Name: Cellule dimmunofluorescence utilisant IBA1 et TMEM119 pour la densité microgliale, la morphologie et lanalyse périphérique dinfiltration de cellules myéloïdes dans le cerveau de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Apprenez l'immunofluorescence IBA1 et TMEM119 pour analyser la densité microgliale, la morphologie et l'infiltration de macrophages dans le cerveau de souris. Cette méthode quantitative permet d'étudier la neuroinflammation.

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Nous sommes reconnaissants à Nathalie Vernoux pour ses conseils et son aide dans les expériences. Nous tenons également à remercier les Drs Emmanuel Planel et Serge Rivest pour l'utilisation de leur fluorescence et de leurs microscopes confocals, respectivement. Ces travaux ont été financés en partie par des bourses du Conseil mexicain des sciences et de la technologie (CONACYT; à F.G.I),Fondation Famille-Choquette et Centre thématique de recherche en neurosciences (CTRN; à K.P.), Du Fonds de Recherche du Québec - Santé (à M.B.), et L'Institut indo-canadien Shastri (à K.B.), ainsi qu'une subvention de découverte du Conseil canadien de recherches en sciences naturelles et en génie (CRSNG) à M.E.T. M.E.T. est titulaire d'une chaire de recherche du Canada (niveau II) sur la plasticité neuroimmune en santé et en thérapie.

<ol><li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).</li>
<li>Milior, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractalkine+receptor+deficiency+impairs+microglial+and+neuronal+responsiveness+to+chronic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+Microglial+Cells+Are+Highly+Dynamic+Surveillants+of+Brain+Parenchyma+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li>
<li>Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia in neurodegeneration.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1359(2018).</li>
<li>Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. È <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+across+the+lifespan%3A+from+origin+to+function+in+brain+development%2C+plasticity+and+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition.</a> The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).</li>
<li>Tremblay, M. È, Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+Interactions+with+Synapses+Are+Modulated+by+Visual+Experience%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience.</a> PLoS Biology. 8 (11), (2010).</li>
<li>Jakovljevic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+NTPDase1%2FCD39+by+Reactive+Microglia+and+Macrophages+Is+Associated+With+the+Functional+State+During+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).</li>
<li>Taylor, A. M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+Disrupt+Mesolimbic+Reward+Circuitry+in+Chronic+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).</li>
<li>Poliani, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM2+sustains+microglial+expansion+during+aging+and+response+to+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).</li>
<li>Lu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Tat-Induced+Microgliosis+and+Synaptic+Damage+via+Interactions+between+Peripheral+and+Central+Myeloid+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells.</a> PLoS ONE. 6 (9), e23915(2011).</li>
<li>Rodríguez, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+densities+of+resting+and+activated+microglia+in+the+dentate+gyrus+follow+senile+plaque+formation+in+the+CA1+subfield+of+the+hippocampus+in+the+triple+transgenic+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer's disease.</a> Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).</li>
<li>Rasmussen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+activation+of+microglia+is+associated+with+neuronal+dysfunction+of+callosal+projecting+pathways+and+multiple+sclerosis-like+lesions+in+relapsing-remitting+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).</li>
<li>Walker, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+structural+remodelling+of+microglia+in+health+and+disease%3A+a+review+of+the+models%2C+the+signals+and+the+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).</li>
<li>Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+Iba1+in+membrane+ruffling+and+phagocytosis+of+macrophages%2Fmicroglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia.</a> Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).</li>
<li>Yamasaki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+microglia+and+monocytes+in+the+inflamed+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).</li>
<li>Wohleb, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+innate+immune+challenge+exaggerated+microglia+activation%2C+increased+the+number+of+inflammatory+CNS+macrophages%2C+and+prolonged+social+withdrawal+in+socially+defeated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice.</a> Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).</li>
<li>Shemer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrafted+parenchymal+brain+macrophages+differ+from+microglia+in+transcriptome%2C+chromatin+landscape+and+response+to+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li>
<li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+monocytes%2C+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Development of monocytes, macrophages and dendritic cells.</a> Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).</li>
<li>Minogue, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+infiltrating+monocytes%2Fmacrophages+in+acute+and+chronic+neuroinflammation%3A+Effects+on+cognition%2C+learning+and+affective+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neuro-Psychopharmacology+and+Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour.</a> Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).</li>
<li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+Mapping+Analysis+Reveals+That+Adult+Microglia+Derive+from+Primitive+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages.</a> Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).</li>
<li>Kierdorf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+emerge+from+erythromyeloid+precursors+via+Pu.1-+and+Irf8-dependent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways.</a> Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li>
<li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fractalkine+receptor+but+not+CCR2+is+present+on+microglia+from+embryonic+development+throughout+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Ce protocole peut être divisé en deux parties critiques : la qualité de la coloration et l'analyse. Si la coloration n'est pas optimale, elle ne représentera pas adéquatement les cellules microgliales, affectant ainsi la densité, la distribution et les mesures de morphologie. En outre, la proportion de cellules myéloïdes périphériques d'infiltration peut être sous-estimée. Il s'agit d'une version optimisée du protocole de coloration, mais il existe plusieurs facteurs qui peuvent entraîner des images sous-optimales. Même ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.
The&#160;name&#160;was&#160;corrected from:
Maude&#160;Bordelau
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Maude&#160;Bordeleau

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.

Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

Qu'elle soit grave ou chronique, la neuroinflammation est fortement influencée par les microglies, les macrophages résidents du cerveau. La visualisation des microglies par immunostaining est précieuse pour l'étude de la neuroinflammation avec l'utilisation de la microscopie légère, une technique très accessible. Dans des conditions homéostatiques, les microglies sont généralement distribuées dans un modèle non superposé, ressemblant à une mosaïque. Ils présentent de petits somas qui prolongent les processus ramifiés1, qui parfois se contactentles uns lesautres 2 . Les processus ramifiés microglial s'enduisent dynamiquement sur le parenchyme cérébral, interagissant avec les neurones, les autres cellules gliales et les vaisseaux sanguins dans des conditions physiologiques normales3. Les microglies sont équipées d'un arsenal de récepteurs qui leur permettent d'effectuer des tâches immunologiques et de répondre aux changements dans le milieu cérébral, à la mort cellulaire ou aux lésions tissulaires. En outre, ils exercent des fonctions physiologiques clés, notamment dans la formation synaptique, l'entretien et l'élimination4,5.
Parmi les marqueurs disponibles utilisés pour étudier les microglies, la molécule ionisée d'adaptateur de liaison de calcium 1 (IBA1) est l'un des plus largement utilisés. IBA1 est une protéine de liaison de calcium qui fournit la visualisation exceptionnelle de la morphologie microgliale, y compris les processus distal fins, comme confirmé par la microscopie électronique6. Cet outil a joué un rôle déterminant dans la caractérisation de la transformation microgliale, anciennement appelée « activation », dans un vaste éventail de modèles de maladies animales7,8,9. En présence de neuroinflammation, la réponse microgliale comprend : la microgliose qui est définie comme une augmentation de la densité cellulaire, les changements de distribution qui se traduisent parfois par le regroupement, l'élargissement du corps cellulaire, ainsi que l'épaississement et raccourcissement des processus associés à des formes plus améboïdes10,11,12,13.
L'immunostaining est limité par la disponibilité d'anticorps dirigés contre des marqueurs spécifiques. Surtout, IBA1 est exprimé par des microglies mais aussi par des macrophages périphériques qui s'infiltrent dans le cerveau14. Tandis que l'observation des cellules IBA1-positives à l'intérieur du cerveau est devenue un marqueur des microglies dans ce domaine de recherche, l'infiltration périphérique de macrophage a été rapportée dans diverses conditions, même marginalement dans le cerveau sain15,16 ,17,18. Par conséquent, l'utilisation d'IBA1 seule ne permet pas la visualisation sélective des microglies. En outre, les macrophages adoptent des caractéristiques moléculaires et morphologiques des microglies résidentes une fois qu'ils ont infiltré le cerveau, empêchant ainsi la différenciation19. Cela représente un défi lors de l'étude de la fonction des microglies et de l'infiltration de macrophages.
Bien que les microglies et les macrophages périphériques aient des origines distinctes (p. ex., du sac de jaune embryonnaire et de la moelle osseuse, respectivement20,21), il y a un nombre croissant de résultats indiquant que les deux populations cellulaires exercent différents rôles dans le cerveau19. Il est donc crucial d'utiliser des méthodes qui font la distinction entre ces deux populations sans manipulations invasives (c.-à-d. chimères de moelle osseuse ou parabiose) qui peuvent moduler leur densité, leur distribution, leur morphologie et leur fonction. TMEM119 a émergé comme un marqueur microglies-spécifiques à travers la santé et les conditions de la maladie22. Lorsqu'il est combiné avec IBA1, ce marqueur devient utile pour différencier ces cellules de l'infiltration macrophages, qui sont TMEM119-négatif et IBA1-positif. Bien qu'il soit réglementé par le développement, TMEM119 est exprimé dès les jours postnatals 3 (P3) et 6 (P6), augmentant régulièrement jusqu'à atteindre les niveaux adultes entre P10 et P1422. IBA1 est exprimé dès le jour embryonnaire 10.5 (E10.5)23. Le protocole de double étiquetage proposé est donc utile pour étudier ces deux populations tout au long de la vie postnatale.
Ce protocole fournit une procédure d'immunostaining étape par étape qui permet la discrimination entre les microglies et les macrophages périphériques. Il explique également comment effectuer une analyse quantitative de la densité, de la distribution et de la morphologie des microglies, ainsi que l'analyse de l'infiltration périphérique de macrophage. Tandis que l'étude des microglies et des macrophages périphériques est utile en soi, ce protocole permet en outre la localisation des foyers neuroinflammatoires ; ainsi, il sert également de plate-forme pour identifier des régions spécifiques à étudier, avec l'utilisation de techniques complémentaires (encore plus longues et consommatrices de ressources).

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 âne anti-souris</td><td>Invitrogen/Thermofisher</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 chèvre anti-lapin</td><td>Invitrogen/Thermofisher</td><td>A11011</td><td></td></tr><tr><td>Biolite 24 Well multi-plats</td><td>Thermo Fisher</td><td>930186</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>2930</td><td></td></tr><tr><td>Acide citrique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0759-500G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Coloration à l’acide nuceléique</td><td>Invitrogen/Thermofisher</td><td>MP 01306</td><td></td></tr><tr><td>Pinceau fin</td><td>Art store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine de peau de poisson d’eau froide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>Couverture de microscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>1254418</td><td></td></tr><tr><td>Microlames chargées positivement</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Souris monoclonale Anti-IBA1</td><td>Millipore</td><td>MABN92</td><td></td></tr><tr><td>Na2H2PO4&middot ; H2O</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>SPM306, SPM400</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>SPD307, SPD600</td><td></td></tr><tr><td>NaBH4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>480886</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S642500</td><td></td></tr><tr><td>Sérum d’âne normal (NDS)</td><td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal (NGS)</td><td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm-M</td><td>Parafilm</td><td>PM-999</td><td></td></tr><tr><td>Lapin monoclonal Anti-TMEM119</td><td>Abcam</td><td>ab209064</td><td></td></tr><tr><td>Bain d’agitation réciproque modèle 25</td><td>Précision</td> <td>Scientifique-Pipette</td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>de transfert</td></tr><tr><td>Tris tampon chlorhydrate</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>TRS002/TRS004</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

cellule d'immunofluorescence utilisant iba1 et tmem119 pour la densité microgliale, la morphologie et l'analyse périphérique d'infiltration de cellules myéloïdes dans le cerveau de souris

Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

Il s'agit d'un protocole pour la double visualisation des microglies et l'infiltration de macrophages dans le tissu cérébral de la souris. TMEM119 (qui étiquette les microglies de manière sélective), lorsqu'il est combiné avec IBA1 (qui fournit une visualisation exceptionnelle de leur morphologie), permet d'enquêter sur les changements dans la densité, la distribution et la morphologie. La quantification de ces paramètres est importante pour fournir des informations sur les rôles exercés par les microglies, les macrophages résidents du cerveau. Dans des conditions physiologiques normales, les microglies sont régulièrement distribuées en mosaïque et présentent un petit soma avec des processus ramifiés. Néanmoins, en réponse à des facteurs environnementaux (c.-à-d. traumatisme, infection, maladie ou blessure), la densité microgliale, la distribution et la morphologie sont modifiées de diverses manières, selon l'insulte. En outre, la méthode de double coloration décrite permet la visualisation des macrophages infiltrants dans le cerveau basé sur leur expression de IBA1 et sans colocalisation avec TMEM119. Cette approche permet ainsi la discrimination entre les microglies et les macrophages infiltrants, ce qui est nécessaire pour fournir des informations fonctionnelles sur leur implication distincte dans l'homéostasie du cerveau à travers divers contextes de la santé et la maladie. Ce protocole intègre les derniers résultats en neuroimmunologie qui se rapportent à l'identification des marqueurs sélectifs. Il sert également d'outil utile pour les neuroimmunologistes expérimentés et les chercheurs qui cherchent à intégrer la neuroimmunologie dans les projets.

La figure 1 montre la co-étiquetage des microglies à l'aide d'IBA1 et de TMEM119 dans une section coronale de l'hippocampe dorsal image à 20x par microscopie de fluorescence. Une coloration réussie révèle les corps de cellules microgliales et leurs processus fins (Figure 1A-C). Cette coloration permet de déterminer la densité et la distribution microgliales et l'identification des amas microglial (<strong class="...

Ce protocole décrit un workflow étape par étape pour la costaining immunofluorescente d'IBA1 et de TMEM119, en plus de l'analyse de la densité, de la distribution et de la morphologie microgliales, aussi bien que l'infiltration périphérique de cellules myéloïdes dans le tissu de cerveau de souris.

Cellule d'immunofluorescence utilisant IBA1 et TMEM119 pour la densité microgliale, la morphologie et l'analyse périphérique d'infiltration de cellules myéloïdes dans le cerveau de souris

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia ...

Ce protocole vous montrera comment tacher les microglies, effectuer des analyses quantitatives de densité et de morphologie ainsi que quantifier l’infiltration de macrophages dans le cerveau. Cette technique permet au chercheur de mesurer les changements dans la distribution et la morphologie des microglies d’une manière quantitative et de différencier les microglies des macrophages infiltrants Ce protocole d’analyse peut être facilement appliqué à d’autres modèles animaux pour mesurer les changements dans la distribution et la morphologie microgliales où des anticorps anti-IBA1 et anti-TMEM119 sont disponibles. Il est fortement recommandé d’effectuer les dénombrements cellulaires et les traces aveugles à l’état expérimental et d’être cohérent dans la façon dont cette procédure est effectuée.Pour commencer cette procédure, ouvrez un programme de traitement d’image tel que Fidji ou ImageJ qui a le voisin le plus proche plug-in distance installé. Ouvrez l’image 20X si l’échelle est contenue dans les métadonnées du fichier et non pas automatiquement définie à partir des métadonnées. Sur la barre de menu, sélectionnez Analyser, Définir l’échelle, puis entrez les informations correctes.Pour définir l’échelle manuellement en fonction d’une échelle imprimée sur l’image, sélectionnez l’outil Straight Line. Placez le curseur sur le bord de l’échelle et tout en appuyant sur la touche Shift, tracez une ligne aussi près que possible de l’échelle sur l’image. Sélectionnez Analyser, Définir l’échelle.Une fenêtre apparaîtra et mettra la bonne distance connue et l’unité de longueur pour déterminer l’unité par longueur du pixel et cliquez sur OK. Ensuite, sélectionnez Image, Couleur, Make Composite pour créer une image composite de tous les canaux. Sur la barre de menu, sélectionnez Analyser, Définir les mesures. Check Area, Centroid et Perimeter.Dans le menu Redirect To dropdown, sélectionnez le fichier Open puis cliquez sur OK. Passez à l’image, la couleur, l’outil canal pour ouvrir l’outil Canal. Utilisez l’outil sélection à main levée pour dessiner un périmètre rugueux autour de la région d’intérêt. Double cliquez sur l’outil Ovale sur la barre d’outils pour activer l’outil brosse de sélection.Assurez-vous que la case Activer la brosse de sélection est cochée et cliquez sur OK. À l’aide de la brosse de sélection, ajustez le périmètre pour mieux s’adapter à la région d’intérêt, puis appuyez sur T sur le clavier dans toute cette zone pour flècher Y manager. Sélectionnez Analyser, mesurer ou appuyer sur la touche M et la fenêtre Résultats apparaîtra. Copiez et coller les résultats dans une fiche de données et enregistrez les informations concernant la zone.Après avoir copié la zone de la région d’intérêt, vous basez les informations de la fenêtre Résultats en cliquant dessus et en appuyant sur la clé Backspace. Sélectionnez la fenêtre ROI Manager, sélectionnez la trace roi et changez le nom pour correspondre au nom de l’image en appuyant sur Rename. Cliquez sur OK puis cliquez à droite sur le nouveau nom de la trace roi et enregistrer.Cliquez deux fois sur l’outil Brosse dans la barre d’outils. Sélectionnez la couleur noire et la taille de la brosse de 10. Assurez-vous que l’option Peinture sur superposition n’est pas contrôlée.Dans le canal TMEM119, placez soigneusement un point noir au centre du soma pour chaque microglie positive TMEM119. Placez un point blanc sur le centre des cellules qui ne sont pas positifs pour TMEM119. Répétez la même procédure pour toutes les cellules contenues dans la région d’intérêt.Ensuite, sélectionnez Image, Couleur, Split Channel, une fenêtre pour chaque canal s’affiche. Identifiez le canal qui a les annotations de points et fermez les deux autres fenêtres. Pour rediriger la nouvelle image du canal fractionnement, rendez-vous sur Analyser, définir les mesures.Dans le menu Redirect To drop down, sélectionnez l’image split channel et cliquez sur OK. Sélectionnez ensuite Image, Type, huit bits. Passez à l’ajustement d’image et sélectionnez Seuil. Ajustez les curseurs jusqu’à gauche dans les deux barres.Cela ne laissera que les points noirs qui apparaîtront maintenant en blanc. Sélectionnez la région d’intérêt dans la fenêtre roi manager. Dans la barre de menu, sélectionnez Analyser, analyser les particules.Dans la boîte de texte pour la taille, entrez un à 20. La case pour les unités Pixel doit rester non cochée tandis que la case qui est pour les résultats d’affichage, résumer et ajouter au gestionnaire doit être cochée. Cliquez sur OK pour afficher la fenêtre Résumé qui donnera le nombre de points.Copiez et coller ces informations à la fiche de données. Ensuite, sélectionnez plug-ins NND pour afficher la fenêtre NND. Chaque nombre représente la distance que chaque microglie a par rapport aux microglies voisines les plus proches.Copiez et coller toutes ces informations à la fiche de données. Retournez à la fenêtre Seuil et ajustez le curseur supérieur jusqu’à droite, ce qui laissera tous les points blancs visibles, apparaissant maintenant en blanc. Sélectionnez Analyser, analyser les particules pour afficher la fenêtre Analyser les particules.Cliquez sur OK pour afficher la fenêtre Résumé qui fournit le nombre de points. Copiez et coller ces informations dans la fiche de données. Rendez-vous sur le gestionnaire de retour sur investissement et sélectionnez tous les points.Puis cliquez à droite et enregistrez avec le nom de l’image. Cela permettra d’enregistrer tous les points dans un fichier ZIP. Tout d’abord, ouvrez les fichiers d’images 4DX.Une fenêtre pop up apparaîtra demandant si les images doivent être ouvertes dans une pile. Cliquez sur OK. Ensuite, sélectionnez Image, Piles, ZProject pour ouvrir la fenêtre de projection Z. Inclure toutes les tranches de la première à la dernière tranche.Assurez-vous que l’intensité maximale est sélectionnée sous le type de projection et cliquez sur OK. Cliquez sur la nouvelle fenêtre qui contient le ZProject. Sélectionnez Image, Couleurs, Canaux Fractionnements et effectuez les traces sur les images du canal IBA1. Dans la barre de menu, sélectionnez Analyser, définir les mesures.Vérifiez la zone, centroïde et périmètre. Dans le menu Redirect To drop down, sélectionnez le fichier ouvert et cliquez sur OK. Pour définir l’échelle manuellement en fonction d’une échelle imprimée sur l’image, sélectionnez l’outil Straight Line. Placez le curseur sur le bord de l’échelle et tout en appuyant sur la touche Shift, tracez une ligne aussi près que possible de l’échelle sur l’image.Sélectionnez Analyser, Définir l’échelle. Une fenêtre apparaîtra. Entrez la distance et l’unité de longueur connues correctes pour déterminer l’unité Pixels par longueur et cliquez sur OK. Pour mesurer la taille du soma dans le canal IBA1, dessinez un périmètre rugueux du soma avec l’outil de sélection à main levée.Cliquez deux fois sur l’outil Ovale sur la barre d’outils pour activer l’outil Selection Brush. Assurez-vous que la case Activer la brosse de sélection est cochée et cliquez sur OK. À l’aide de la brosse de sélection, ajustez la trace pour mieux s’adapter au soma. Le zoom avant permettra une précision pendant cette étape.Ensuite, appuyez sur la clé T pour ajouter la trace soma au gestionnaire de roi. Sélectionnez Analyser, mesurer ou appuyer sur la clé M pour afficher les résultats. Copiez et coller ces résultats sur une fiche de données.Rendez-vous à la fenêtre roi manager, sélectionnez la région d’intérêt et changez le nom pour correspondre au nom de l’image en appuyant sur Rename. Cliquez à droite sur la région d’intérêt rebaptisée et cliquez sur Enregistrer. Assurez-vous que le nom spécifie que la trace est pour soma et enregistrer le fichier.Pour mesurer la zone d’arborisation dans le canal IBA1, sélectionnez d’abord l’outil de sélection polygone. Cliquez sur l’extrémité du processus microglial avec l’outil pour commencer la forme du polygone. Faire le tour des microglies en cliquant sur les extrémités de chaque procédé pour former un polygone qui représente le mieux la zone couverte par les arborisations microgliales.Lorsque le polygone est terminé, cliquez sur le point de départ pour le fermer. Ensuite, appuyez sur la touche T pour ajouter la trace au gestionnaire de retour sur investissement. Sélectionnez Analyser, mesurer ou appuyer sur la touche M pour ajouter les données à la fenêtre Résultats.Copiez et coller ces données à la fiche de données. Pour enregistrer les informations concernant la zone d’arborisation, rendez-vous à la fenêtre roi manager, sélectionnez la région d’intérêt et changez le nom pour correspondre au nom de l’image en appuyant sur Rename. Cliquez à droite sur la région d’intérêt rebaptisée et cliquez sur Enregistrer.Assurez-vous que le nom précise que la trace est pour l’arborisation et enregistrer le fichier. Cette étude a décrit le flux de travail étape par étape pour la co-coloration immunofluorescente d’IBA1 et tmem119 et pour l’analyse de la densité, de la distribution et de la morphologie microgliales ainsi que de l’infiltration périphérique de cellules myéloïdes dans le tissu cérébral de souris. La microscopie par fluorescence est utilisée pour imager le co-étiquetage des microglies à l’aide d’IBA1 et tmem119 dans la section coronale de l’hippocampe dorsal au grossissement 20X.Une coloration réussie révèle les corps cellulaires microglials et leurs processus fins. La coloration permet de déterminer la densité et la distribution microgliales et d’identifier les grappes microgliales et les macrophages infiltrants. La microscopie confocale est utilisée pour l’image de la procédure de traçage de l’arborisation microgliale stepwise au grossissement 40X.Ces résultats représentatifs montrent IBA1 microglies positives et TMEM119 positives ainsi qu’un exemple de traçage du corps cellulaire. Il est important d’être cohérent lors du comptage des cellules et de prêter attention aux signaux d’IBA1 et de TMEM119. Cette technique permet au chercheur d’identifier les régions du cerveau qui sont affectées par un stimulus particulier qui peut ensuite être étudié plus en profondeur avec des techniques complémentaires.

immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Nous décrivons un protocole pour perfusion transcardiaque de souris, l'enlèvement et la coupe du cerveau, ainsi que la coloration immunoperoxydase, résine d'enrobage, et ultraminces de sectionnement des sections du cerveau. A l'issue de ces procédures, le matériel est prêt pour immunocolorés examen par microscopie électronique à transmission.

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Une façon d’obtenir de nouvelles connaissances sur la complexité de la réponse inflammatoire cérébrale est présentée. Nous décrivons des protocoles basés sur l’immunofluorescence suivis d’une analyse confocale tridimensionnelle pour étudier le modèle de co-expression des marqueurs phénotypiques microglie/macrophage dans un modèle murin d’ischémie focale.

Trois dimensions d&#39;analyse confocale de marqueurs microglies / macrophages de polarisation dans Experimental Brain Injury

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Primaire pour Immunohistochimie sur tissus Cryosectioned cerveau de rat: Exemple coloration pour microglies et les neurones

Cet article décrit un protocole pour la visualisation de plaques amyloïdes Aß dans les modèles de souris de la maladie d'Alzheimer en utilisant méthoxy-X04, qui traverse la barrière hémato-encéphalique et se lie à la ß-plissés feuilles trouvées dans noyau dense plaques Aß sélectivement. Il permet la présélection des coupes de tissus contenant la plaque-avant immunocoloration et de traitement pour la microscopie électronique.

Corrélative microscopie optique et électronique pour l&#39;étude microgliales Interactions avec plaques ß-amyloïde

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Spécificité des anticorps de liaison pour Kappa (VK) humaines (IgM) contenant de chaîne légère: POLYSIALIQUE Acid (PSA) Rattaché à NCAM comme étude de cas

Les microglies sont des cellules immunitaires du cerveau qui enquête et réagissent à la physiologie du cerveau altéré par des modifications morphologiques qui peuvent être évalués quantitativement. Ce protocole décrit un ImageJ base protocole d’analyse pour représenter la microglie morphologie comme continue des données selon des indicateurs tels que la ramification de la cellule, la complexité et la forme.

Quantifier les cellules microgliales morphologie de microphotographies d’immunohistochimie préparé des tissus à l’aide de ImageJ

Présenté ici est un protocole pour ouvrir transitoirement la barrière hémato-encéphalique (BHE) soit de manière focale, soit dans tout le cerveau d’une souris pour délivrer des anticorps marqués par fluorescence et activer la microglie. Une méthode permettant de détecter l’administration d’anticorps et l’activation de la microglie par histologie est également présentée.

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Le protocole présenté ici permet la transplantation de microglies humaines induites dérivées de cellules souches pluripotentes (iPSMG) dans le cerveau par voie transnasale chez des souris immunocompétentes. La méthode de préparation et de transplantation transnasale de cellules et l’administration d’un mélange de cytokines pour le maintien de l’iPSMG est présentée.

Transplantation de microglies dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans le cerveau de souris immunocompétentes par voie transnasale non invasive

Le logiciel de cartographie des paramètres microgliales (MMPS) est un pipeline d’analyse convivial qui ne nécessite aucune expertise en codage et qui automatise semi-automatisé l’analyse de morphologie microgliale unicellulaire à partir d’images d’immunofluorescence. Validé dans un modèle de neuroinflammation induit par des lipopolysaccharides de rongeurs, le MMPS détecte de manière reproductible les changements morphologiques associés à l’activation et permet un phénotypage microglial...

Logiciel de cartographie des paramètres microgliales (MMPS) : un outil open source et convivial pour l’analyse quantitative de la morphologie de la microglie

Apprenez l'immunofluorescence IBA1 et TMEM119 pour analyser la densité microgliale, la morphologie et l'infiltration de macrophages dans le cerveau de souris. Cette méthode quantitative permet d'étudier la neuroinflammation.

Cellule dimmunofluorescence utilisant IBA1 et TMEM119 pour la densité microgliale, la morphologie et lanalyse périphérique dinfiltration de cellules myéloïdes dans le cerveau de souris (Vidéo) | JoVE Journal

Cellule d'immunofluorescence utilisant IBA1 et TMEM119 pour la densité microgliale, la morphologie et l'analyse périphérique d'infiltration de cellules myéloïdes dans le cerveau de souris

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