Name: Génération dorganoïdes testiculaires porcins avec larchitecture spécifique de Testis utilisant la culture de Microwell (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Découvrez la génération d'organoides testiculaires porcins avec architecture spécifique du testicule en utilisant la culture en micropuits. Cette méthode permet d'étudier la morphogenèse testiculaire et de réaliser des criblages pharmacologiques.

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Ce travail a été soutenu par NIH/NICHD HD091068-01 à la Dre Ina Dobrinski.

REMARQUE : Les testicules des porcelets d'une semaine ont été obtenus à partir d'une ferme porcine commerciale comme sous-produit de la castration de porcs commerciaux. L'approvisionnement en testicules a été approuvé par le Comité des soins aux animaux de l'Université de Calgary.
1. Préparation de solutions enzymatiques pour la digestion des tissus
REMARQUE : Trois solutions enzymatiques différentes sont nécessaires, qui comprennent deux solutions différentes de collagène IV (solution A, B) et une solution de désoxyribonuclease I (DNase I).
<ol><li>Pour préparer la solution A, dissoudre 20 mg de collagène IV S(Tableau des matériaux) et 40 mg de collagène IV W (Tableau des matériaux) dans 25 mL de moyenne d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM). Puis filtrez la stérilisation à l''infiltre de 0,22 m. Ajouter 0,4 ml de sérum bovin fœtal (SF) à la solution A pour inhiber l'activité de la trypsine.</li>
	<li>Pour préparer la solution B, dissoudre 80 mg de collagène IV W (Table of Materials) en 40 ml de DMEM. Puis filtrez la stérilisation à l''infiltre de 0,22 m.</li>
	<li>Pour préparer la solution DNase I (7 mg/mL), dissoudre 70 mg de DNase I dans 10 ml de DMEM. Puis filtrez la stérilisation à l''infiltre de 0,22 m. REMARQUE: La concentration enzymatique pour les solutions de collagène IV décrites ici, varie des concentrations (2 mg/mL) énoncées dans l'articleoriginal 14. Le protocole actuel donne des cellules avec une viabilité légèrement plus élevée. Cependant, les cellules isolées par les deux protocoles produisent des organoïdes avec l'architecture de tissu identique.</li>
</ol>2. Digestion enzymatique de tissu de testis
<ol><li>Recueillir les testicules dans un bécher stérile et laver avec du phosphate tamponné salin (PBS) contenant 1% de pénicilline/streptomycine (P/S). Après le lavage, transférer les testicules dans un plat de culture tissulaire de 100 mm avec PBS contenant 1% P/S et enlever la tunica vaginalis et l'épididyme à l'aide de ciseaux et de forceps autoclaved. Transférer les testicules isolés dans un nouveau plat de 100 mm et laver soigneusement avec du PBS contenant 1 % de P/S.</li>
	<li>Pour maintenir la stérilité, utilisez un autre ensemble de ciseaux et de forceps stériles pour éplucher le parenchyme testiculaire de la tunica albuginea. Couper les testicules le long de l'axe longitudinal directement sous la tunica. Ensuite, épluchez les testicules hors de la tunica à l'aide de deux forceps et placez-les dans un nouveau plat de 100 mm contenant 1 ml de DMEM avec 1% P/S.</li>
	<li>Émincer les testicules pelés avec des ciseaux stériles en morceaux de tissu de 1 à 2 mm. Après le hachage, utilisez des forceps stériles pour enlever les fragments blancs de tissu conjonctif.</li>
	<li>Transférer les morceaux de tissu haché dans la solution A et le garnir jusqu'à 50 ml avec dMEM pour obtenir une concentration de 0,4 mg/mL pour la collagène IV S (Tableau des matériaux) et une concentration de 0,8 mg/mL pour la collagène IV W (Tableau des matériaux). Placez la solution A contenant les morceaux de tissu dans un bain d'eau de 37 oC pendant 30 min, inversez délicatement les tubes toutes les 5 min et vérifiez visuellement la libération d'ADN.<ol>
<li>Ajouter 500 l de DNase I si l'ON observe de l'ADN flottant libre. Après 30 min, centrifuger le tube à 90 x g avec freins à 25 oC pendant 1,5 min et jeter le supernatant. REMARQUE : L'ADN apparaîtrait comme une substance trouble. Lorsque les tubes sont secoués, les morceaux de tissu s'installent alors que l'ADN resterait à flot.</li>
	</ol></li>
	<li>Ajouter la solution B au tube et recharger jusqu'à 50 ml avec DMEM pour obtenir une concentration de 1,2 mg/ml de collagène IV W(tableau des matériaux). Placez le tube dans un bain d'eau de 37 oC pendant 30 min et inversez doucement le tube toutes les 5 min. Ajouter 500 l de DNase I si l'ON observe de l'ADN flottant libre.</li>
	<li>Après 30 min, centrifuger le tube à 90 x g avec freins à 25 oC pendant 1,5 min. Après que jeter le supernatant et laver une fois avec PBS avec 1% P / S. REMARQUE : Les supernatants jetés des deux solutions A et B contiendront principalement des cellules interstitielles.</li>
	<li>Rehaussez le tube avec pbS jusqu'à 50 ml. Recueillir soigneusement les tubules du haut et les placer dans un nouveau tube de 50 ml. REMARQUE : Les gros fragments de tissus non digérés se déposent rapidement au fond, tandis que les tubules séminifères digérés resteront en suspension. Aucun gros fragment de tissu ne doit être recueilli. Cette procédure peut être répétée plusieurs fois jusqu'à ce que la solution dans le tube d'origine soit presque claire et que des fragments de tissu non digérés restent, ce qui peut être éliminé.</li>
	<li>Centrifuger les tubules à 90 x g avec freins à 25 oC pendant 1,5 min et jeter le supernatant. Ajouter à nouveau le PBS frais et la centrifugeuse. Répétez cette étape de lavage deux fois.</li>
	<li>Après le dernier lavage PBS, retirer le supernatant et resuspendre les tubules séminiferous dans 5 ml de PBS. Ajouter ensuite 15 ml d'acide trypsin-éthylèneetélènetetraacetic (EDTA) aux tubules. Placer le tube dans un bain d'eau de 37 oC et inverser délicatement toutes les 2 minutes. Si beaucoup d'ADN flottant est observé, ajoutez 500 l de DNase I avec 5 mL de DMEM.</li>
	<li>Évaluer la digestion enzymatique des tubules en cellules individuelles au microscope (d'abord après 5 min, puis toutes les 2 min). Si la plupart du temps des cellules simples peuvent être détectées, arrêtez la réaction avec 5 ml de FBS et filtrez à travers un maillage de 70 m, puis à travers un maillage de 40 m. REMARQUE : Il faut prendre soin de serrer correctement les bouchons des tubes de 50 ml utilisés pour la digestion (Solution A, B et 0,25 % trypsine-EDTA). Si la contamination dans le bain d'eau est un problème, film de paraffine peut être enroulé autour du bouchon pour assurer la stérilité.</li>
	<li>Centrifuger les cellules individuelles à 500 x g avec des freins à 25 oC pendant 5 min, resuspendre dans le milieu d'enrichissement (Dulbecco Modified Eagle Medium F/12 (DMEM/F12) contenant 5 % de FBS et 1 % de P/S) et compter le nombre de cellules viables. C'est la population de cellules de départ. Fixer 100 x 103 cellules et effectuer l'immunocytochimie pour le marqueur de cellules germinales UCHL1 (Ubiquitin C-Terminal Hydrolase L1) comme décrit12 et de déterminer le pourcentage de cellules germinales dans cette population de cellules de départ. REMARQUE : Le marqueur de cellules germinales Promyelocytic le virus de la leucémie à zinc (PLZF)15 pourrait également être utilisé comme alternative appropriée pour UCHL1. Dans la population de cellules de départ, le rendement cellulaire prévu est d'environ 700-800 x 109/g de tissu. Le pourcentage de cellules germinales dans cette population cellulaire devrait être de 4-5%.</li>
	<li>Placer environ 20 x 106 de cette population de cellules de départ dans deux plats Petri ultra faiblement en attachement 100 mm (10 x 106 cellules suspendues dans 10 ml de DMEM/F12 contenant 1% de P/S dans chaque plat) pendant 2 jours dans un incubateur de culture tissulaire (37 oC , 5% CO2, 21% d'oxygène). Effectuer l'enrichissement des cellules germinales avec les cellules restantes. REMARQUE : Pour assurer la viabilité optimale et la qualité cellulaire, tandis que l'enrichissement des cellules germinales et la quantification subséquente ont lieu, la population de cellules de départ est placée en culture dans des plats de culture de tissus ultra faiblement attachés pendant 2 jours.</li>
</ol>3. L'enrichissement des cellules germinales
REMARQUE : La procédure décrite ci-dessus donne principalement des cellules de Sertoli et des cellules germinales. Différentes propriétés d'adhérence permettent la séparation des cellules de Sertoli et des cellules germinales par placage différentiel.
<ol><li>Graines 20-25 x 106 cellules de la population de cellules de départ par plat de culture tissulaire de 100 mm dans un volume total de 8 ml de milieu d'enrichissement (DMEM/F12 avec 5% FBS et 1% P/S) pour le placage différentiel. Placer les cellules dans un incubateur (37 oC, 5 % CO2, 21 % O2) et après 1,5 h, s'assurer que la majorité des cellules Sertoli se fixent à la plaque.</li>
	<li>Recueillir et combiner le supernatant (contenant principalement des cellules germinales) de 2 plaques à une nouvelle plaque de 100 mm et le remettre dans l'incubateur. Après 1 h, regroupez à nouveau le supernatant de 2 plaques dans une nouvelle plaque de 100 mm. Remettre les assiettes dans l'incubateur pour la nuit. REMARQUE : Les supernatants combinés contiendront principalement des cellules germinales. Les cellules adhérentes qui sont jetées avec les plaques sont principalement des cellules somatiques testiculaires telles que Sertoli et les cellules myoïdes périurtiques.</li>
	<li>Recueillir les cellules germinales enrichies en deux fractions comme suit. REMARQUE : Les cellules germinales enrichies adhèrent différemment, fraction non adhérente et fraction légèrement adhérente. Ces deux fractions forment ensemble la population de cellules germinales enrichies<ol>
<li>Fraction non adhérente : collectez le supernatant.</li>
		<li>Fraction légèrement adhérente : lavez les assiettes doucement avec du PBS, traitez avec 2 ml de dilution de 1:20 de 0,25 % trypsine-EDTA pendant 5 min à température ambiante, arrêtez la réaction avec 2 ml de milieu d'enrichissement et collectez dans le même tube que la fraction non adhérente. REMARQUE: 0,25% Trypsin-EDTA doit être dilué avec PBS pour produire une solution 1:20 trypsin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Compter le nombre total de cellules à l'aide d'un compteur cellulaire, fixer 100 x 103 cellules et effectuer l'immunocytochimie pour le marqueur de cellules germinales UCHL1 comme décrit12 et de déterminer le pourcentage de cellules germinales dans cette population cellulaire enrichie. REMARQUE : Le pourcentage de cellules germinales dans cette population cellulaire devrait être d'au moins 60-70%. Puisque l'immunocytochimie pour la quantification exigerait 1 jour, les cellules enrichies devraient être placées dans un plat de Petri ultra bas d'attachement 100 mm avec DMEM/F12 complété avec 1% P/S pour la durée pour assurer la qualité et la viabilité optimales de cellules.</li>
</ol>4. Préparation des cellules pour l'ensemencement
<ol><li>Pour récolter la préparation de la cellule de départ, recueillir le supernatant dans un tube de 50 ml de la vaisselle ultra faible de 100 mm. Laver les plaques vigoureusement avec du PBS pour recueillir les cellules adhérentes. Aucune digestion enzymatique n'est nécessaire. REMARQUE : Certaines cellules testiculaires, principalement des cellules de Sertoli, peuvent légèrement adhérer aux plaques d'attachement ultra basses.</li>
	<li>Combinez la préparation des cellules de départ et les cellules germinales enrichies pour obtenir une préparation de cellules de travail contenant 25 % de cellules germinales. Centrifugeuse à 500 x g avec freins à 25 oC pendant 5 min, jetez le supernatant et resuspendez les cellules dans le milieu de formation organoïde (DMEM/F12 complété par de l'insuline 10 g/mL, transferin 5,5 g/mL, sélénium 6,7 ng/mL, 20 ng/mL de croissance du facteur épidermique , 1 % P/S). Ajuster la densité cellulaire à 2,4 x 106 par ml. REMARQUE : Chaque puits dans les plaques de micropuits utilisés13 dans ce protocole contenait 1 200 micropuits.</li>
	<li>Utilisez la formule ci-dessous pour calculer le nombre de cellules par puits comme décrit ci-dessous. Nombre de cellules par puits - nombre de micropuits x nombre de cellules à regrouper pour chaque organoïde.</li>
	<li>Pour générer des organoïdes à partir de 1 000 cellules chacune, ensemencez chacune avec (1 200 x 1 000 cellules chacune) 1,2 x 106 cellules. Ajuster la densité cellulaire dans la suspension cellulaire de manière à ce que les cellules soient ensemies dans un volume de 0,5 ml de milieu. Pour les organoïdes formés à partir de 1 000 cellules chacune, utilisez une densité de 2,4 x 106 cellules par mL (1,2 x 106 cellules en 0,5 ml).</li>
</ol>5. Préparation des micropuits pour recevoir les cellules
REMARQUE : Pour s'assurer que les cellules n'adhèrent pas à la surface du micropuits, traitez-les avec une solution de rinçant de surfactant qui est disponible à l'achat par le fabricant.
<ol><li>Ajouter 0,5 ml de solution de rinçant à chaque puits. Assurez-vous qu'aucune bulle d'air n'est emprisonnée dans le puits. Pour enlever les bulles d'air, le cas échéant, centrifuger la plaque à 2 000 x g avec freins à 25 oC pendant 2 min.</li>
	<li>Observez la plaque sous un microscope inversé à faible grossissement, pour vérifier que les bulles ont été retirées des micropuits. Si l'on observe des bulles piégées, la centrifugeuse à nouveau à 2 000 x g avec des freins à 25 oC pendant 2 min pour enlever les bulles restantes.</li>
	<li>Couvrir la plaque avec le couvercle et couver pendant 30 min à température ambiante. Une fois le traitement terminé, retirer la solution de rinçant et laver immédiatement la plaque avec de l'eau stérile ou du PBS. Assurez-vous que la plaque ne se dessèche pas après le traitement avec la solution de rinçant.</li>
</ol>6. Génération d'organoïdes testiculaires
<ol><li>Ajouter 0,5 ml de milieu de formation d'organoïdes (sans cellules) à chaque puits et centrifugeuse à 2 000 x g avec freins à 25 oC pendant 2 min pour éliminer les bulles d'air emprisonnées. Observez le puits sous un microscope inversé à faible grossissement pour vérifier que les bulles d'air ont été enlevées. Si l'on observe des bulles piégées, la centrifugeuse à nouveau à 2 000 x g avec des freins à 25 oC pendant 2 min pour enlever les bulles restantes.</li>
	<li>Ajouter 0,5 ml de suspension de la cellule de travail et mélanger délicatement en pipetting de haut en bas. Centrifugeuse à 500 x g avec freins à 25 oC pendant 5 min. Utilisez un microscope inversé pour vérifier que les cellules se sont regroupées dans les micropuits.</li>
	<li>Transférer la plaque dans un incubateur de culture cellulaire et la culture pendant 5 jours. Changer la moitié du support tous les deux jours.<ol>
<li>Pour changer de milieu sans perdre d'organoïdes, touchez la pointe de la pipette à la paroi du puits et baissez doucement pour toucher le ménisque et dessinez lentement le milieu. Assurez-vous de suivre le ménisque au fur et à mesure qu'il tombe. Pour ajouter le milieu frais, touchez la pointe de pipette au mur du puits sur le même côté que le retrait moyen et ajoutez le milieu frais doucement contre le mur de puits, lui permettant de couler lentement en bas du mur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour récupérer les organoïdes, pipette doucement le milieu de haut en bas à l'aide d'une pipette à large bouche. Cela permettrait aux organoïdes de sortir des micropuits.</li>
	<li>Recueillir les organoïdes, laver avec du PBS, fixer et effectuer l'immunocytochimie pour le marqueur de cellules germinales (UCH-L1), marqueur cellulaire Sertoli (GATA Binding Protein 4-GATA4), marqueur de cellules myoïdes périubulaires (Actin-SMA muscle lisse) et marqueur cellulaire Leydig (Cytochrome P450-CYP450) comme décrit12 et visualiser sous un microscope confocal.</li>
</ol>

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<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li>
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</ol>

M. Ungrin a un intérêt financier dans la technologie AggreWell en tant qu'inventeur.

Nous avons établi une méthode simple qui permet la génération cohérente et reproductible d'un grand nombre d'organoïdes testiculaires avec l'architecture de tissu qui est semblable au testicule in vivo12. Bien que l'approche ait été développée à l'aide de cellules de testicules porcines, elle s'applique plus largement aussi aux testicules de souris, de primates non humains et de testicules humains12. Un certain nombre de méthodes différentes ont été rapportées pour produire...

Ces dernières années, il y a eu un regain d'intérêt pour les organoïdes tridimensionnels (3D). Différents organes tels que l'intestin1, estomac2, pancréas3,4, foie5, et le cerveau6 ont été avec succès dérivés dans les systèmes organoïdes 3D. Ces organoïdes ont des similitudes architecturales et fonctionnelles avec les organes in vivo et sont plus biologiquement pertinents pour l'étude du microenvironnement tissulaire que les systèmes de culture monocouches7. En conséquence, organoïdes testiculaires ont commencé à susciter l'intérêt ainsi8,9,10,11,12. La majorité des méthodes signalées jusqu'à présent sont complexes, sans haut débit10 et nécessitent l'ajout de protéines ECM8,10. Cette complexité entraîne également des problèmes de reproductibilité. Une méthode simple et reproductible est nécessaire qui permet la génération d'organoïdes testiculaires avec des cellules-associations qui sont comme le testicule in vivo.
Nous avons récemment signalé un système pour répondre à ces exigences12. En utilisant le porc comme modèle, nous avons utilisé une approche centrifuge d'agrégation forcée dans le système de micropuits. Dans le système de micropuits, chaque puits contient un grand nombre de micropuits identiques plus petits13. Cela permet la génération de nombreux sphéroïdes de taille uniforme. Le système de micropuits a permis la génération d'un grand nombre d'organoïdes uniformes avec une architecture spécifique aux testis. Le système est simple et ne nécessite pas l'ajout de protéines ECM.

<table><tbody><tr><td>Boîte de culture tissulaire à très faible fixation de 100 mm</td><td>Corning</td><td>#CLS3262</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture tissulaire de 100 mm</td><td>Corning</td><td>#353803</td><td></td></tr><tr><td>Aggrwell 400</td><td>Stemcell Technologies</td><td>#34411</td><td></td></tr><tr><td>Solution de rinçage anti-adhérence</td><td>Stemcell Technologies</td><td>#07010</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de type IV de Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C5138</td><td>appelée Collagénase IV S</td></tr><tr><td>Collagénase de type IV Worthington</td><td>Worthington-Biochem</td><td>#LS004189</td><td>appelée Collagénase IV W</td></tr><tr><td>Désoxyribonucléase I du pancréas bovin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#DN25</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aigle modifié' s Medium/F12</td><td>Gibco</td><td>#11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aigle modifié' s Glycémie moyenne à élevée</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#D6429</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphate salin tamponné</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#D8537</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance épidermique</td><td>R& D Systems</td><td>#236-EG</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainers 70 & micro ; m</td><td>FisherScientific</td><td>#352350</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainers 40 & micro ; m</td><td>FisherScientific</td><td>#352340</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Insuline-Transferrine-Sélénium</td><td>Gibco</td><td>#41400-045</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P4333</td><td></td></tr><tr><td>Tissu testiculaire porcin</td><td>Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GP Unité de filtration supérieure à tube de centrifugation stérile</td><td>Millipore</td><td>#SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>trypsine-EDTA</td><td>sigma</td><td>#T4049</td><td></td></tr></tbody></table>

génération d'organoïdes testiculaires porcins avec l'architecture spécifique de testis utilisant la culture de microwell

Generation of Porcine Testicular Organoids with Testis Specific Architecture using Microwell Culture

Les organoïdes sont des structures tridimensionnelles composées de plusieurs types de cellules qui sont capables de récapituler l'architecture tissulaire et les fonctions des organes in vivo. La formation d'organoïdes a ouvert différentes voies de recherche fondamentale et translationnelle. Ces dernières années, les organoïdes testiculaires ont suscité l'intérêt dans le domaine de la biologie de la reproduction masculine. Les organoïdes testiculaires permettent l'étude des interactions cellules-cellules, du développement des tissus et du microenvironnement de niche des cellules germinales et facilitent le dépistage des médicaments à haut débit et de la toxicité. Une méthode est nécessaire pour générer de façon fiable et reproductible des organoïdes testiculaires avec l'architecture spécifique de tissu de testicule. Le système de culture des micropuits contient un réseau dense de micropuits en forme de pyramide. Les cellules testiculaires dérivées des testicules pré-puberté sont centrifugeuses dans ces micropuits et cultivées pour produire des organoïdes testiculaires avec l'architecture de tissu testis-spécifique et les associations cellulaires. Des milliers d'organoïdes homogènes peuvent être générés par ce processus. Le protocole rapporté ici sera d'un grand intérêt pour les chercheurs qui étudient la reproduction masculine.

Cellules isolées de testicules porcins d'une semaine qui ont été cultivés dans les micropuits auto-organisés en sphéroïdes (Figure 1A, Figure 2), avec un extérieur délimité et distinct (épithélium séminifère) et des compartiments intérieurs ( interstitium) (Figure 1B, Figure 2). Les deux compartiments ont été séparés par une membrane de ...

Ici, nous présentons un protocole pour la génération reproductible des organoïdes testiculaires porcins avec l'architecture spécifique de tissu de testicule utilisant le système commercial disponible de culture de microwell.

Génération d'organoïdes testiculaires porcins avec l'architecture spécifique de Testis utilisant la culture de Microwell

Organoids are three dimensional structures composed of multiple cell types that are capable of recapitulating tissue architecture and functions of organs ...

Ce protocole est significatif parce qu’il permet la génération d’organoïdes testicules, qui peuvent être utilisés comme une plate-forme pour étudier la morphogenèse des testicules et pour les dépistages de médicaments tropo élevés et de toxicité. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est hautement reproductible, nécessite un nombre relativement faible de cellules et peut être utilisée pour générer un grand nombre d’organoïdes testiculaires avec une architecture spécifique aux testicules. Cette méthode peut être appliquée pour étudier d’autres systèmes, tels que les cellules souches pluripotentes ou les cellules des îlots pancréatiques avec les optimisations nécessaires.Anna Voigt, doctorante de mon laboratoire, démontrera la procédure de digestion enzymatique des tissus testiculaires. Recueillir les testicules dans un bécher stérile et laver avec PBS contenant 1% de streptomycine de pénicilline. Après lavage transférer le testicilline à un plat de culture de tissu de 100 millimètres avec PBS contenant 1% de streptomycine de pénicilline.Utilisez des ciseaux et des forceps autoclavés pour enlever le tunica vaginalis et l’épididyme. Transférer les testicules isolés dans un nouveau plat de 100 millimètres et bien laver avec du PBS contenant 1% de streptomycine de pénicilline. Couper les testicules le long de l’axe longitudinal directement sous la tunica.Peler ensuite les testicules de la tunica à l’aide de deux forceps et les placer dans un nouveau plat de 100 millimètres contenant 1 millilitre de DMEM avec 1% de streptomycine de pénicilline. Hacher les testicules pelés avec des ciseaux stériles en morceaux de tissu d’un à deux millimètres. Après hacher utiliser des forceps stériles pour enlever les fragments blancs de tissu conjonctif.Transférer les morceaux de tissu hachés dans la solution A dans un tube de 50 millilitres et le recharger jusqu’à 50 millilitres avec DMEM pour obtenir une concentration de 0,4 milligramme par millilitre pour la colagénase 4S et une concentration de 0,8 milligramme par millilitre pour colagenase 4W. Placez le tube contenant les morceaux de tissu dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Inverser doucement le tube toutes les cinq minutes.Après 30 minutes, centrifuger le tube à 90 fois G avec des pauses à 25 degrés Celsius pendant 1,5 minutes. Jetez le supernatant, annoncez 40 millilitres de solution B, et rechargez jusqu’à 50 millilitres avec DMEM pour obtenir une concentration de 1,2 milligramme par millilitre de colagenase 4W. Placez le tube dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 30 minutes et inversez doucement le tube toutes les cinq minutes.Centrifuger le tube à 90 fois G avec des pauses à 25 degrés Celsius pendant 1,5 minutes. Après cela jeter le supernatant, et laver une fois avec PBS avec 1% streptocotomycine pénicilline. Recueillir soigneusement les tubules par le haut et les placer dans un nouveau tube de 50 millilitres.Recharger le tube avec PBS jusqu’à 50 millilitres. Centrifuger les tubules à 90 fois G avec des pauses à 25 degrés Celsius pendant 1,5 minutes. Jetez le supernatant et ajoutez du PBS frais pour le laver deux fois de plus.Après le dernier lavage PBS enlever le supernatant et re-suspendre les tubules séminifères en cinq millilitres de PBS. Ensuite, ajouter 15 millilitres de 0,25%Trypsin EDTA aux tubules. Placez le tube dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius et inversez doucement toutes les deux minutes.Après cinq minutes évaluer la digestion enzymatique des tubules à des cellules simples sous le microscope avec 10 microlitres d’échantillon sur une plaque de culture tissulaire. Toutes les deux minutes, placez l’échantillon sous le microscope pour l’observer. Si la plupart des cellules simples peuvent être détectées arrêter la réaction avec cinq millilitres de FBS et filtrer à travers un maillage de 70 microns, puis à travers un maillage de 40 microns.Centrifuger les cellules individuelles à 500 fois G avec des pauses à 25 degrés Celsius pendant cinq minutes. Re-suspendre en 50 millilitres de milieu d’enrichissement, et compter le nombre de cellules viables à l’aide d’un hémomètre. Transférer 20 millions de cette population de cellules de départ dans chacune des deux boîtes de Pétri ultra-faibles de 100 millimètres et incuber dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone et 21 % d’oxygène pendant deux jours.Céder 20 à 25 millions de cellules de la population restante de cellules de départ par plat de culture tissulaire de 100 millimètres dans un volume total de huit millilitres de milieu d’enrichissement. Placez le plat dans un incubateur et après 1h30 assurez-vous que la majorité des cellules sertoli sont fixées à l’assiette. Inclinez légèrement deux plaques pour recueillir et combiner les supernatants dans une nouvelle plaque de 100 millimètres et placez-la de nouveau dans l’incubateur.Après une heure, mélanger à nouveau les supernatants de deux plaques à une nouvelle plaque de 100 millimètres. Remettre les assiettes dans l’incubateur toute la nuit. Puis recueillir les cellules germinales enrichies en deux fractions, fraction non adhérente et fraction légèrement adhérente.Recueillir le supernatant comme la fraction non adhérente. Pour la fraction légèrement adhérente laver les assiettes doucement avec PBS et traiter avec deux millilitres d’une dilution d’un à 20 de 0,25%Trypsin EDTA pendant cinq minutes à température ambiante. Arrêter la réaction en ajoutant deux millilitres de milieu d’enrichissement et de recueillir dans le tube fraction non adhérent.Combinez la préparation des cellules de départ et les cellules germinales enrichies dans un tube pour obtenir une préparation cellulaire de travail contenant 25% de cellules germinales. Centrifugeuse à 500 fois G avec des pauses à 25 degrés Celsius pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et suspendez les cellules en 20 millilitres de milieu de formation organoïde pour atteindre une concentration de 2,4 millions de cellules par millilitre.Dans un nouveau tube ajouter un millilitre de la solution contenant des cellules. Ajouter 0,5 millilitres de solution de rinçage surfactant à chaque puits dans une plaque de micro puits. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est emprisonnée dans le puits.Pour enlever les bulles d’air centrifuger la plaque à 2000 fois G avec des pauses à 25 degrés Celsius pendant deux minutes. Observez la plaque sous un microscope inversé à faible grossissement pour vérifier que les bulles ont été retirées des micro puits. Couvrir la plaque d’un couvercle et incuber pendant 30 minutes à température ambiante.Une fois le traitement terminé, retirez la solution de rinçage et lavez immédiatement la plaque avec de l’eau stérile ou du PBS. Ajouter 0,5 millilitres de milieu de formation organoïde à chaque puits et centrifugeuse à 2000 fois G avec des pauses à 25 degrés Celsius pendant deux minutes pour éliminer les bulles d’air emprisonnées. Observez le puits sous un microscope inversé à faible grossissement pour vérifier que les bulles d’air ont été enlevées.Ajouter 0,5 millilitres de la suspension de la cellule de travail et mélanger délicatement en pipetting de haut en bas. Centrifugeuse à 500 fois G avec des pauses à 25 degrés Celsius pendant cinq minutes. Utilisez un microscope inversé pour vérifier que les cellules se sont regroupées dans les micro puits.Transférer la plaque dans un incubateur de culture cellulaire et la culture pendant cinq jours. Changez la moitié du milieu tous les deux jours. Pour récupérer les organoïdes, utilisez une pipette à large bouche pour pipette doucement le milieu de haut en bas.Cela permet aux organoïdes de sortir des micro puits. Recueillir les organoïdes, fixer et effectuer la cytochimie immuno pour marqueur de cellules germinales, marqueur cellulaire Sertoli, marqueur cellulaire myoïde péritubulaire et marqueur cellulaire Leydig et visualiser sous un microscope confocal. Dans cette étude, les cellules isolées des testicules porcins d’une semaine qui ont été cultivés dans des micro puits auto-organisés en sphéroïdes avec des compartiments extérieurs et intérieurs délimités et distincts.Les deux compartiments ont été séparés par une membrane positive de sous-sol de collagène IV. Les cellules sertoli positives GATA4 et les cellules germinales positives UCHL1 se trouvaient dans le compartiment extérieur de la membrane du sous-sol. Les cellules myoïdes péri tubulaires positives d’aSMA ont été localisées le long de l’intérieur de la membrane de sous-sol tandis que les cellules positives de Leydig de CYP450 étaient au centre de l’interstitium.Cette structure est similaire aux conditions in situ, où les cellules Leydig, cellules myoïdes péri-tubulaires, sont situées dans l’interstitium, dans le compartiment interstitiel et les cellules germinales, les cellules sertoli sont situées à l’épithélium séminifère. Il est important de s’assurer que les cellules utilisées pour générer des organoïdes ont une qualité optimale. Une attention particulière doit être accordée pendant le stade de trypsinisation de la digestion enzymatique.Après cette procédure, les organoïdes peuvent être cultivés à long terme pour étudier la différenciation des cellules germinales ou analyser l’expression des gènes et les protéines ou hormones sécrétées. La capacité de créer des organoïdes avec des associations cellulaires spécifiques aux testicules fournit un nouveau système in vitro pour étudier les interactions cellule-cellule importantes pour le développement des testicules et la fonction des cellules germinales.

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