Name: Évaluation de la migration des lymphocytes dans un système de transmigration ex vivo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Découvrez comment évaluer la migration des lymphocytes in vitro grâce à un système de transmigration ex vivo. Cette méthode permet de quantifier la mobilité cellulaire en réponse aux chimiokines.

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Ces travaux ont été financés par l'American Lung Association (K.J.W.), le fonds Memorial Eugene Kenney attribué à T.A.W. et K.J.W., un généreux soutien de démarrage de l'Université de l'Utah pour K.J.W., et un prix du ministère des Anciens Combattants à T.A.W. (VA I01BX0003635). T.A.W. est le récipiendaire d'un prix de chercheur en carrière scientifique (IK6 BX003781) du ministère des Anciens Combattants. Les auteurs tiennent à souligner l'aide éditoriale de Mme Lisa Chudomelka. Les auteurs remercient le noyau de cytométrie des flux de l'UNMC pour leur soutien dans la collecte des données de cytométrie de flux générées pour ce manuscrit.

Toutes les méthodes décrites ici ont été examinées et approuvées par les comités institutionnels de soins et d'utilisation des animaux du Centre médical de l'Université du Nebraska (UNMC) et de l'Université de l'Utah.
1. Configuration et préparation des réactifs
<ol><li>
Préparer les médias complets du RPMI (Roswell Park Memorial Institute).
	<ol>
<li>Ajouter 10 ml de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (SGF) à 90 ml de RPMI.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de 100x Pénicilline-Streptomycine-Glutamine à 100 ml de 10% FBS RPMI.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparer ILC2 Expansion Media.
	<ol>
<li>Ajouter l'IL-2 et l'IL-33 (20 ng/mL chaque cytokine) à 10 ml de RPMI complet.</li>
		<li>Si les cytokines de stock sont de 10 g/mL, la pipette 20 'L d'IL-2 et d'IL-33 dans un tube de 15 ml contenant 10 ml de support COMPLET de RPMI.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparer la dissociation pulmonaire moyenne.
	<ol>
<li>Ajouter 50 mg de collagène de type 1 à 250 ml de RPMI non complété.</li>
		<li>Ajouter 2,5 ml de pénicilline-streptomycine-glutamine 100x à 250 ml de support dans l'étape 1.3.1.</li>
		<li>Mélanger délicatement les supports pour s'assurer que le type 1 De collagène est complètement dissous avant utilisation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparer le RPMI sans sérum.
	<ol>
<li>Diluer 1 g d'albumine de sérum bovin lyophilisé (BSA) dans 200 ml de RPMI.</li>
		<li>Ajouter 2 ml de pénicilline-streptomycine-glutamine 100x.</li>
		<li>Mélanger délicatement les médias pour vous assurer que le BSA est complètement dissous dans les médias avant utilisation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparer Migration Medium avec CCL17.
	<ol>
<li>Acquérir 10 ml de RPMI sans sérum et ajouter CCL17 [50 ng/mL].<ol>
<li>Si le stock CCL17 est de 10 g/mL, ajouter 50 oL de bouillon de CCL17 à 10 ml de milieux RPMI sans sérum.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparer Migration Medium avec CCL22.
	<ol>
<li>Acquérir 10 ml de RPMI sans sérum et ajouter CCL22 [50 ng/mL].</li>
		<li>Si le stock CCL22 est de 10 g/mL, ajouter 50 oL de bouillon de CCL22 à 10 ml de milieu xérique RPMI.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparer le cocktail de teinture d'anticorps CCR4.
	<ol>
<li>Pour un total de 10 tests, ajoutez 5 ll de chacun des anticorps suivants à un tube de 5 mL : anti-souris CCR4, CD19, CD11b, CD45, ST2 et ICOS. REMARQUE: Exemple de la façon de faire un cocktail d'anticorps pour 10 échantillons : 0,5 L de chaque anticorps x 10 échantillons, soit 5 l de chacun des anticorps énumérés dans 1,7,1.</li>
		<li>Pour un total de 10 tests, ajoutez 2,5 l des anticorps suivants au cocktail d'anticorps à partir de l'étape 1.7.1 : cD3 anti-souris, CD11c et NK1.1. REMARQUE: Exemple pour compléter le cocktail d'anticorps pour 10 échantillons : 0,25 ML x 10 échantillons et 2,5 l d'anticorps CD3, CD11c et NK1.1.</li>
		<li>Conserver le cocktail de teinture d'anticorps CCR4 à 4 oC jusqu'à ce qu'il soit prêt à l'ajouter aux échantillons. Jeter le cocktail d'anticorps après 1 semaine s'il n'est pas utilisé.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparer 1x Stabilisateur stabilisateur stabilisateur.
	<ol>
<li>Ajouter 10 ml d'eau distillée déionisée à 5 ml de concentré fixatif stabilisateur stabilisateur 3x</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Préparation de souris BALB/c contestées par les allergènes
REMARQUE: Des souris MÂLEs et femelles de BALB/c ont été achetées de Charles River (UNMC) ou de Jackson Laboratories (Université de l'Utah) à l'âge de 6 à 8 semaines.
<ol><li>
Après l'acclimatation (1 semaine), sensibiliser tous les animaux à l'OVA.
	<ol>
<li>Dans un tube en polystyrène de 5 ml, verser 100 g/mL d'hydroxyde d'aluminium (20 mg/ml) dans un tube en polystyrène de 5 ml.</li>
		<li>Mélanger le tube et immédiatement tirer 500 'L de la suspension ova-alum dans une seringue de 1 ml, 28 G (seringue d'insuline).</li>
		<li>Placer une souris dans un bocal à clochecontenant de l'isoflurane (1 x 2 ml sous un faux plancher, de sorte que l'animal ne se trouve pas directement dans l'isoflurane). Laisser la souris passer sous anesthésie pendant environ 1 h à 2 min, ou jusqu'à ce que le taux de respiration diminue.</li>
		<li>Ramassez rapidement la souris par la fourrure sur le dos et les épaules et injectez 100 L d'alum OVA intrapéritonel par souris21,22.</li>
		<li>Placez la souris dans sa cage et regardez pour s'assurer qu'ils retrouvent la mobilité; cela devrait se produire dans les 2 à 5 minutes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sept jours après la sensibilisation, soumettre tous les animaux à intranasal (i.n.) 1,5% OVA dilué dans saline stérile dans une chambre de nébulisation (Data Sciences International) pendant 20 min.
	<ol>
<li>Retirez les souris de leurs cages et placez-les dans la chambre de nébulisation animale. Fermez le couvercle de la chambre.</li>
		<li>Fixez le tuyau de nébulisation au bécout d'entrée sur la chambre de nébulisation.</li>
		<li>Ajouter 30 ml de 1,5 % d'OVA dilué dans la saline stérile à la tasse de nébulisation sur le nébuliseur.</li>
		<li>Allumez le nébuliseur et laissez la chambre se remplir de brume pendant 20 min.</li>
		<li>Éteignez le nébuliseur et laissez la brume s'installer.</li>
		<li>Renvoyez les animaux dans leurs cages.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Répétez l'étape 2.2 pour un total de 5 fois, sur 5 jours consécutifs, pour induire une inflammation allergique.</li>
</ol>3. Isolement des CD4et des lymphocytes T de la rate et des poumons de souris ova-contestées
<ol><li>Euthanasier humainement tous les animaux mâles et femelles traités par OVA par asphyxie co2 selon les protocoles approuvés de l'IACUC, en utilisant 2 à 3 animaux par groupe, par expérience.</li>
	<li>Exciser les poumons et les rates des animaux et placer les tissus dans des tubes de dissociation séparés en fonction du type de tissu et le sexe de l'animal23.</li>
	<li>Dissocier le tissu pulmonaire dans 500 l de médias de dissociation pulmonaire (25 U/mL; collagène, type 1) dans le dissociateur automatisé de tissu utilisant le protocole de ' poumon'.
	<ol>
<li>Répétez 3,2 et 3,3 au total deux fois.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissociez le tissu de rate dans 500 l de médias complets de RPMI utilisant le protocole de ' rate' sur le dissociateur automatisé de tissu. REMARQUE: Les étapes restantes doivent être effectuées dans une armoire de sécurité biologique à l'aide d'une technique stérile.</li>
	<li>Rincer les tubes de dissociation contenant des homogénéices pulmonaires et de rate avec 5 ml de milieu supplémentaire de dissociation pulmonaire ou RPMI complet, respectivement.</li>
	<li>Filtrer les suspensions cellulaires à travers une passoire cellulaire de 40 m et les recueillir dans des tubes coniques de 50 ml.</li>
	<li>Incuber les homogénéités pulmonaires pendant 15 à 30 min dans un incubateur de 37 oC avec 5 % de CO2 pour dissocier davantage les tissus pulmonaires.</li>
	<li>Ajouter 5 ml de RPMI complet au poumon et à la rate homogénéise et granuler les cellules au fond des tubes de 50 ml à l'aide de centrifugation; 378 x g à température ambiante (RT) pendant 5 min.</li>
	<li>Combinez les splenocytes et les cellules pulmonaires dans un seul tube conique de 50 ml et déterminez le nombre total de cellules à l'aide du compteur cellulaire automatisé.</li>
	<li>Ajuster les suspensions cellulaires mâles et femelles à 1 x 108 cellules/mL dans un tampon de séparation et ajouter à un tube de polystyrène de 5 ml. REMARQUE: Le protocole d'enrichissement peut être ajusté jusqu'à 14 ml de tubes de polystyrène lorsque plus de cellules sont acquises à partir de la rate et des poumons. Ce protocole a été conçu pour les tissus de 2 à 3 souris par groupe; par conséquent, un tube de 5 ml devrait suffire.</li>
	<li>Utilisez environ les deux tiers des cellules totales pour l'isolement ILC2 selon le protocole d'enrichissement ILC2.
	<ol>
<li>Ajouter le cocktail d'anticorps (50 l/mL) à la suspension cellulaire et couver pendant 5 min à RT.</li>
		<li>Vortex sphères rapides pour 30 s et ajouter à l'échantillon à un taux de 75 L/mL de suspension cellulaire. Mélanger délicatement et incuber pendant 5 min à RT.</li>
		<li>Garnir le tube jusqu'à 3 ml de volume total avec un tampon de séparation et placer dans l'aimant de séparation facile de 8 chambres. Incuber pendant 3 min à RT.</li>
		<li>Inclinez l'aimant vers l'avant (loin des complexes de cellule-anticorps de sphère adhérés à l'arrière du tube) et pipette outre de la suspension de cellules dans un tube propre de 5 ml.</li>
		<li>Ajouter 1,5 ml de RPMI complet aux tubes et centrifugeuse à 378 x g pendant 5 min à RT.</li>
		<li>Verser le support de la pastille cellulaire et resuspendre l'ILC2 à 1 x 107 cellules par mL.</li>
		<li>Placez 100 uL d'ILC2 mâle et femelle par puits dans une plaque de 96 puits en U et ajoutez 100 ll de media d'expansion ILC2 à chaque puits.</li>
		<li>Incuber les cellules pendant 4 à 5 jours pour étendre l'ILC2.</li>
		<li>Recueillir l'ILC2 dans un tube de 5 ml et ajouter jusqu'à 4,5 ml de RPMI sans sérum. Centrifugeles les cellules à 378 x g pendant 5 min à RT.</li>
		<li>Compter les cellules à l'aide d'un hémacytomètre et resuspendre à 1 x 107 ILC2 par mL dans le RPMI sans sérum.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilisez les cellules restantes pour la procédure d'isolement des cellulesT CD4, qui est menée selon le protocole d'isolement des cellules T cD4de la souris avec peu de modifications.
	<ol>
<li>Ajouter le sérum de rat (50 l/mL) à la suspension d'enrichissement des cellules T CD4.</li>
		<li>Ajouter le cocktail d'isolement (50 l/mL) à l'échantillon et couver pendant 10 min à RT.</li>
		<li>Vortex sphères rapides pour 30 s et ajouter à l'échantillon à un taux de 75 L/mL.</li>
		<li>Mélanger délicatement la suspension cellulaire et couver pendant 2,5 min et RT</li>
		<li>Garnir les échantillons jusqu'à 3 ml et placer les tubes de 5 ml dans l'aimant de séparation facile de 8 chambres et couver pendant 5 min à RT.</li>
		<li>Verslez l'aimant vers l'avant et pipette la suspension de la cellule dans un tube propre de 5 ml.</li>
		<li>Ajouter 1,5 ml de RPMI sans sérum aux tubes et centrifugeuse à 378 x g pendant 5 min à RT.</li>
		<li>Versez le support de la pastille cellulaire et suspendez les lymphocytes CD4et T à 1 x 107 cellules par mL dans le RPMI sans sérum.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Déterminer l'expression cCR4 sur cD4- cellules T et groupe 2 cellules lymphoïdes innées (ILC2) des animaux OVA contestés par cytométrie de flux
REMARQUE: Les étapes suivantes peuvent être effectuées sur un dessus de banc ouvert car elles sont des techniques non stériles.
<ol><li>
Acquérir environ 1 à 2,5 x 105 cellules ILC2 à partir de l'étape 3.11.10 et de 1 à 2,5 x 106 cD4et t de l'étape 3.12.8 dans des tubes séparés de 5 ml.
	<ol>
<li>Gardez un tube supplémentaire d'au moins 5,0 x 104 lymphocytes T CD4 MD comme un contrôle non taché.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Suspendre les cellules dans 100 à 200 oL de tampon FACS et ajouter 1 l de fc Block à chaque tube, puis incuber sur la glace (ou dans un réfrigérateur de 4 oC) pendant 10 min.</li>
	<li>Ajouter 1/2 mL de tampon FACS à chaque tube et centrifugeuse à 378 x g pendant 5 min à RT.</li>
	<li>Verser le supernatant et resuspendre les cellules dans 100 à 200 l de FACS Buffer.</li>
	<li>Ajoutez 37,5 L du cocktail de coloration des anticorps CCR4 à la suspension cellulaire dans chaque tube, à l'exception du tube contenant les cellules « non tachées ».</li>
	<li>Incuber les tubes sur la glace, ou dans un réfrigérateur de 4 oC, pendant 20 à 30 min.</li>
	<li>Ajouter 1/2 mL de tampon FACS à chaque tube et centrifugeuse à 378 x g pendant 5 min à RT.</li>
	<li>Verser le supernatant.</li>
	<li>Répétez les étapes 4.7 et 4.8.</li>
	<li>Ajouter 250 à 300 l de fixatif stabilisateur stabilisateur 1x (voir Tableau des matériaux)à chaque tube.</li>
	<li>
Préparer des contrôles de perles de couleur unique pour chaque anticorps dans le cocktail d'anticorps CCR4 selon le protocole fourni avec les perles de compensation.
	<ol>
<li>Vortex les perles de compensation.</li>
		<li>Ajouter une goutte de perles à chaque tube de commande unicolore.</li>
		<li>Ajouter 1 oL de chaque anticorps dans le cocktail CCR4 Antibody à son propre tube étiqueté.</li>
		<li>Mélanger délicatement et incuber 10 min dans un réfrigérateur à 4 oC ou sur de la glace.</li>
		<li>Ajouter 1/2 ml de tampon FACS à tous les tubes et centrifugeuse à 378 x g pendant 5 min à RT.</li>
		<li>Verser le supernatant et resuspendre les perles dans 200 ll de tampon FACS.</li>
		<li>Réfrigérer les commandes unicolores jusqu'à ce que tous les échantillons soient tachés et prêts à être analysés sur le cytomètre d'écoulement.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyser les cellules non tachées, les commandes unicolores et les échantillons expérimentaux sur le cytomètre d'écoulement dans les 24 h suivant la fixation.</li>
</ol>5. Procédure de transmigration ex Vivo
REMARQUE: Les étapes suivantes doivent être effectuées dans un cabinet de sécurité biologique, car elles nécessitent une technique stérile.
<ol><li>Acquérir les cellules ILC2 de l'étape 3.11.10 et cD4 des lymphocytes T de l'étape 3.12.8 et déterminer le nombre d'inserts de transwell nécessaires pour l'expérience. REMARQUE: Exemple : Pour 1,2 ml de lymphocytes T CD4 enrichis à partir de l'étape 3.12.8, multipliez 1,2 x 1 000 l et 1 200 l; puis diviser 1 200 uL par 100 L et 12, le nombre d'inserts nécessaires pour la transmigration CD4 T.</li>
	<li>Déplacez doucement les inserts transwell de 3 m à partir des rangées du milieu d'une plaque de 24 puits.</li>
	<li>Ajouter 500 l de supports de migration avec CCL17 à environ un tiers des puits.</li>
	<li>Ajoutez 500 l de supports de migration avec CCL22 à un autre tiers des puits.</li>
	<li>Ajouter 500 L de RPMI sans sérum sans contenant de chimiokine au dernier tiers des puits.</li>
	<li>Étiquetez clairement le couvercle sur la plaque avec le support de transmigration approprié placé dans les puits inférieurs.</li>
	<li>Placer les inserts de transwell dans les puits contenant les différents traitements.</li>
	<li>Ajouter délicatement 100 L de lymphocytes T CD4 ou ILC2 au puits supérieur de chaque insert. Ne pas mélanger ou pipette la suspension cellulaire de haut en bas dans les transwells, car cela peut confondre les résultats de l'expérience.</li>
	<li>Étiquetez clairement le couvercle de la plaque avec le type de cellule placé dans chaque puits et écrivez la date et l'heure de la journée que les cellules ont été ajoutées.</li>
	<li>Répétez les étapes 5.2 à 5.9 jusqu'à ce que toutes les cellules aient été placées dans des inserts transwell avec des supports.</li>
	<li>Placer délicatement la plaque dans un incubateur de 37 oC avec 5 % de CO2 pendant 48 h. Minimiser le contact avec la plaque pendant la période d'incubation.</li>
</ol>6. Quantification de la transmigration ex vivo
<ol><li>Retirez délicatement la plaque de l'incubateur et retirez tous les inserts transwell des rangées du milieu dans les puits vides juste au-dessus ou en dessous.</li>
	<li>Recueillir les cellules du bas et du haut des puits de transwell dans des tubes étiquetés avec TOP ou BOTTOM, avec CCL17, CCL22, ou des médias, avec le type de cellule, et avec le numéro de réplique (au moins 3 répliques par expérience).</li>
	<li>Rincer les puits inférieurs avec 500 L de 1x PBS et recueillir ce rinçant dans le tube correspondant.</li>
	<li>Rincer les puits supérieurs avec 250 L de 1x PBS et recueillir ce rinçant dans le tube correspondant.</li>
	<li>Pelleter les cellules par centrifugation à 378 x g pendant 5 min à RT.</li>
	<li>Pipette doucement hors tout supernatant de la pastille cellulaire.</li>
	<li>Resuspendre les lymphocytes T et ilC2 en 50 OL de 1x PBS.</li>
	<li>Prenez 10 l des suspensions cellulaires et ajoutez à 90 l de 0,4 % de bleu trypan.</li>
	<li>
Comptez les cellules sur le compteur cellulaire automatisé.
	<ol>
<li>Record %de viabilité.</li>
		<li>Enregistrez le nombre de cellules par mL pour chaque échantillon.</li>
		<li>Déterminer le nombre total de cellules par traitement dans la chambre supérieure et inférieure; enregistrer le nombre de cellules.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th2+cell+differentiation+from+naive+CD4%28%2B%29+T+cells+is+enhanced+by+autocrine+CC+chemokines+in+atopic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Allergy%3A+Journal+of+the+British+Society+for+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Th2 cell differentiation from naive CD4(+) T cells is enhanced by autocrine CC chemokines in atopic diseases.</a> Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. , (2018).</li>
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<li>Hoyler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+GATA-3+controls+cell+fate+and+maintenance+of+type+2+innate+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells.</a> Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).</li>
<li>Nakajima, H., Shores, E. W., Noguchi, M., Leonard, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+common+cytokine+receptor+gamma+chain+plays+an+essential+role+in+regulating+lymphoid+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The common cytokine receptor gamma chain plays an essential role in regulating lymphoid homeostasis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 185 (2), 189-195 (1997).</li>
<li>Warren, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RSV-specific+anti-viral+immunity+is+disrupted+by+chronic+ethanol+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">RSV-specific anti-viral immunity is disrupted by chronic ethanol consumption.</a> Alcohol. , (2016).</li>
<li>Warren, K. J., Poole, J. A., Sweeter, J. M., DeVasure, J. M., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+association+between+MMP-9+and+impaired+T+cell+migration+in+ethanol-fed+BALB%2Fc+mice+infected+with+Respiratory+Syncytial+Virus-2A%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">An association between MMP-9 and impaired T cell migration in ethanol-fed BALB/c mice infected with Respiratory Syncytial Virus-2A.</a> Alcohol. , (2018).</li>
<li>Molteni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+device+to+concurrently+assess+leukocyte+extravasation+and+interstitial+migration+within+a+defined+3D+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A novel device to concurrently assess leukocyte extravasation and interstitial migration within a defined 3D environment.</a> Lab on a Chip. 15 (1), 195-207 (2015).</li>
<li>Bersini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+in+vitro+3D+co-culture+model+to+engineer+vascularized+bone-mimicking+tissues+combining+computational+tools+and+statistical+experimental+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Human in vitro 3D co-culture model to engineer vascularized bone-mimicking tissues combining computational tools and statistical experimental approach.</a> Biomaterials. 76, 157-172 (2016).</li>
<li>Jeon, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+3D+vascularized+organotypic+microfluidic+assays+to+study+breast+cancer+cell+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont pas de divulgations financières ou de conflits d'intérêts à divulguer.

Ici, nous présentons une méthode bien établie pour évaluer la migration chimiokine-induite des lymphocytes dans un système de transmigration ex vivo. Il y a plusieurs étapes critiques dans le protocole, dont la première est de vérifier l'expression du récepteur correct de chimiokine sur les cellules immunitaires dans l'expérience. Dans nos mains, nous avons choisi CCR4 en raison du corps de la littérature qui souligne l'importance de CCR4 sur les cellules T aide Th2 dans l'inflammation allergique. L'inflammation Ovalbumi...

Cette méthode originale de transmigration a été présentée par Stephen Boyden en 1962 dans le Journal of Experimental Medicine1. Une grande partie de ce que nous savons sur la chimiotaxie et la chimiothérapeutique ne serait pas possible sans le développement de la chambre Boyden. Avant la découverte de la première chimiokine en 1977, les systèmes de transmigration ex vivo ont été utilisés pour en apprendre davantage sur les facteurs sériques qui pourraient arrêter le mouvement cellulaire dans les macrophages tout en amplifiant la motilité cellulaire chez les neutrophiles1,2. Une énorme richesse de connaissances a été développée en ce qui concerne la migration des cellules immunitaires, et à ce jour, 47 chemokines ont été découverts avec 19 récepteurs correspondants3,4. En outre, des multitudes d'inhibiteurs/améliorateurs de ces voies de chimiokine ont subi le développement à des fins thérapeutiques5,6,7,8. Beaucoup de ces composés ont été testés dans des chambres de transmigration similaires pour comprendre les interactions directes entre les composés et la réactivité des cellules immunitaires à une chimiokine donnée9.
La transmigration, ou diapède, dans les tissus enflammés est un processus essentiel à une réponse inflammatoire saine à l'infection claire10,11. Une chambre Boyden, un système de transmigration ou un appareil de transwell sont généralement composés de deux chambres séparées par une membrane poreuse1,12. La chambre inférieure tient le plus souvent des supports contenant la chimiokine d'intérêt, tandis que les leucocytes sont placés dans la chambre supérieure. La taille des pores de la membrane peut être sélectionnée en fonction de la taille de la cellule d'intérêt. Pour ce projet, nous avons sélectionné une membrane poreuse de 3 m, car les cellules lymphoïdes ont une taille de 7 à 20 m, selon le stade du développement cellulaire. Cette taille de pores assure que ces cellules ne tombent pas passivement à travers les pores, mais qu'elles migrent activement en réponse au gradient de chimiokine.
Le principal avantage de ce protocole est sa rentabilité. La transmigration in vivo est difficile parce qu'elle nécessite une formation approfondie sur la manipulation et la chirurgie des animaux, et implique souvent une microscopie de haute puissance qui n'est pas toujours disponible pour un chercheur. Le criblage rentable des composés censés améliorer ou inhiber la transmigration peut être accompli avant l'imagerie in vivo. Puisque le système de transmigration est étroitement commandé, les cellules peuvent être traitées d'abord puis ajoutées à l'appareil de transwell, ou, vice versa, la chimiokine peut être traitée d'abord avec un inhibiteur de chimiokine puis des cellules ajoutées à l'appareil de transwell. Enfin, les cellules endothéliales et/ou les protéines membranaires du sous-sol peuvent être ajoutées au fond de l'insertion de transwell 1-2 jours avant l'expérience de transmigration pour comprendre l'implication de ces cellules de barrière dans la chimioïétique. Encore une fois, ces manipulations du système fournissent un moyen puissant de déterminer des informations importantes sur l'efficacité d'un composé donné avant des études in vivo plus compliquées.
L'utilisation d'un système de chambre de transmigration est un moyen efficace d'évaluer la mobilité des lymphocytes dans diverses conditions in vivo et in vitro12,13,14. Ici, nous décrivons une méthode optimisée pour évaluer la réactivité ex vivo de lymphocyte aux chemokines dans une chambre de transmigration. Dans cet exemple d'expérience, les lymphocytesT CD4 et le groupe 2 lymphoïdes innés (ILC2) ont été isolés chez des souris mâles et femelles, BALB/c après exposition ova-allergène. Une hypothèse a été générée que CCR4- CD45- Lineage- (LIN-) ILC2 à partir de souris à défi allergène migrerait plus efficacement vers CCL17 et CCL22 que CCR4- CD4- T cellules d'aide. CCL17 et CCL22 sont des chemokines couramment produites par les cellules dendritiques et les macrophages du phénotype M2 (allergique), entre autres cellules, dans l'allergie15,16. CCL17 et CCL22 peuvent être considérés comme des biomarqueurs de l'inflammation allergique car ils sont facilement détectés dans les poumons lors d'exacerbations des voies respiratoires16,17,18. Fait important, l'expression CCR4 est élevée par rapport aux témoins non traités, comme le révèlent les données bioinformatiques générées par ilC2 isolés à partir d'animaux traités par les acariens de la poussière domestique, et de même ILC2 d'animaux naïfs traités ex vivo avec IL-33 ( cytokine innée favorisant l'allergène) upregulates CCR419,20. En outre, selon les données pour ILC2 dans la base de données immunologique de projet de génome (www.immgen.org), l'ARNm cCR4 est fortement exprimé dans ces cellules immunitaires innées. À ce jour, on sait peu de choses concernant le trafic d'ILC2 dans les tissus, mais il est probable que les cellules ILC2 etCD4-T utilisent des chimiocines et des récepteurs similaires pour la chimiotaxie et la chimiogénie car elles expriment des facteurs de transcription et des récepteurs similaires. Ainsi, nous avons comparé la réactivité du CCL17 à la réactivité du CCL22, des lymphocytes ILC2 et CD4T, provenant à la fois d'animaux mâles et femelles, d'animaux à défi OVA.

<table><tbody><tr><td>0,4 % Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>1 mL seringue</td><td>BD Bioscience</td><td>329424</td><td>U-100 Seringues Micro-Fine 28 G 1/2" 1cc</td></tr><tr><td>100x Pénicilline-Streptomycine, L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>Diluer à 1x dans un support RPMI</td></tr><tr><td>Tubes coniques de 15 mL Olympus</td><td>Plastics</td><td>28-101</td><td>Tubes en polypropylène</td></tr><tr><td>3 &mu ; m inserts transwell</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-288</td><td>Plaque de 24 puits contenant 12 inserts de transwell</td></tr><tr><td>3x fixateur stabilisant</td><td>BD Pharmigen</td><td>338036</td><td>Préparer 1x solution selon le protocole du fabricant</td></tr><tr><td>5 mL tubes en polystyrène</td><td>STEM Cell Technologies</td><td>38007</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubes coniques</td><td>Olympus Plastics</td><td>28-106</td><td>tubes</td></tr> <tr><td>en polypropylèneAimant à séparation facile à 8 chambres</td><td>STEM Cell Technologies</td><td>18103</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lysing ACK</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Crépine de cellules avancée, 40 &mu ; m</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-375</td><td>maille en nylon, 40 &mu ; crépines Hydroxyde d’aluminium</td></tr><tr><td>, qualité réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239186-25G</td><td>20 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-souris CCR4 ; </td><td>Biolegend</td> conjugué <td>à l’APC 131211</td><td>0,5 &mu ; g/test</td></tr><tr><td>anti-souris CD11b</td><td>BD Pharmigen</td><td>557396</td><td>0.5 &mu ; g/test</td></tr><tr><td>anti-souris CD11c ; PE eFluor 610</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td>61-0114-82</td><td>0.25 &mu ; g/test</td></tr><tr><td>anti-souris CD16/32, Fc block</td><td>BD Pharmigen</td><td>553141</td><td>0.5 &mu ; g/test</td></tr><tr><td>anti-souris CD19 ; APC-eFluor 780 conjugué</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td>47-0193-82</td><td>0.5 &mu ; g/test</td></tr><tr><td>anti-souris CD3 ; PE Cy 7-conjugué</td><td>BD Pharmigen</td><td>552774</td><td>0,25 &mu ; g/test</td></tr><tr><td>anti-souris CD45 ; PE conjugué</td><td>BD Pharmigen</td><td>56087</td><td>0.5 &mu ; g/test</td></tr><tr><td>anti-souris ICOS (CD278)</td><td>BD Pharmigen</td><td>564070</td><td>0.5 &mu ; g/test</td></tr><tr><td>anti-souris NK1.1 (CD161) ; </td><td>BD Pharmigen</td> conjugué FITC <td>553164</td><td>0,25 &mu ; g/test</td></tr><tr><td>anti-souris ST2 (IL-33R) ; Biolegend conjugué PerCP Cy5.5</td><td></td><td>145311</td><td>0,5 &mu ; g/test</td></tr><tr><td>Compteur de cellules automatisé</td><td>BIORAD</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>Dissociateur automatisé</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine, poudre lyophilisée</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-10G</td><td>0,5 % dans le RPMI sans sérum</td></tr><tr><td>Compteur de cellules</td><td>Clides BIORAD</td><td>1450015</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumine d’œuf de poule, grade V</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5503-10G</td><td>500 &mu ; g/mL</td></tr><tr><td>de collagénase, type 1, filtré</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>CLSS-1, acheter sous forme de 5 flacons de 50 mg (LS004216)</td><td>25 U/mL en</td></tr><tr><td>billes de compensation</td> RPMI <td>Affymetrix</td><td>01-1111-41</td><td>1 goutte par tube de</td></tr><tr><td>contrôle Tubes de dissociation</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-096-335</td><td></td></tr><tr><td>Tampon FACS</td><td>BD Pharmigen</td><td>554657</td><td>1x PBS + 2 % FBS, avec azoture de sodium ; stocké à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Heat Inactivated-FBS</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-525H</td><td>10 % en RPMI complet & Média d’extension ILC2</td></tr><tr><td>Souris CCL17</td><td>GenScript</td><td>Z02954-20</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>Souris CCL22</td><td>GenScript</td><td>Z02856-20</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>Souris CD4+ Kit d’enrichissement des lymphocytes T</td><td>STEM Cell Technologies</td><td>19852</td><td></td></tr><tr><td>Souris IL-2</td><td>GenScript</td><td>Z02764-20</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>Souris Kit d’enrichissement ILC2</td> Technologies des <td>cellules souches</td><td>19842</td><td></td></tr><tr><td>Souris recombinante IL-33</td><td>STEM Cell Technologies</td><td>78044</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>22400071</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de séparation</td><td>STEM Cell Technologies</td><td>20144</td><td>1x PBS + 2 % FBS ; stocké à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Nébuliseur et chambre pour petits animaux</td><td>Data Sciences International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution saline stérile</td><td>Baxter</td><td>2F7124 ; NDC 0338-0048-04</td><td>Chlorure de sodium à 0,9 %</td></tr></tbody></table>

Évaluation de la migration des lymphocytes dans un système de transmigration ex vivo

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Ici, nous présentons une méthode efficace qui peut être exécutée avec les qualifications et les matériaux de laboratoire de base pour évaluer le mouvement chimio-entique de lymphocyte dans un système de transmigration ex vivo. Les cellules lymphoïdes innées du groupe 2 (ILC2) et les cellules d'aide CD4t ont été isolées des rates et des poumons des souris BALB/c de BALB/c d'ovalbumine d'oeufde de poulet (OVA). Nous avons confirmé l'expression de CCR4 sur les deux cD4- lymphocytes T et ILC2, comparativement. LE CCL17 et le CCL22 sont les ligands connus pour le CCR4; par conséquent, en utilisant cette méthode de transmigration ex vivo, nous avons examiné le CCL17- et le mouvement induit par le CCL22 deslymphocytes CCR4. Pour établir des gradients de chimiokine, CCL17 et CCL22 ont été placés dans la chambre inférieure du système de transmigration. Des lymphocytes isolés ont alors été ajoutés aux chambres supérieures et sur une période de 48 h les lymphocytes ont activement migré par des pores de 3 m vers la chimiokine dans la chambre inférieure. Il s'agit d'un système efficace pour déterminer la chimioïque des lymphocytes, mais, naturellement, n'imite pas les complexités trouvées dans les microenvironnements in vivo d'organe. C'est une limitation de la méthode qui peut être surmontée par l'ajout de l'imagerie in situ de l'organe et des lymphocytes à l'étude. En revanche, l'avantage de cette méthode est que peut être effectuée par un technicien d'entrée de gamme à un taux beaucoup plus rentable que l'imagerie en direct. Comme les composés thérapeutiques deviennent disponibles pour améliorer la migration, comme dans le cas de la tumeur infiltrant les cellules immunitaires cytotoxiques, ou pour inhiber la migration, peut-être dans le cas des maladies auto-immunes où l'immunopathologie est préoccupante, cette méthode peut être utilisée comme un outil de dépistage. En général, la méthode est efficace si la chimiokine d'intérêt génère constamment des chimioïques à un niveau statistiquement plus élevé que le contrôle des médias. Dans de tels cas, le degré d'inhibition/amélioration par un composé donné peut également être déterminé.

Expression CCR4 sur les lymphocytes T CD4 et ILC2.
Pour le succès de l'expérience de transmigration ex vivo, il est impératif de déterminer si les lymphocytes sont sensibles au CCL17 et au CCL22 par cCR4; par conséquent, nous avons déterminé l'expression de CCR4 sur les deux cellules CD4et T et ILC2 par cytométrie de flux. Bien qu'il soit bien connu que les lymphocytes T CD4et aidespécifiques ovabiques expriment cCR4, on en sait moins sur l'expression du ...

Dans ce protocole, les lymphocytes sont placés dans la chambre supérieure d'un système de transmigration, séparés de la chambre inférieure par une membrane poreuse. La chimiokine est ajoutée à la chambre inférieure, qui induit une migration active le long d'un gradient de chimiokine. Après 48 h, les lymphocytes sont comptés dans les deux chambres pour quantifier la transmigration.

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

La transmigration des lymphocytes est une caractéristique importante de toute réponse immunitaire. Par conséquent, ce protocole est significatif parce qu’il permet à un chercheur d’évaluer la mobilité des lymphocytes dans un système in vitro bien défini. Le principal avantage de cette technique est que diverses chimiokines peuvent être évaluées pour déterminer leur efficacité d’induire la migration dans les cellules récemment définies, telles que le groupe deux cellules lymphoïdes innées, ou ILC2.Un deuxième avantage est que les inhibiteurs ou les thérapies biologiques visant à bloquer certaines voies de chimiokine peuvent être testés par cette méthode avant de faire des expériences plus coûteuses avec des animaux. Commencez par exciser les poumons et la rate des souris mâles et femelles euthanasiées traitées aux ovules à l’aide de deux à trois animaux par groupe. Placer les tissus excisés dans des tubes de dissociation séparés selon le type de tissu et le sexe animal.Placez le tissu pulmonaire dans 500 microlitres de supports de dissociation pulmonaire dans un tube de dissociation, placez le tube dans le dissociateur automatisé des tissus et dissociez-le à l’aide du protocole pulm

assessment-of-lymphocyte-migration-in-an-ex-vivo-transmigration-system

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

La migration des lymphocytes T se produit pendant homing vers les organes lymphoïdes, la sortie de la vascularisation, et entrer dans les tissus périphériques. Ici, nous décrivons un protocole qui peut être utilisé pour analyser la migration lymphocytaire...

Human T isolement des lymphocytes, de la Culture et de l&#39;analyse des migrations In Vitro</em

Ce protocole décrit une méthode pour imager des cellules T fluorescentes introduites dans les tranches de ganglions lymphatiques. La technique permet en temps réel des analyses de la migration des cellules T avec grand champ traditionnel fluorescence ou microscopie confocale.

Ex vivo l&#39;imagerie de cellules T dans murin tranches avec des ganglions lymphatiques et la microscopie confocale Widefield

Cette vidéo présente une étude expérimentale de la transmigration des lymphocytes à travers un modèle d’endothélium de la barrière hémato-encéphalique (BHE). Une monocouche de cellules endothéliales microvasculaires du cerveau humain (HBMEC) est générée in vitro, et des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) contenant des lymphocytes sont ajoutées à la monocouche. Les cellules sont ensuite incubées pour permettre la transmigration des lymphocytes, et les cellules migrées sont...

Étude de la transmigration lymphocytaire à travers une monocouche de cellules endothéliales microvasculaires

Une méthode quantitative pour étudier la migration spontanée des cellules dans un micro-environnement confiné à une dimension est décrite. Ce procédé tire parti de canaux micro-usinés et peut être utilisée pour étudier la migration d'un grand nombre de cellules dans des conditions différentes dans des expériences simples.

Etude de la migration cellulaire dans les canaux microfabriqués

Ici, nous décrivons un modèle humain de barrière hémato-encéphalique permettant d’étudier in vitro la transmigration des lymphocytes dans le système nerveux central.

Analyse des Lymphocytes extravasation L&#39;utilisation d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle de la barrière hématoencéphalique humaine

Protocoles pour une évaluation quantitative de la chimiotaxie des lymphocytes et des migrations sont des outils importants pour la recherche de l’immunologie. Un protocole in vitro est décrit ici, que les permis en temps réel, multiplexés évaluation de la migration cellulaire, ainsi qu’un complémentaire en vivo technique propice suivi de cellules natives de rate.

Quantifier la chimiotaxie Monocyte humain In Vitro et lymphocytes murins traite In Vivo

Ici, nous montrons les méthodes in vivo la quantification d’évacuation de leucocytes de naïve, enflammée et peau murine maligne. Nous effectuons une comparaison entre deux modèles : transdermique FITC application et in situ photoconversion. En outre, nous démontrent l’utilité de photoconversion pour le suivi des sorties de leucocytes de tumeurs cutanées.

Quantification des leucocytes évacuation via les vaisseaux lymphatiques de peau Murine et tumeurs

Cellules (MZBs) de la zone marginale B répondent à la force du flux de cisaillement de réorienter leur voie de migration vers le haut de la circulation. Ce protocole indique comment enregistrer et analyser la migration à l’aide d’un appareil fluidique, pompe, microscope système d’imagerie et des logiciels libres.

Analyse de cisaillement induite par le flux de Migration des cellules B Zone marginale murin In Vitro

Ce protocole fournit une méthode d’isolement primaire des lymphocytes T murins et de microscopie à intervalle de la migration des lymphocytes T dans des conditions environnementales spécifiques avec une analyse quantitative.

Essai de migration in vitro en temps réel pour les lymphocytes T CD8+ murins primaires

Ici, nous décrivons un non-invasive à deux photons approche microscopique (2P) pour l'étude des leucocytes homing dans le coussinet plantaire de la souris. Nous discutons des aspects techniques de notre préparation imagerie des tissus et de marcher le lecteur à travers une expérience typique de la configuration initiale à la collecte de l'exécution et des données.

L&#39;imagerie non invasive des Homing leucocytes et des migrations In vivo</em

Découvrez comment évaluer la migration des lymphocytes in vitro grâce à un système de transmigration ex vivo. Cette méthode permet de quantifier la mobilité cellulaire en réponse aux chimiokines.

Évaluation de la migration des lymphocytes dans un système de transmigration ex vivo

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