Mesure de la phagocytose d'Aspergillus fumigatus Conidia par des leucocytes humains à l'aide de la cytométrie du flux

Ce protocole fournit une méthode rapide et fiable pour mesurer quantitativement la phagocytose d'Aspergillus fumigatus conidia par les phagocytes primaires humains utilisant la cytométrie de flux et pour discriminer la phagocytose des conidies de la simple adhérence aux leucocytes.

Ce protocole est significatif parce qu’il mesure quantitativement la phagocytose des fumigateurs d’Aspergillus étiquetés Conidia par les leucocytes humains, avec l’attachement de Conidia aux cellules, et le manque d’interaction par cytométrie de flux. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle facilite l’analyse rapide d’un grand nombre de cellules. De plus, l’étiquetage des marqueurs cellulaires permet d’évaluer séparément les neutrophiles et les monocytes dans le même échantillon.

Dans n’importe quelle technique peut être utilisé pour analyser d’autres champignons cliniques pertinents comme Mucorales. Au lieu de cela, les globules rouges pourraient être utilisés comme phagocytes. Pour commencer cette procédure, mouiller une serviette en papier avec désinfectant, et le placer dans une armoire de biosécurité.

Déposer une assiette d’Aspergillus fumigatus cultivé sur le dessus de l’essuie-tout pour éviter la surdissuration de Conidia volatile. Ajouter 10 millilitres de PBS contenant 0,01% de détergent sur le dessus du champignon, et utiliser une spatule Drigalski pour étendre le liquide sur la plaque, et déteindre sur la conidia de couleur foncée. Transférer la suspension Conidia à 50 millilitres à l’aide d’une passoire de 30 micromètres, ce qui éliminera tout mycélie résiduelle.

Ajouter 10 millilitres de PBS avec du détergent à la plaque, l’étendre à l’aide d’une spatule et le transférer dans le même tube à travers la passoire. Ensuite, préparez une solution stérile de carbonate de sodium molaire de 0,1 molaire, dissoute dans PBS. Et préparer une solution de 0,1 millimolaire de poudre FITC, dans cette solution de carbonate de sodium.

Suspendre à nouveau 100 millions ou moins de Conidia, en cinq millilitres de cette solution FITC, dans un tube de 15 millilitres. Incuber dans un rotateur à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Pour gonfler à Conidia, résuspendez le FITC étiqueté Conidia en cinq millilitres de milieu RPMI, complété par 10% FCS.

Et incuber dans un rotateur à 37 degrés Celsius pour le temps désiré. Dans une armoire de biosécurité, placer cinq millilitres de pelage bouffi dans un tube de 50 millilitres. Remplissez le tube avec tampon EL, et inverser trois fois.

Incuber horizontalement pendant cinq à huit minutes, jusqu’à ce que l’apparence laiteuse du mélange se dégage. Puis, centrifugeuse à 300 fois G, et à température ambiante pendant 10 minutes. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille en un millilitre de tampon EL par pipetting.

Ajouter 24 millilitres de tampon EL et inverser le tube plusieurs fois. Centrifugeuse à 300 fois G et à température ambiante pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et resuspendez les cellules en un millilitre de rpmi media, complété par 10%FCS.

Pour commencer, transférer deux millions de leucocytes et quatre millions de Conidia étiquetés FITC dans 1,5 millilitres de RPMI complétés par 10% FCS, à une plaque de culture de 12 puits. Inclure un contrôle des cellules seulement sans Conidia, et un contrôle des cellules avec Conidia non étiquetés. Incuber la plaque dans un incubateur humidifié de dioxyde de carbone, à 37 degrés Celsius pour la quantité désirée de temps.

Lorsque l’incubation est terminée, utilisez un grattoir cellulaire pour récolter les cellules et transférez-les dans un tube de 15 millilitres. Tout d’abord, mettre 100 microlitres de chaque échantillon et les contrôles dans un puits d’une plaque v-fond de 96 puits. Ajouter 150 microlitres de PBS contenant deux millimolaires d’EDTA pour le lavage.

Pour la compensation de couleur, placez un million de cellules sans Conidia pour chaque couleur, dans d’autres puits de la plaque. Inclure un puits de cellules qui ne seront pas tendues. Ajouter 150 microlitres de PBS contenant deux millimolaires d’EDTA à chaque puits pour le lavage.

Ensuite, couvrir la plaque d’une feuille d’adhésif et d’une centrifugeuse à 300 fois G et à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, retirez le papier d’aluminium et jetez le surnatant en inversant rapidement et avec force la plaque une seule fois sur l’évier, ou une serviette en papier jetable. Resuspendez les cellules en 100 microlitres de mélange d’anticorps, et mélangez bien par pipetting.

Pour les compensations de couleur, résuspendez les cellules respectives dans 100 microlitres de PBS contenant deux millimolaires d’EDTA, et ajoutez un seul type d’anticorps à chaque puits, à la même quantité utilisée dans le mélange d’anticorps. Couvrir d’une feuille d’adhésif et incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 20 minutes. Après cela, retirer le papier d’aluminium et ajouter 150 microlitres de PBS contenant deux millimolaires d’EDTA à chaque puits pour le lavage.

Couvrir à nouveau la plaque de papier adhésif. Centrifugeuse à 300 fois G et à température ambiante pendant cinq minutes. Retirez ensuite le papier d’aluminium et jetez le surnatant en inversant rapidement et avec force la plaque sur un évier ou une serviette en papier jetable.

Resuspendez les cellules en 200 microlitres de PBS contenant 2 millimolar EDTA, et transférez la suspension cellulaire de chaque puits, dans un tube inférieur rond séparé. Démarrez le cytomètre d’écoulement et laissez-le se réchauffer. Dans le logiciel d’acquisition, créer une nouvelle expérience, et mettre en place et étiqueter les nouveaux échantillons.

Configurer les paramètres et les détecteurs pour les fluorophores appropriés, tels que décrits dans le protocole texte. Dans ce logiciel, affichez les tracés de points appropriés tels qu’ils sont décrits dans le protocole texte. En utilisant les cellules seulement échantillon, acquérir certaines cellules et définir la porte autour des leucocytes.

Basé sur la porte du leucocyte, porte pour les cellules positives CD45, pour se séparer de Conidia dans la parcelle CD45 SSC. Dans une parcelle à points, CD14, CD66b, neutrophiles de porte et monocytes séparément. Après cela, passer de l’échantillon des cellules seulement, à Conidia non étiqueté.

Dans une parcelle à points, anti-FITC, APC FITC, affichez des neutrophiles dans des quadrants définis pour les signaux anti-FITC et FITC. Ouvrez la vue statistique et ajustez les quadrants, permettant un maximum de 1% de cellules dans les quadrants Q1, Q2 et Q4. Répétez ce processus pour la porte monocyte. Dans la porte des leucocytes, enregistrez tous les échantillons avec au moins 20 000 événements.

La phagocytose de Conidia étiquetée FITC par les neutrophiles humains peut être lue à partir des points de vue statistiques. Dans cette étude, une méthode cytométrique à débit rapide est utilisée pour mesurer l’interaction d’Aspergillus fumigateurs Conidia avec un grand nombre de leucocytes humains primaires. En utilisant les anticorps appropriés et la stratégie de gating montrée ici, un gating général des leucocytes humains par des caractéristiques de FSC et de SSC, est suivi d’une séparation des leucocytes dans conidia libre, par le marqueur de leukocyte de casserole, CD45.

Conidia peut atteindre presque la taille des cellules au moment de la cytométrie du flux, en particulier lors de l’utilisation de Conidia gonflé, et ou de longs temps d’incubation, et peut donc nous acheter l’analyse. Puisque les monocytes primaires et les neutrophiles humains prennent Conidia différemment, ce protocole permet l’analyse séparée de ces populations cellulaires basée, sur la coloration avec les marqueurs de lignée cellulaire bien établis, CD14 pour les monocytes, et CD66b pour les neutrophiles. Le pourcentage de phagocytes primaires humains intériorisant Conidia peut être très variable chez les donneurs de sang, mais dépend également de facteurs expérimentaux, tels que le temps d’incubation et l’état de gonflement de Conidia.

L’internalisation des spores peut être détectée après 0,5 heure de co-incubation, et augmente avec le temps. Les conidies pré-gonflées sont prises plus facilement que les spores au repos, même à de courtes périodes d’incubation. Si conidia sont fixés avec du formaldéhyde, la phagocytose est diminuée par rapport à conidia indigène.

Suite à cette procédure, les supernatants des cellules immunitaires co-incubées et conidia peuvent être recueillis et analysés par Eliza pour vérifier si l’interaction provoque une libération de cytokine par les cellules immunitaires. N’oubliez pas que le sang humain peut potentiellement transmettre des maladies infectieuses. Ce travail exige la vaccination contre l’hépatite B, l’utilisation d’un cabinet de biosécurité, ainsi que le port de gants à un manteau de laboratoire.