Implantation orthotopique guidée par ultrasons de l'adénocarcinome ductal pancréatique murine

Nous décrivons un protocole pour l'implantation guidée d'ultrason des lignes canalaires canalaires canalaires d'adénocarcinome murine-dérivées de l'adénocarcinome de voie inole directement dans le site indigène de tumeur. Cette approche a eu comme conséquence les tumeurs pancréatiques détectables par balayage d'ultrason dans un délai de 2-4 semaines de l'injection, et a réduit de manière significative l'ensemencement de cellules de tumeur proportion sur la paroi péritonéale par rapport à l'implantation orthotopic chirurgicale.

Ce protocole permet l’étude du cancer du pancréas dans le site des tissus indigènes, tout en minimisant l’inflammation pendant l’injection de cellules tumorales et fournit une méthode à haut débit pour générer de grandes cohortes de souris. En utilisant des conseils ultrasons, le besoin de chirurgie abdominale est éliminé. Dans nos mains, UG-OTIM a un taux beaucoup plus bas d’ensemencement paroi péritonéale par rapport à l’implantation orthotopique traditionnelle.

UG-OTIM produit des tumeurs qui récapitulent les caractéristiques histologiques et immunobiologiques caractéristiques du micro-environnement pancréatique de tumeur et peuvent donc être employées pour étudier de nouvelles combinaisons thérapeutiques dans un arrangement médicalement pertinent. Nous avons développé ce protocole pour l’immuno-oncologie et les thérapies de biologie du cancer, mais il pourrait être utilisé dans d’autres domaines de recherche, y compris les études de la fonction pancréatique normale ou des états de la maladie tels que le diabète. L’imagerie ultrasonique en temps réel de l’insertion et de l’injection d’aiguilles fait partie intégrante de cette méthode.

Ainsi, la démonstration visuelle de l’étape est essentielle pour la bonne technique. Avant de commencer la procédure, nous suspendons la ligne pancréatique de cellules d’adénocarcinome ductile d’intérêt dans un volume approprié de PBS stérile et froid sur la glace. Placez les cages sur une plaque chauffante de 37 degrés Celsius et nettoyez soigneusement l’armoire de sécurité biologique, la chambre d’induction et le stade d’échographie avec un stérilisation approprié.

Réglez la fonction de réchauffement du stade d’échographie à 37 degrés Celsius et après l’induction de l’anesthésie, appliquez de l’onguent sur les yeux du premier animal. Placez la souris dans la couchée dorsale sur le stade de l’échographie, et fixez doucement les extrémités supérieures et inférieures à la scène avec du ruban adhésif. Utilisez un applicateur stérile à pointe de coton pour appliquer une généreuse couche de crème depilatory sur le quadrant supérieur gauche de l’abdomen au-dessus de la région de la rate jusqu’à la ligne médiane.

Après une minute, utiliser un tampon de gaze sèche pour enlever délicatement les cheveux avant d’enlever l’excès de crème depilatory avec une gaze humide saline. Placez ensuite la souris dans l’une des nouvelles cages propres sur le chauffe-eau. Pour l’implantation guidée par ultrasons de cellules tumorales, ajustez la plate-forme d’ultrason de sorte que la surface soit parallèle au plancher, et tenez-vous sur le côté gauche de l’animal avec la tête de la souris faisant face à droite.

Ajustez la position du transducteur de sorte qu’une image abdominale transversale soit obtenue, et fixez les membres de la souris à la plate-forme avec du ruban adhésif. Abaissez doucement le transducteur pour entrer en contact avec l’abdomen de la souris et ajustez le transducteur jusqu’à ce que le pancréas soit clairement visible. Localiser le rein gauche et la rate pour fournir une orientation précise dans la cavité abdominale.

Lorsque le site d’injection a été localisé, chargez une seringue d’insuline de 29 gages de 1/2 pouce avec 25 micro-litres de la suspension cellulaire tumorale, et essuyez la pointe de l’aiguille avec un tampon stérile de préparation à l’alcool. Utilisez des forceps de bord émoussés pour saisir la peau de la souris et la paroi péritonéale pour augmenter la tension au site d’injection. Tenant la seringue à un angle d’environ 25 à 45 degrés à la surface de la plate-forme ultrasonique, avancez lentement l’aiguille à travers la peau et la paroi péritonéale.

Confirmez que l’aiguille a perforé la paroi péritonéale avant d’utiliser la visualisation par ultrasons pour guider l’aiguille directement dans le pancréas. Lorsque l’aiguille est en place, injectez lentement les cellules tumorales. La formation d’un bolus fluide dans le pancréas sera évidente dans un pancréas correctement injecté par ultrasons.

Une fois que le volume complet de suspension a été injecté, et le bolus fluide peut être observé par ultrasons, maintenez la seringue très immobile pendant plusieurs secondes avant de retirer lentement l’aiguille de l’abdomen de la souris, en prenant soin de ne pas déranger les cellules injectées. Ensuite, placez la souris dans une nouvelle cage propre sur le chauffe-eau avec surveillance jusqu’à ce que la récupération complète. Le placement approprié d’aiguille dans le pancréas, y compris la profondeur et l’angle d’aiguille est une étape critique dans ce protocole.

La visualisation du bolus fluide aide à confirmer une injection réussie de tumeur. Le contrôle de la profondeur de l’injection est l’aspect le plus difficile. Mon conseil est de pratiquer avec des injections de tripamboo et de confirmer bolus liquide par ultrasons et autopsie.

La surveillance de l’implantation et du taux de croissance de tumeur par imagerie hebdomadaire d’ultrason indique des tumeurs qui sont contenues dans les frontières du pancréas tout au long de la période expérimentale entière. Les injections élevées de tumeur de litre ont comme conséquence une proportion plus élevée d’animaux porteurs de tumeur trois semaines après injection comparée à la cohorte basse de litre. En dépit du retard dans le début de tumeur, le taux global de croissance de tumeur n’est pas sensiblement différent entre les deux doses.

De même, bien que le taux de survie entre les deux cohortes ne soit pas significativement différent, ils ont tendance à se diriger vers une survie légèrement améliorée dans la cohorte de faible teneur en litres. La cohorte de titer élevé produit également une plus grande proportion de souris avec des tumeurs qui sont inrollables dans les études précliniques, par quatre semaines après injection. Au sacrifice, l’anatomie brute des tumeurs orthotopiques guidées d’implantation orthotopique d’ultrason est semblable à celle des tumeurs spontanées de KPC et l’analyse histologique démontre un modèle des structures ductal anormales qui est semblable dans les deux modèles et qui récapitule la morphologie de la maladie humaine.

Dans les deux modèles, les tumeurs sont mal infiltrées par les T-Cells, mais fortement infiltrées par les macrophages. N’oubliez pas de tenir la seringue à l’angle approprié pour permettre l’entrée en douceur dans le pancréas, et de confirmer que l’aiguille est dans le pancréas avant de procéder à l’injection. La croissance tumorale peut être surveillée et les tumeurs peuvent être récoltées pour analyse par cytométrie pho ou immunohistochimie pour déterminer l’impact d’une intervention.