Name: Une plate-forme de spectrométrie de masse d’échange hydrogène-deutérium (HDX-MS) pour étudier les enzymes biosynthétiques peptidiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Découvrez une plateforme HDX-MS continue pour analyser la dynamique conformationnelle des synthétases de lanthipeptides. Cette méthode identifie les régions fonctionnelles importantes sans marquage protéique.

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Ces travaux ont été appuyés par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada, le Fonds de recherche du Québec nature et technologie, la Fondation canadienne pour l’innovation et les fonds de démarrage de l’Université McGill.

<ol><li>Karplus, M., McCammon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dynamics+simulations+of+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular dynamics simulations of biomolecules.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 9 (9), 646-652 (2002).</li>
<li>Campbell, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+protein+dynamics+in+the+evolution+of+new+enzyme+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of protein dynamics in the evolution of new enzyme function.</a> Nature Chemical Biology. 12 (11), 944-950 (2016).</li>
<li>Tokuriki, N., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+dynamism+and+evolvability%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Protein dynamism and evolvability.</a> Science. 324 (5924), 203-207 (2009).</li>
<li>Wales, T. E., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+exchange+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics.</a> Mass Spectrometry Reviews. 25 (1), 158-170 (2006).</li>
<li>Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+exchange+mass+spectrometry+for+studying+protein+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics.</a> Chemical Society Reviews. 40 (3), 1224(2011).</li>
<li>Katta, V., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+proteins+probed+by+hydrogen-exchange+electrospray-ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (4), 214(1991).</li>
<li>Zhang, Z., Smith, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+amide+hydrogen+exchange+by+mass+spectrometry%3A+a+new+tool+for+protein+structure+elucidation%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation.</a> Protein Science. 2 (4), 522(1993).</li>
<li>Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+non-covalent+structure+of+proteins+by+amide+hydrogen+exchange+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).</li>
<li>Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+structure+effects+on+peptide+group+hydrogen+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange.</a> Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).</li>
<li>Xiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+architecture+of+protein+complexes+by+an+orthogonal+approach+combining+HDXMS%2C+CXMS%2C+and+disulfide+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Revealing the architecture of protein complexes by an orthogonal approach combining HDXMS, CXMS, and disulfide trapping.</a> Nature Protocols. 13 (6), 1403-1428 (2018).</li>
<li>Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+non-covalent+structure+of+proteins+by+amide+hydrogen+exchange+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).</li>
<li>Masson, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+performing%2C+interpreting+and+reporting+hydrogen+deuterium+exchange+mass+spectrometry+%28HDX-MS%29+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Recommendations for performing, interpreting and reporting hydrogen deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) experiments.</a> Nature Methods. 16 (7), 595-602 (2019).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Efficient+Site-Specific+Method+for+Irreversible+Covalent+Labeling+of+Proteins+with+a+Fluorophore%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An Efficient Site-Specific Method for Irreversible Covalent Labeling of Proteins with a Fluorophore.</a> Scientific Reports. 5, 16883(2015).</li>
<li>Marion, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+the+overlap+problem+in+the+assignment+of+proton+NMR+spectra+of+larger+proteins+by+use+of+three-dimensional+heteronuclear+proton-nitrogen-15+Hartmann-Hahn-multiple+quantum+coherence+and+nuclear+Overhauser-multiple+quantum+coherence+spectroscopy%3A+application+to+interleukin+1.beta%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Overcoming the overlap problem in the assignment of proton NMR spectra of larger proteins by use of three-dimensional heteronuclear proton-nitrogen-15 Hartmann-Hahn-multiple quantum coherence and nuclear Overhauser-multiple quantum coherence spectroscopy: application to interleukin 1.beta.</a> Biochemistry. 28 (15), 6150-6156 (1989).</li>
<li>Balasubramaniam, D., Komives, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen-exchange+mass+spectrometry+for+the+study+of+intrinsic+disorder+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Hydrogen-exchange mass spectrometry for the study of intrinsic disorder in proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1834 (6), 1202-1209 (2013).</li>
<li>Goswami, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+window+expansion+for+HDX+analysis+of+an+intrinsically+disordered+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).</li>
<li>Keppel, T. R., Howard, B. A., Weis, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Unstructured+Regions+and+Synergistic+Folding+in+Intrinsically+Disordered+Proteins+with+Amide+H%2FD+Exchange+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mapping Unstructured Regions and Synergistic Folding in Intrinsically Disordered Proteins with Amide H/D Exchange Mass Spectrometry.</a> Biochemistry. 50 (40), 8722-8732 (2011).</li>
<li>Mitchell, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Characterization+and+Conformational+Analysis+of+the+Herpesvirus+saimiri+Tip-C484+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional Characterization and Conformational Analysis of the Herpesvirus saimiri Tip-C484 Protein.</a> Journal of Molecular Biology. 366 (4), 1282-1293 (2007).</li>
<li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry+with+top-down+electron+capture+dissociation+for+characterizing+structural+transitions+of+a+17+kDa+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).</li>
<li>Habibi, Y., Uggowitzer, K. A., Issak, H., Thibodeaux, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+Dynamic+Structural+Properties+of+a+Lanthipeptide+Synthetase+using+Hydrogen-Deuterium+Exchange+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Insights into the Dynamic Structural Properties of a Lanthipeptide Synthetase using Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14661-14672 (2019).</li>
<li>Hebling, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+analysis+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+nanodiscs+by+hydrogen+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 82 (13), 5415-5419 (2010).</li>
<li>Duc, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+application+of+bicelles+for+conformational+analysis+of+G+protein-coupled+receptors+by+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Effective application of bicelles for conformational analysis of G protein-coupled receptors by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (5), 808-817 (2015).</li>
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<li>Reading, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+Membrane+Protein+Conformational+Dynamics+within+Native+Lipid+Compositions%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Interrogating Membrane Protein Conformational Dynamics within Native Lipid Compositions.</a> Angewandte Chemie International Edition. 56 (49), 15654-15657 (2017).</li>
<li>Hentze, N., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+protein+dynamics+using+hydrogen+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50839(2013).</li>
<li>Lento, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+ElectroSpray+Ionization+Hydrogen-deuterium+Exchange+Mass+Spectrometry+for+Studying+Protein+Structure+and+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55464(2017).</li>
<li>Schowen, K. B., Schowen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+isotope+effects+on+enzyme+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Solvent isotope effects on enzyme systems.</a> Methods in Enzymology. 87, 551-606 (1982).</li>
<li>Lau, A. M. C., Ahdash, Z., Martens, C., Politis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deuteros%3A+software+for+rapid+analysis+and+visualization+of+data+from+differential+hydrogen+deuterium+exchange-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Deuteros: software for rapid analysis and visualization of data from differential hydrogen deuterium exchange-mass spectrometry.</a> Bioinformatics. 35 (7), 3171-3173 (2019).</li>
<li>Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry+in+biopharmaceutical+comparability+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (6), 2071(2011).</li>
<li>Burkitt, W., O'Connor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+repeatability+and+reproducibility+of+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Assessment of the repeatability and reproducibility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry measurements.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 22 (23), 3893-3901 (2008).</li>
<li>Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+electrospray+ms-coupled+microfluidic+device+for+sub-second+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+pulse-labelling+reveals+allosteric+effects+in+enzyme+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition.</a> Lab on a Chip. 13, 2528-2532 (2013).</li>
</ol>

Nous n’avons rien à divulguer.

Le flux de travail HDX-MS présenté dans ce protocole fournit une plate-forme remarquablement robuste pour cartographier la distribution spatiale des éléments structurellement dynamiques dans les protéines et pour étudier comment ces dynamiques changent en réponse à la perturbation (liaison ligand, mutagenèse enzymatique, etc.). HDX-MS présente plusieurs avantages distincts par rapport à d’autres approches de biologie structurelle qui sont couramment utilisées pour étudier la dynamique conformationnelle. Plus particulière...

Les protéines sont des molécules structurellement dynamiques qui échantillonnent différentes conformations sur des échelles de temps allant des vibrations des liaisons femtosecondes aux réarrangements de domaines protéiques entiers qui peuvent se produire sur plusieurs secondes1. Ces fluctuations conformationnelles sont souvent des aspects critiques de la fonction enzymatique/protéique. Par exemple, les changements conformationnels induits par la liaison ligand sont souvent d’une importance cruciale pour moduler la fonction enzymatique, soit en organisant les résidus actifs du site nécessaires à la catalyse, en définissant les sites de liaison du substrat dans les mécanismes cinétiques séquentiels, en protégeant les intermédiaires réactifs de l’environnement, soit en modulant la fonction enzymatique par l’intermédiaire de réseaux allotériques. Des études récentes ont également montré que la dynamique conformationnelle peut être conservée tout au long de l’évolution et que les perturbations des mouvements moléculaires conservés peuvent être corrélées avec des changements dans la spécificité du substrat et l’émergence de nouvelles fonctions enzymatiques2,3.
Ces dernières années, la spectrométrie de masse d’échange hydrogène-deutérium (HDX-MS) est rapidement apparue comme une technique puissante pour sonder la façon dont les paysages conformationnels protéiques réagissent aux perturbations telles que la liaison ligand ou la mutagenèse4,5,6,7. Dans une expérience typique de HDX-MS (figure 1), une protéine d’intérêt est placée dans le tampon préparé dans D2O, ce qui déclenche le remplacement des protons échangeables de solvants par deutérium. Le taux de change de l’amide moiety des liaisons peptidiques dépend fortement du pH, de la séquence locale d’acides aminés, et de l’environnement structurel local de l’amide8. Les amidons engagés dans des interactions de liaison hydrogène (comme celles présentes dans les α-hélices et les feuilles de β) s’échangent plus lentement que les amides dans les régions non structurées de la protéine qui sont exposées au solvant en vrac. Ainsi, l’étendue de l’absorption de deutérium est un reflet de la structure de l’enzyme. On s’attendrait à ce que les enzymes qui sont conformationally dynamiques, ou qui subissent des transitions structurelles sur la liaison ligand, produisent une réponse mesurable de HDX.
La base mécaniste du taux de change lent d’un amide structuré est indiquée dans la figure 25,8,9. Pour subir le HDX, la région structurée doit d’abord échantillonner transitoirement une conformation dépliée, de sorte que les molécules solvantes qui catalysent l’échange HDX via un mécanisme chimique acide/de base spécifique, aient accès à l’amide échangeable. En fin de compte, les magnitudes relatives du taux de change chimique (kchem) et les taux de pliage et de refolding (kouvert et kfermer) déterminer le taux HDX mesuré dans l’expérience5,8. De ce modèle cinétique simple, il est clair que l’étendue de l’absorption de deutérium reflétera la dynamique conformationnelle sous-jacente (telle que définie par kouvert et kfermer). La plupart des expériences HDX-MS sont réalisées dans un flux de travail ascendant où, suite à la réaction d’échange, la protéine d’intérêt est digérée en peptides et l’absorption de deutérium par chaque peptide est mesurée comme une augmentation de la masse7. De cette façon, HDX-MS permet de cartographier les perturbations de la dynamique conformationnelle des enzymes à l’échelle spatiale locale des peptides, ce qui permet au chercheur d’évaluer comment la perturbation modifie la dynamique dans différentes régions de l’enzyme d’intérêt.
Les avantages de l’approche HDX-MS pour élucider la dynamique structurelle des protéines sont nombreux. Tout d’abord, la méthode peut être effectuée avec de petites quantités de protéines indigènes ou sur des complexes protéiques dans des systèmes à structure quaternaire10. Il n’est même pas nécessaire que la préparation enzymatique utilisée dans l’analyse soit fortement purifiée11,12, tant que le flux de travail HDX-MS ascendant fournit un nombre suffisant de peptides identifiés avec confiance qui couvrent la séquence protéique d’intérêt. En outre, HDX-MS peut fournir des informations sur la dynamique conformationnelle dans des conditions quasi natives sans avoir besoin d’étiquetage protéique spécifique au site comme cela serait utilisé dans les études de fluorescence à moléculeunique 13, et il n’y a pas de limite de taille au complexe protéique ou protéique qui peut être étudié (ce qui rend difficiles des approches telles que la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire [NMR])7,14. Enfin, des méthodes HDX-MS résolues dans le temps peuvent être utilisées pour étudier les protéines intrinsèquement désordonnées, qui sont difficiles à étudier avec la cristallographie aux rayons X15,16,17,18. La principale limitation de HDX-MS est que les données sont de faible résolution structurelle. Les données HDX-MS sont utiles pour indiquer où la dynamique conformationnelle évolue et pour révéler des changements conformationnels couplés, mais elles ne fournissent pas souvent beaucoup d’informations sur le mécanisme moléculaire précis qui conduit au changement observé. Les progrès récents dans la combinaison des méthodes de dissociation de capture d’électrons avec les données de protéine HDX-MS se sont révélés prometteurs pour cartographier les sites d’échange aux résidus d’acides aminéssimples 19, mais le suivi des études biochimiques et structurelles sont encore souvent nécessaires pour fournir la clarté aux modèles structurels transmis par les données HDX-MS.
Ci-dessous, un protocole détaillé pour le développement d’un essai HDX-MS est présenté20. Les protocoles de préparation de l’échantillon présentés ci-dessous devraient être généralement applicables à toute protéine qui présente une bonne solubilité dans les tampons aqueux. Des méthodes de préparation d’échantillons plus spécialisées et des workflows HDX-MS sont disponibles pour les protéines que nécessaire en présence de détergent ou de phospholipides21,22,23,24. Les paramètres instrumentaux de collecte de données HDX-MS sont décrits pour un spectromètre de masse quadrupole haute résolution couplé au système de chromatographie liquide. Des données d’une complexité et d’une résolution similaires pourraient être recueillies sur l’un ou l’autre d’un certain nombre de systèmes de spectrométrie de masse chromatographie liquide (LC-MS) disponibles dans le commerce. Des aspects clés du traitement des données à l’aide d’un logiciel disponible dans le commerce sont également fournis. Nous présentons également des lignes directrices pour la collecte et l’analyse des données qui sont conformes aux recommandations formulées par l’ensemble de la communauté HDX-MS12. Le protocole décrit est utilisé pour étudier les propriétés structurelles dynamiques de HalM2, une synthétase lanthipeptide qui catalyse la maturation en plusieurs étapes d’un produit naturel peptidique antimicrobien20. Nous montrons comment HDX-MS peut être utilisé pour révéler les sites de liaison du substrat et les propriétés allostériques qui ont échappé à la caractérisation précédente. Plusieurs autres protocoles sur la protéine HDX-MS ont été publiés ces dernières années25,26. Avec le présent travail, ces contributions antérieures devraient fournir au lecteur une certaine flexibilité dans la conception expérimentale.

<table><tbody><tr><td><Réactifs forts></forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib)</td><td>BioBasic</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mL Dispositif de filtration centrifuge Amicon Ultracel 10k (Millipore)</td><td>Milipore Sigma</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>acétonitrile</td><td>Fisher</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>AMP-PNP</td><td>SIGMA</td><td>A2647-25MG</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>SIGMA</td><td>a2383-5G</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>ALDRICH</td><td>435767-100G</td><td></td></tr><tr><td>Acide formique</td><td>Thermo Fisher</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>guanidine-HCl</td><td>VWR</td><td>97063-764</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>SiGMA-Aldrich</td><td>63068-250G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td> <td>de potassium</td> Le peptide de T012500 de chlorhydrate de TCEP BioBasic <td>PB0440</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> a <tr><td></td><td></td><td></td><td>été synthétisé sur demande</td></tr><tr><td>Nom du matériau/de l’équipement</td><td>Company<</td><td>strong>Numéro de catalogue<</td><td>Comments>Description</td></tr><tr><td>software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deuteros</td><td>Andy M C Lau, et al</td><td>version 1.08</td><td></td></tr><tr><td>DynamX</td><td>Waters</td><td>version 3.0</td><td></td></tr><tr><td>MassLynx</td><td>Waters</td><td>version 4.1</td><td></td></tr><tr><td>Protein Lynx Global Server (PLGS)</td><td>Waters</td><td>version 3.0.3</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>Schr&ouml ; dinger</td><td>version 2.2.2</td><td></td></tr><tr><td>Nom du matériel/ de l’équipement</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Instrument et équipement</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC BEH C18 analytique Waters</td><td></td><td>186002346</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pré-colonne</td><td>Eaux</td><td>186003978</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC M-Class HDX System</td><td>Eaux</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HDX Manager</td><td>Waters microtip Électrode</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de pH</td><td>Thermo Fisher</td><td>13-620-291</td><td></td></tr><tr><td>Waters Enzymate BEH column ou Pepsin solumn</td><td>Waters</td><td>186007233</td><td></td></tr><tr><td>Waters Synapt G2-Si</td><td>Eaux</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

une plate-forme de spectrométrie de masse d’échange hydrogène-deutérium (hdx-ms) pour étudier les enzymes biosynthétiques peptidiques

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

La spectrométrie de masse d’échange hydrogène-deutérium (HDX-MS) est une méthode puissante pour la caractérisation biophysique des changements conformationnels enzymatiques et des interactions enzyme-substrat. Parmi ses nombreux avantages, HDX-MS ne consomme que de petites quantités de matière, peut être effectuée dans des conditions quasi natives sans avoir besoin d’étiquetage enzymatique/substrat, et peut fournir des informations spatialement résolues sur la dynamique conformationnelle des enzymes, même pour les grandes enzymes et les complexes multiprotéines. La méthode est initiée par la dilution de l’enzyme d’intérêt dans tampon préparé en D2O. Cela déclenche l’échange de protium dans les amides de liaison peptidique (N-H) avec le deutérium (N-D). Aux points de temps d’échange désirés, les aliquots de réaction sont trempés, l’enzyme est protéolysée en peptides, les peptides sont séparés par chromatographie liquide ultra-performante (UPLC), et le changement de masse de chaque peptide (dû à l’échange d’hydrogène contre du deutérium) est enregistré par la SEp. La quantité d’absorption de deutérium par chaque peptide dépend fortement de l’environnement local de liaison hydrogène de ce peptide. Les peptides présents dans les régions très dynamiques de l’échange d’enzymes deutérium très rapidement, tandis que les peptides dérivés de régions bien ordonnées subissent des échanges beaucoup plus lentement. De cette façon, le taux HDX rend compte de la dynamique conformationnelle des enzymes locales. Les perturbations des niveaux d’absorption du deutérium en présence de différents ligands peuvent ensuite être utilisées pour cartographier les sites de liaison ligand, identifier les réseaux allotériques et comprendre le rôle de la dynamique conformationnelle dans la fonction enzymatique. Ici, nous montrons comment nous avons utilisé HDX-MS pour mieux comprendre la biosynthèse d’un type de peptide produits naturels appelés lanthipeptides. Les lanthipeptides sont des peptides génétiquement codés qui sont modifiés post-translationnellement par de grandes enzymes multifonctionnelles et conformationnelles dynamiques qui sont difficiles à étudier avec les approches traditionnelles de biologie structurale. HDX-MS fournit une plate-forme idéale et adaptable pour étudier les propriétés mécanistes de ces types d’enzymes.

Il est nécessaire d’évaluer la qualité de la digestion protéolytique et la reproductibilité du flux de travail pour chaque ensemble d’injections d’échantillons. Ainsi, avant d’effectuer des essais HDX-MS, il est essentiel d’établir des conditions efficaces pour la protéolyse de la protéine d’intérêt, pour la séparation des peptides à l’aide de la chromatographie liquide de phase inverse et de la mobilité des ions de phase gazeuse, et pour la détection des peptides à l’aide de SP. À cette fin, les échantillons de référenc...

Les synthetases de lanthipeptide catalysent les réactions en plusieurs étapes pendant la biosynthèse des produits naturels peptidiques. Ici, nous décrivons un flux de travail continu, ascendant, de spectrométrie de masse d’échange hydrogène-deutérium (HDX-MS) qui peut être employé pour étudier la dynamique conformationnelle des synthetases de lanthipeptide, aussi bien que d’autres enzymes semblables impliquées dans la biosynthèse de produit naturel de peptide.

Une plate-forme de spectrométrie de masse d’échange hydrogène-deutérium (HDX-MS) pour étudier les enzymes biosynthétiques peptidiques

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and ...

Ce protocole peut fournir des informations spécialement résolues sur la dynamique conformationnelle des protéines. Ce qui peut aider à identifier les régions fonctionnellement importantes dans les protéines d’intérêt. Cette technique sonde la dynamique conformationnelle des protéines dans des conditions proches de leur origine.Sans qu’il soit nécessaire de marquer les protéines à l’aide d’une quantité nanomolaire de matériau pour chaque réaction. Commencez par préparer des échantillons de référence non deutérés pour la protéine d’intérêt en trois exemplaires, dans des tubes de 500 microlitres. Trempez les échantillons avec le volume approprié de tampon de trempe par tube pour obtenir une lecture de pH-mètre de 2,5.Congeler les échantillons dans de l’azote liquide pour les stocker à moins 80 degrés Celsius jusqu’à leur analyse. Analysez ensuite les échantillons de référence enzymatiques protiés à l’aide d’un flux de travail de spectrométrie de masse par chromatographie liquide ascendante conformément aux protocoles standard. Analyser les données brutes de spectrométrie de masse dans le logiciel de protéomique approprié.Accédez à Bibliothèques et banques de données de séquences de protéines pour importer la séquence d’acides aminés de la protéine d’intérêt. Entrez un nom pour la séquence protéique qui vous intéresse et importez la séquence protéique au format FATA. Pour définir les paramètres de traitement dans le menu Bibliothèque, sélectionnez Electrospray MSE comme type d’acquisition de données.Dans le champ Masse de verrouillage pour la charge 2, entrez 785.8426 pour le rapport de charge principal pour les deux ions plus de glucane une fibre sans peptide B et cliquez sur Terminer. Pour définir les paramètres de flux de travail, sélectionnez Electrospray MSE pour le type de recherche. Sous l’en-tête Requête de recherche dans le flux de travail et la base de données, sélectionnez la protéine de base de données créée dans le champ Banque de données et remplacez le réactif de synthèse principal par non spécifique.Pour effacer le champ de réactif de modificateur fixe, maintenez le bouton de contrôle enfoncé tout en cliquant sur Carbamidométhyl C.To spécifiez le répertoire de sortie, sélectionnez Options, Configuration de l’automatisation et Identifier E.Cochez ensuite les cases Sortie 3D apex et peptide 3D et Sortie de comptabilité ionique. Et spécifiez le répertoire souhaité. Pour traiter les données d’échantillon référencées, cliquez avec le bouton droit de la souris sur la plaque de microtitration pour créer une nouvelle plaque.Cliquez avec le bouton gauche de la souris dans un puits et faites-le glisser vers trois autres puits pour mettre en surbrillance un puits pour chaque échantillon référencé. Ensuite, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Ajouter des données brutes. Dans la fenêtre, accédez au répertoire contenant les trois fichiers référencés et sélectionnez les trois fichiers en même temps.Cliquez sur Suivant et sélectionnez les paramètres de traitement définis. Cliquez à nouveau sur Suivant et sélectionnez les paramètres de flux de travail définis. Cliquez ensuite sur Terminer.Une fois que les données brutes, les paramètres de traitement et les paramètres de flux de travail ont été attribués à chaque puits de la plaque, les puits deviennent bleus. Sélectionnez les puits, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Traiter les dernières données brutes. Pour suivre le traitement des données, cliquez sur le coin inférieur droit de la fenêtre.Lorsqu’aucun travail à exécuter n’apparaît, le traitement est terminé et les puits de la plaque de microtitration deviennent verts. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur les puits et sélectionnez Afficher les résultats du flux de travail. Une fenêtre distincte s’ouvre pour chaque fichier de données référencé.Inspectez les données pour vous assurer que la majorité des signaux de spectrométrie de masse dans les données d’échantillon référencées ont été correctement cartographiés avec les peptides prédits à partir de la digestion in silico de la protéine d’intérêt. Les peptides correspondants apparaîtront en bleu dans le spectre de sortie. Double-cliquez sur le filtre OK et vérifiez que le pourcentage de couverture est supérieur à 99 %Importez la sortie du logiciel Protéomique dans le logiciel de traitement d’échange d’hydrogène et de deutérium pour un seuillage supplémentaire.Cliquez ensuite sur Données et importez les résultats PLGS. Cliquez sur l’icône Ajouter et accédez au répertoire approprié pour sélectionner les fichiers de données traités. Cliquez sur Suivant et définissez le nombre minimal d’ions consécutifs sur supérieur ou égal à deux.L’erreur de masse à cinq parties par million. Et le seuil du fichier à trois, puis cliquez sur Terminer. Pour effectuer des réactions d’échange d’hydrogène-deutérium, il faut appliquer un tampon de trempe aliquote dans des tubes de 500 microlitres.Et centrifugez brièvement pour transférer tout le tampon de trempe au fond de chaque tube. Placez les tubes contenant la solution trempée sur de la glace. Ensuite, prémélangez tous les composants de réaction deutérés dans un tube séparé de 1,5 millilitre.Transférez ensuite le mélange réactionnel dans un bain-marie à température contrôlée de 25 degrés Celsius pour une incubation de 10 minutes. Ajoutez de l’enzyme aux composants de la réaction deutérée pour initier la réaction d’échange. Mélangez soigneusement le contenu de la réaction en pipetant de haut en bas.Aux points de temps d’échange expérimentaux appropriés, prélever des aliquotes de 50 microlitres de chaque réaction d’échange d’hydrogène-deutérium. Et mélangez les réactions rapidement et uniformément avec une aliquote de tampon de trempe glacé dans des tubes individuels de 500 microlitres. Ensuite, bouchez immédiatement les tubes pour la congélation instantanée dans de l’azote liquide.Conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être analysés. Après la décongélation des échantillons congelés, analysez les échantillons de référence d’enzymes deutérées à l’aide du même flux de travail de spécification de masse de chromatographie liquide ascendant développé pour les échantillons de référence non deutérés. Après avoir collecté les données LCMS pour les échantillons deutérés, importez les données dans le projet d’échange de deutérium d’hydrogène précédemment créé pour le traitement des données.Cliquez ensuite sur Nouvel état et Nouvelle exposition pour définir les états biochimiques et les durées d’exposition au deutérium respectivement pertinents pour l’analyse. Cliquez sur Nouveau fichier brut pour sélectionner les fichiers de données d’échange d’hydrogène et de deutérium à analyser. Et attribuez les temps d’échange et l’état biochimique appropriés à chaque fichier de données brutes importé.Pour l’analyse et la visualisation des données, sélectionnez le premier peptide dans la liste Peptide et ouvrez le tracé spectral empilé à partir du menu Vues. Cliquez sur la souris pour attribuer et désattribuer des bâtons au besoin afin de vous assurer que la bonne distribution isotopique a été localisée dans les données. Et que chaque pic isotopique a été attribué.Pour vérifier les affectations de bâtons pour chaque état de charge, basculez l’état de charge en haut de la fenêtre de tracé spectral empilé. Pour vérifier l’écart-type des valeurs d’absorption du peptide deutérium dans le menu Vues, sélectionnez la carte de couverture. Qui affiche chaque peptide de la liste des peptides cartographiés le long de la séquence d’acides aminés de la protéine d’intérêt.Colorez les peptides en fonction de l’écart-type relatif et recherchez visuellement sur la carte les peptides aberrants avec un écart-type relatif élevé. Cliquez sur les peptides aberrants dans la carte de couverture pour remplir les tracés spectraux empilés et la fenêtre de la visionneuse de données avec le peptide cible. Affichez la différence d’intérêt dans la carte de couverture et cliquez avec le bouton droit de la souris sur la carte pour exporter les données de différence dans un fichier CSV.Importez les données de différence, d’état et le fichier PDB de la protéine d’intérêt dans Deuteros. Sélectionnez l’intervalle de confiance de 99 % et activez l’option Somme et traitement des données. Ensuite, sous pi mol, sélectionnez Exporter, Absorber et Exporter pour générer un script PyMOL afin de cartographier les régions de différence d’échange significative sur la structure PDB de la protéine d’intérêt dans le logiciel PyMOL.Ces chromatogrammes d’ions totaux représentatifs pour trois échantillons de référence de la peptide synthétase lambda Hal-M2 montrent les changements dépendants du temps de la somme de tous les nombres d’ions à toutes les valeurs du rapport masse/charge incluses dans le balayage spectral de masse. La forme et l’intensité du profil du chromatogramme ionique total doivent être similaires. Indiquant que la digestion protéolytique de Hal-M2 est reproductible.Et est d’une efficacité similaire dans les trois échantillons de référence. Les spectres de masse sur un intervalle de temps donné doivent également être similaires. Cela permet de s’assurer que des peptides similaires sont présents dans chaque échantillon et qu’ils font allusion à des moments similaires à partir de la colonne C18.La plupart des peptides dans les échantillons échangés de deutérium devraient présenter des changements évidents dans leurs distributions isotopiques vers des valeurs de rapport masse/charge plus élevées. Par exemple, ces données indiquent qu’une fraction substantielle du marquage au deutérium a été maintenue tout au long de la collecte de données de trempe acide, de digestion de la pepsine et de spectrométrie de masse par chromatographie liquide. Après caractérisation des propriétés biochimiques de l’enzyme telles qu’elles ont été démontrées, des résultats représentatifs de spectrométrie de masse par échange d’hydrogène-deutérium peuvent être générés.Illustrer la liaison du peptide précurseur Hal-A2 au complexe AMP, PMP de Hal-M2. Les réactions d’échange d’hydrogène et de deutérium doivent être préparées et trempées de manière constante. Et vous devez être méthodique lorsque vous déterminez les valeurs d’échange de deutérium pour de nombreux peptides détectés.La spectrométrie de masse par échange d’hydrogène et de deutérium fournit des informations au niveau des peptides et des changements dynamiques de conformation des protéines. La pertinence fonctionnelle de tout échange d’hydrogène-deutérium doit être validée pour Meter Genesis. Et les dosages d’activité orthogonale.

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MALDI-TOF spectrométrie de masse a été utilisé avec succès pour contrôler l'amide d'hydrogène / deutérium de change dans la protéine kinase PAK2 activation.

Amide hydrogène / deutérium Analyse Bourse &amp; MALDI-TOF spectrométrie de masse de PAK2 activation

conformation des protéines et la dynamique sont essentielles pour comprendre la relation entre la structure et la fonction des protéines. l'échange d'hydrogène couplé à haute résolution spectrométrie de masse est une méthode polyvalente pour étudier la dynamique conformationnelle des protéines ainsi que la caractérisation de la protéine-ligand et des interactions protéine-protéine, y compris les interfaces de contact et des effets allostériques.

Analyser la dynamique des protéines en utilisant l&#39;hydrogène change spectrométrie de masse

Ici, nous présentons des protocoles détaillés pour la spectrométrie de masse par échange d’hydrogène/deutérium amide à l’état solide (ssHDX-MS) et la spectrométrie de masse de marquage photolytique à l’état solide (ssPL-MS) pour les protéines dans les poudres solides. Les méthodes fournissent des informations à haute résolution sur la conformation et les interactions des protéines à l’état solide amorphe, ce qui peut être utile dans la conception de formulations.

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flexibilité conformationnelle joue un rôle essentiel dans la fonction des protéines. Nous décrivons ici l'utilisation de la spectrométrie de masse à ionisation par électronébulisation couplée à l'échange hydrogène-deutérium résolue dans le temps pour sonder les changements structurels rapides qui favorisent la fonction des protéines ordonné et désordonné.

Résolue en temps d&#39;échange hydrogène Ionisation ElectroSpray-deuterium spectrométrie de masse pour l&#39;étude de la structure des protéines et dynamique

Une des conditions de stress plus difficiles que les organismes se rencontrent au cours de leur vie implique l’accumulation d’oxydants. Au cours du stress oxydatif, cellules s’appuient fortement sur chaperons moléculaires. Nous présentons ici les méthodes utilisées pour enquêter sur l’oxydo-réduction-anti-agrégation activité réglementée, aussi bien quant à surveiller les changements structurels régissant la fonction d’accompagnateur à l’aide de HDX-MS.

Définition d’activité réglementée Redox chaperon de Hsp33 et de cartographie des changements conformationnels sur Hsp33 à l’aide de la spectrométrie de masse d’hydrogène deutérium Exchange

Présenté ici est un protocole pour une approche d’échange hydrogène/deutérium (HDX) basée sur l’électrophorèse capillaire couplée à une spectrométrie de masse descendante. Cette approche caractérise la différence dans les structures d’ordre supérieur entre différentes espèces de protéines, y compris les protéines dans différents états et différentes protéoformes, en effectuant une séparation différentielle simultanée HDX et électrophorétique.

Échange hydrogène/deutérium basé sur l’électrophorèse capillaire pour la caractérisation conformationnelle des protéines avec spectrométrie de masse descendante

L’ensemble structurel de l’alpha-synucléine monomérique affecte sa fonction physiologique et ses propriétés physico-chimiques. Le présent protocole décrit comment effectuer une spectrométrie de masse à échange hydrogène/deutérium milliseconde et des analyses de données ultérieures pour déterminer des informations conformationnelles sur le monomère de cette protéine intrinsèquement désordonnée dans des conditions physiologiques.

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des gouttelettes lipidiques sont des organelles importantes pour la replication de plusieurs agents pathogènes, y compris le virus de l'hépatite C (VHC). Nous décrivons un procédé pour isoler des gouttelettes lipidiques pour la spectrométrie de masse quantitative des protéines associées; il peut être utilisé dans une variété de conditions, telles que l'infection par le virus, le stress environnemental ou un traitement médicamenteux.

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