Isolement et expansion des cellules T tueuses cytotoxiques induites par Cytokine pour le traitement du cancer

Ici, nous présentons un protocole pour exécuter l'isolement et l'expansion des cellules mononucléaires périphériques mononucléaires CD3^-CD56^- cellules tueuses et pour illustrer leur effet de cytotoxicité contre les cellules cancéreuses hématologiques et solides en utilisant un système de cytométrie de flux de diagnostic in vitro.

Nous avons optimisé une méthode hautement qualifiée et cliniquement applicable pour l’expansion des lymphocytes T tueurs cytokine-induits par PBMC-dérivés et pour l’évaluation de leur cytotoxicité contre des cancers. L’avantage de cette technique est de fournir une procédure d’exploitation standard pour les techniciens et les cliniciens afin de quantifier la puissance des cellules tueuses induites par la cytokine dans la recherche scientifique et l’évaluation clinique. Commencez cette procédure par une préparation des cellules CIK telle que décrite dans le protocole de texte, puis lavez les cellules CIK avec 10 millilitres de PBS stérile.

Centrifugeuse pendant 10 minutes à 300 fois G et 18 à 20 degrés Celsius. Aspirer le supernatant et résusquer les cellules avec cinq millilitres de PBS. Comptez les numéros de cellule et testez la viabilité des cellules à l’aide de l’analyse d’exclusion bleue trypan.

Aliquot les cellules CIK en six tubes de stérilisation de 1,5 millilitre à une densité d’environ 5 à un million de cellules par millilitre de PBS. Étiquetez et traitez les cellules comme détaillées dans le protocole textuel. Mélanger délicatement les cellules CIK avec les anticorps en pipetting doucement de haut en bas au moins trois fois avec une pipette de stérilisation d’un millilitre.

Incuber les cellules pendant 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Centrifuger les tubes pendant 10 minutes à 300 fois G et 18 à 20 degrés Celsius. Après centrifugation, aspirer le supernatant et résusquer la pastille cellulaire avec un millilitre de PBS, puis pipette doucement les cellules de haut en bas au moins trois fois avec une pipette stérile d’un millilitre.

Transférer la suspension cellulaire dans un tube de fond rond stérile de cinq millilitres en polystyrène avec un bouchon de passoire cellulaire en traversant doucement le bouchon, puis placez les tubes sur le carrousel dans l’ordre. Ouvrez le logiciel d’analyse de cytométrie de flux et créez un dossier expérimental, puis cliquez sur le nouveau bouton spécimen pour ajouter un spécimen et un tube à l’expérience. Nommez les tubes comme indiqués dans le protocole texte.

Pour créer un système de diffusion pour les populations de cellules CIK, sélectionnez d’abord le tube un et cliquez sur le bouton de diagramme de point pour créer une parcelle FSCA SSCA. Dessinez une porte rectangle sur toute la population cellulaire avec un seuil FSCA supérieur à 5000 pour exclure les débris cellulaires. Sélectionnez le paramètre FSCA FSCH pour la nouvelle parcelle à points et dessinez une porte polygone autour de toutes les cellules individuelles.

Sélectionnez le compte par rapport au CD3 conjugué fitc et comptez par rapport au paramètre CD56 conjugué par APC pour la nouvelle parcelle d’histogramme. Sélectionnez le paramètre CD56 conjugué fitc par rapport au CD56 conjugué à l’APC pour la nouvelle parcelle à points et dessinez une porte de quatre quadrants pour définir les quatre sous-populations. Enregistrez les données de 20 000 cellules individuelles dans chaque spécimen.

Cliquez d’abord sur le bouton de l’échantillon de charge pour analyser l’échantillon de contrôle vierge. Identifiez l’ensemble de la population de cellules CIK en utilisant les paramètres du canal CD56 et CD3. Ouvrez les fichiers contenant les valeurs statistiques du spécimen individuel pour analyser les populations de cellules CIK et les réimprimer dans des fichiers d’analyse.

Pour effectuer l’analyse cytotoxique, la coculture CIK et la leucémie myéloïde chronique humaine K562 cellules en ajoutant un millilitre de cellules K562 à chaque puits dans une plaque de six puits à une densité de 5 millions de cellules par millilitre, puis ajouter un millilitre de milieu basal avec ou sans cellules CIK à la plaque de six puits comme indiqué dans le protocole texte. Mélangez les suspensions cellulaires en faisant monter et descendre doucement au moins trois fois. Placer la plaque dans l’incubateur pendant 24 heures.

Maintenant, coculture CIK et ovariens OC-3 cellules en ajoutant un millilitre de milieu basal avec ou sans cellules CIK à la plaque de six puits comme indiqué dans le protocole de texte. Mélangez les suspensions cellulaires en faisant monter et descendre doucement au moins trois fois. Mettre la plaque dans l’incubateur pendant 24 heures.

Après incubation, récolter la suspension cellulaire CIK K562 directement dans un tube stérile de 15 millilitres. Pour récolter les cellules de suspension et d’adhérence des groupes CIK OC-3, transférez d’abord la suspension cellulaire dans un tube stérile de 15 millilitres. Lavez le puits avec un millilitre de Stéril PBS, recueillir le PBS, et l’ajouter au tube, puis ajouter 5 millilitres de solution enzymatique de dissociation cellulaire et incuber pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius.

Ajouter un millilitre de la solution du même tube au puits correspondant, et mélanger délicatement les cellules en pipetting de haut en bas au moins trois fois avec une pipette stérile d’un millilitre. Recueillir toutes les cellules dans le même tube. Centrifugeuse à 300 fois G pendant 10 minutes.

Aspirer le supernatant et resuspendre les cellules en un millilitre de PBS stérile. Pelleter les cellules à 300 fois G pendant 10 minutes, puis aspirer le supernatant et resuspendre les cellules en 100 microlitres de PBS stérile. Ajouter cinq microlitres de colorant 7-AAD à la suspension cellulaire.

Mélanger délicatement les cellules en pipetant de haut en bas au moins trois fois avec une pipette stérile d’un millilitre. Incuber pendant 10 minutes et laisser dans l’obscurité avant l’analyse. Pour effectuer l’analyse de la capacité cytolytique, mélanger la suspension cellulaire et répéter la préparation pour la cytométrie d’écoulement.

Cliquez sur le nouveau bouton spécimen pour ajouter un spécimen et un tube à l’expérience. Nommez les tubes comme indiqués dans le protocole texte. Pour créer un système de diffusion pour l’analyse cytolytique, sélectionnez d’abord le tube un et cliquez sur le bouton de diagramme de point pour créer une parcelle FSCA SSCA.

Dessinez une porte rectangle sur tous les événements avec un seuil FSCA supérieur à 50 000 pour exclure les débris cellulaires. Sélectionnez le paramètre SSCA CFSE pour la nouvelle parcelle à points, puis sélectionnez le paramètre CFSE 7-AAD pour la nouvelle parcelle à points et dessinez une porte de quatre quadrants pour définir les quatre sous-populations. Cliquez d’abord sur le bouton de l’échantillon de charge pour analyser l’échantillon de contrôle vierge.

Réglez la tension de SSCA et FSCA. Identifiez la population de cellules mortes en utilisant les paramètres du canal CFSE et 7-AAD. Enregistrez les données de plus de 20 000 cellules positives cfse dans chaque spécimen.

Ouvrez les fichiers contenant les valeurs statistiques de chaque spécimen individuel pour analyser les populations de cellules non viables et exporter les données dans des fichiers d’analyse. Les résultats représentatifs de la stratégie de gating pour analyser la sous-population de CD-3 positifs CD56 t-cells de donneurs sains sont montrés avec l’analyse statistique de la proportion de CIK de trois individus. La proportion positive de cellules CD56 CD-3 a augmenté de façon significative après 14 jours d’expansion.

Cela est évident à travers les 65% pour le PBMC d’origine qui a augmenté à 27,4% pour les cellules CIK récoltées le jour 14. Dans ce système de culture, les cellules CIK ont produit environ une demi-centaine de changements par rapport au nombre original de PBMCs. Les cellules K562 ont été tachées d’un colorant non fluorescent CFSE, qui est fendu par des estérases intracellulaires dans les cellules viables et devient un colorant très fluorescent.

La taille et la granularité des cellules CIK et CFSE-positives sont illustrées. Les cellules K562 tachées de CFSE ont été co-traitées avec des cellules de CIK à un rapport de zéro à un, cinq pour un, et 10 à un. Ces cellules ont été souillées avec le colorant de 7-AAD comme sonde de viabilité pour l’exclusion de cellules mortes.

Les cellules positives 7-AAD des cellules K562 positives de CFSE ont toutes été évaluées. Les cellules OC-3 tachées de CFSE ont été co-traitées avec des cellules de CIK à un rapport de 10 pour un. La cytotoxicité évidente du CIK contre les cellules OC-3 est démontrée ici après 24 heures d’incubation.

On a signalé que les lymphocytes T CIK exercent des effets cytotoxiques importants contre les cellules cancéreuses et réduisent les effets néfastes de la chirurgie, de la radiothérapie et de la chimiothérapie dans les traitements contre le cancer. L’immunothérapie est un traitement prometteur pour un certain nombre de cancers. Le CIK peut être augmenté efficacement in vitro par incubation de PMBCs patients-dérivés dans l’état de GMP-grade pour davantage d’infusion autologue.

Suivant ce protocole, nous pourrions exécuter la thérapie cellulaire immunisée dans un établissement gtp-ou GMP-grade pour davantage de traitement clinique de cancer.