CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascoycete Huntiella omanensis

Notre protocole est important parce qu’il permet aux chercheurs travaillant sur des champignons non modèles d’établir des technologies d’édition du génome de pointe dans leurs laboratoires. Comme il ne repose pas sur les techniques existantes, telles que les systèmes d’expression, ce protocole a l’avantage d’être plus facile à établir dans les systèmes non modèles. Cette méthode peut être utilisée à travers différentes espèces de champignons et peut être utilisée pour élucider les fonctions des gènes impliqués dans l’accouplement des voies, la croissance et la pathogénicité.

Ainsi, lors de l’exécution de cette procédure, il faut être sûr d’avoir suffisamment de jours consécutifs afin de rivaliser avec le protocole car il ya seulement quelques points dans l’expérience à laquelle il peut être mis en pause. Pour récolter la conidie, filtrer la culture liquide à travers une couche de tissu stérile de laboratoire en tubes centrifugeuses de 50 millilitres pour la centrifugation. Resuspendez la pastille conidia en cinq millilitres d’eau et visualisez un aliquot de 10 microlitres de la solution conidia sous un microscope léger à un grossissement de 40X pour confirmer que seules les conidies ont été récupérées.

Ensuite, ajoutez 200 millilitres de bouillon frais d’extrait de malt de 1 % à un flacon de 500 millilitres et transférez tout le volume de conidie dans le flacon. Puis incuber la culture liquide jusqu’à 12 heures dans un incubateur de 25 degrés Celsius secouant à 120 révolutions par minute. Pour récolter les germes, transférer la culture dans des tubes de centrifugeuse de 50 millilitres pour centrifugation et réutiliser les germes jusqu’à 10 millilitres d’un sorbitol molaire.

Ajouter un millilitre de solution de germination à diverses concentrations de solution enzymatique et incuber la solution enzymatique spore pendant deux à trois heures dans l’incubateur secouant à 80 révolutions par minute. Pour récolter les protoplastes, filtrer la solution enzymatique à travers une couche de tissu stérile de laboratoire et recueillir les protoplastes par centrifugation. Puis résuspendez soigneusement la pastille protoplastique dans 200 microlitres de tampon STC et vérifiez un aliquot de 10 microlitres de la solution au microscope pour confirmer que seuls les protoplastes ont été récupérés.

Pour commencer la transformation, combiner environ cinq fois 10 à six protoplastes avec un seul volume de solution ribonucléoprotéine et environ six microgrammes du fragment d’ADN du donneur. Ensuite, utilisez une pipette pour couler lentement et uniformément un millilitre de solution 30% PTC fraîchement préparée sur la suspension protoplastique pour créer une couche hydrophobe sur les protoplastes et incuber la solution pendant 20 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, ajouter cinq millilitres de milieu de commande osmotique à la suspension protoplastique, en pipetant lentement et doucement pour bien mélanger la solution.

Après le mélange, couver la solution protoplastique dans l’incubateur secouant à 80 révolutions par minute pendant la nuit. Le lendemain matin, divisez la solution entre cinq plaques de culture de 60 millimètres. Ajouter 10 millilitres d’agar moyen de contrôle osmotique complété par 30 microgrammes par millilitre d’Hygromycine B à chaque assiette et faire pivoter lentement chaque assiette pour mélanger.

Laisser la première couche d’agar à régler avant d’ajouter 10 millilitres d’agar moyen de contrôle osmotique complété par 40 microgrammes par millilitre d’Hygromycine B deux par plaque. Après avoir permis à la deuxième couche d’agar de se fixer, incuber les cultures à 25 degrés Celsius jusqu’à ce que l’on puisse observer des isolats simples se développer à travers les deux couches d’agar. Pour récupérer les isolats transformés avec succès, transférez les isolats individuels capables de croissance aux plaques d’agar d’extrait de malt frais complétées par 50 microgrammes par millilitre d’hygromycine B.To évaluent les effets de la perturbation génétique ciblée sur les capacités hétérothalliques du champignon, co-inoculent le milieu d’agar d’extrait de malt frais avec une souche mutante aussi bien qu’une souche du type opposé d’accouplement.

Lorsque vous travaillez avec H.omanensis, couvrez mais ne scellez pas les plaques. Placer les assiettes à température ambiante pendant sept jours. À la fin de l’incubation, évaluer visuellement la production de structures sexuelles.

Pour tester les capacités homotalliques de la souche mutante, inoculer le milieu de l’agar extrait de malt frais avec la souche mutante d’intérêt et incuber la plaque à température ambiante pendant une semaine comme démontré. Pour évaluer les effets de la perturbation sur le taux de croissance du champignon à l’étude, insérez l’arrière d’une grande pointe stérile de pipette dans les bords activement croissants de la culture de chaque souche mutante et sauvage d’intérêt pour créer des bouchons d’agar recouverts de mycéliales et inoculer le milieu d’agar d’extrait de malt frais. Au moins trois répliques doivent être faites par type de culture.

Après trois jours de croissance à 20 degrés Celsius, mesurer la croissance de chaque plaque sur deux diamètres perpendiculaires. Conidia utilisé comme matériau de départ pour le protocole sont autorisés à germer et à croître jusqu’à ce qu’ils deviennent de jeunes germes. Notez que les brins mycéliales matures comme ceux-ci sont trop matures pour la dégradation et ne doivent pas être utilisés.

Lorsque les cellules n’ont plus de parois cellulaires, elles deviennent très sensibles aux perturbations mécaniques et libèrent des protoplastes ronds qui peuvent être récoltés pour la transformation. Le succès du protocole peut être confirmé sur une analyse phénotypique des souches mutantes. Pour cet isolat mutant mat 127, le taux de croissance radiale végétative a été sensiblement réduit, suggérant un effet pléiotrope pour le nouveau gène d’accouplement.

En outre, l’isolat mutant était incapable de compléter un cycle sexuel produisant seulement des structures sexuelles immatures qui n’ont pas produit de spores sexuelles par rapport à l’isolat de type sauvage qui a complété l’ensemble du cycle sexuel dans les quelques jours suivant l’incubation. L’ARN est très sensible et se dégrade très facilement. Par conséquent, un environnement de travail propre et le travail rapide sur la glace sont tous deux essentiels au succès de cette expérience.

Une fois que l’isolat mutant a été généré avec succès, ils peuvent être soumis à l’analyse phénotypique ou ARN-seq comme approprié pour le gène caractérisé.