée et placez la souris dans l’appareil stéréotaxique avec accès à un cône nasal. Utilisez du ruban noir pour apposer fermement la patte arrière sur le morceau de papier noir sur les zones proximales et distales à la zone d’intérêt, en vous assurant que la surface plantaire de la patte est dégagée et orientée vers l’objectif.

Placez une généreuse quantité de lubrifiant à base d’eau sur la surface plantaire de la patte. Touchez l’objectif au lubrifiant pour créer une colonne de liquide entre la patte et l’objectif. Utilisez la lumière d’excitation FITC pour vous concentrer sur la couche cutanée de la patte, confirmant que les fibroblastes tagués tomate tandem peuvent être visualisés.

Image de la zone des cellules situées juste en dessous de la surface plantaire de la patte arrière avec les deux lasers. Obtenez un laps de temps de 15 minutes d’environ cinq à dix tranches Z à environ un micromètre par tranche afin d’établir une représentation de base de l’environnement. Lorsque l’imagerie de base a été obtenue, chargez une seringue Hamilton en verre de 25 microlitres avec cinq microgrammes de lipopolysaccharide conjugué fitc, ou LPS, par 20 microlitres de PBS.

Administrer la solution par injection intraplantaire dans la patte arrière expérimentale sans perturber la position de la patte. Puis image d’une zone de cellules situées juste en dessous de la surface plantaire de la patte arrière avec les deux lasers. Acquérir un laps de temps de 60 à 120 minutes d’environ cinq à dix tranches Z à environ un micromètre par tranche afin d’identifier l’absorption intraplantaire par cellule de LPS FITC.

Comme il n’y a pas de fluorescence inhérente par les cellules dans la couche cutanée, une myriade de cellules dans la couche cutanée de la patte postérieure peut être observée prenant fluorescente marqué LPS après injection intraplantaire dans une souris de type sauvage. Après l’injection de LPS FITC, seule la protéine spécifique fibroblaste un fibroblaste positif exprimant le péage comme le récepteur quatre lient et absorptionnt la protéine injectée avec un niveau élevé de co-localisation avec une étiquette de tomate de dimère tandem exprimée par ces cellules. En revanche, les souris qui ont péage comme le récepteur quatre assommé de tout le corps ne lient pas et absorption LPS après injection.

En effet, les silhouettes cellulaires sont visibles après l’injection de LPS FITC indiquant que le médicament se disperse dans le liquide interstitiel autour des cellules, mais n’est pas réellement lié par un récepteur. La chose la plus importante à retenir dans ce protocole est de s’assurer que la patte est immobilisée de sorte qu’il n’y ait pas de distorsions dans la vidéo en raison du mouvement ou de la respiration. À l’aide de cette procédure, le recrutement de cellules étiquetées fluorescentes dans une zone après une blessure et les changements morphologiques dans la réponse d’une cellule à un stimulus au fil du temps peuvent être suivis.

Ainsi, l’imagerie 2-Photon permet aux chercheurs de combiner des souris de journalistes génétiques et des composés marqués fluorescents pour évaluer ce qui se passe chez un animal vivant après une injection.