Minimiser l’hypoxie dans les tranches hippocampales des souris adultes et vieillissantes

Il s’agit d’un protocole pour la préparation des tranches aiguës de l’adulte et le vieillissement hippocampi souris qui tire parti de la perfusion transcardique et la coupe de tranches avec la glace-froid NMDG-aCSF pour réduire les dommages hypoxiques au tissu. Les tranches qui en résultent restent en bonne santé pendant de nombreuses heures et conviennent aux corrections à long terme et aux enregistrements sur le terrain.

Le protocole présenté ici diminue les dommages hypoxiques excessifs pendant la préparation des tranches hippocampal adultes et vieillissantes de souris, éliminant ainsi un obstacle majeur pour étudier la fonction des circuits neuronaux mûrs et vieillissants. L’introduction de l’hypothermie dans les solutions sans sodium entraîne des tranches hippocampiques qui sont en bonne santé jusqu’à 10 heures après la coupe et appropriées pour les enregistrements sur le terrain à long terme et les études patch-clamp. Cette méthode de préparation des tranches hippocampiques pourrait être particulièrement pertinente pour les modèles animaux dans les maladies neurodégénératives qui, par définition, nécessitent une préparation vieillissante du cerveau.

L’étape la plus critique de ce protocole est l’introduction de l’hypothermie par profusion transcardique avec une solution glacée. Avec une certaine pratique, les chercheurs seront en mesure d’exécuter cette étape de manière fiable. Commencez par préparer un litre de solution aCSF pour la chambre de récupération et les enregistrements ultérieurs.

Préparez ensuite 300 millilitres de NMDG-aCSF pour la profusion transcardique et les étapes de coupe. Placez le plateau vibrant de coupe de microtome et le disque de montage dans un congélateur de moins 20 degrés Celsius. Pour préparer la chambre de récupération, remplissez-la juste au-dessus de la maille de fixation de tranche et commencez le bubbler gardant la chambre sur le banc à température ambiante.

Réfrigérer les 300 millilitres entiers de NMDG-aCSF dans un congélateur jusqu’à ce que des cristaux de glace commencent à se former à la surface et sur les parois de la bouteille. Placez la bouteille avec réfrigérée et NMDG-aCSF sur la glace et bouillonnez-la, en gardant la solution entre zéro et deux degrés Celsius. Sortez le disque de montage tissulaire du congélateur et essuyez-le à sec, si nécessaire.

Découpez un bloc de 5% d’agar de la taille d’un cerveau de souris et collez-le au centre du disque à l’aide d’une fine couche de colle cyanoacrylate. Placez le disque avec une agar collée sur la glace et couvrez-le avec du papier absorbant jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi. Sortez le plateau de coupe du congélateur, placez-le dans la microtome, puis entourez-le de glace et chargez la lame.

Préparez tous les outils à l’avance pour la dissection du cerveau. Installez la pompe périssaltique pour la perfusion transcardique. Insérez un côté du tube de pompe dans la bouteille avec du NMDG-aCSF glacé et adaptez l’autre côté avec une aiguille de calibre 27.

Réglez la vitesse de la pompe à environ 3,5 millilitres par minute. À cette vitesse, la sortie d’un NMDG-aCSF est un voyage rapide, pas un flux continu. Placez la souris sur le dos sur une couche.

Avant de continuer, a confirmé que la souris est à un plan chirurgical de l’anesthésie en effectuant une pincement des pieds. La souris doit être insensible, puis scotchée sur ses pattes avant et arrière afin que la poitrine et l’abdomen soient exposés. Découpez une grande tache de la peau sur la poitrine, allant du dessous du sternum à la gorge.

Prenez le sternum avec des forceps, soulevez-le doucement et commencez à couper à travers la cage thoracique des deux côtés jusqu’à ce que la cavité thoracique soit exposée. Couper à travers le diaphragme, en laissant le rabat de la cage thoracique attachée par un mince morceau de muscle. Il devrait être possible de le mettre de côté sans le faire retoissez sur la cavité thoracique exposée.

Vérifiez que le cœur bat encore et assurez-vous que la majeure partie du foie est visible. Insérez l’aiguille dans le ventricule gauche, qui semble plus léger en couleur que la droite. Pour stabiliser l’aiguille, conduisez-la à travers les côtes restantes sur le côté gauche du corps.

Localisez l’atrium droit de couleur rouge foncé et coupez-le à l’aide de petits ciseaux. Le sang devrait commencer à couler. Démarrez la pompe et observez le foie, qui changera de couleur du rouge au brun.

Surveillez la couleur du foie et continuez la perfusion jusqu’à ce que le foie brun pâle. Faire fonctionner la pompe encore quelques minutes. La température corporelle de l’animal devrait tomber à 28 à 29 degrés Celsius et son nez doit être froid au toucher.

Décapiter la souris avec de grands ciseaux de décapitation, puis utiliser un scalpel avec une lame numéro 10 pour ouvrir la peau sur le dessus du crâne. Avec de petits ciseaux inclinés, couper le crâne à la ligne médiane. Ensuite, utilisez les trois forceps numéro trois pour éloigner les moitiés droite et gauche du crâne, en prenant soin de prendre le dura loin avec elle.

Retirez le cerveau, qui devrait être d’une couleur blanc éteint en le ramassant à l’aide d’une spatule et déposez-le dans la solution NMDG-aCSF sur la glace. Laissez-le là jusqu’à une minute. Sortez le cerveau du NMDG-aCSF et placez-le sur un morceau de papier filtre.

Couper et enlever un coin de tissu de 60 degrés avec un outil à 60 degrés centré à la ligne médiane de l’extrémité rostrale du cerveau antérieur. Utilisez les côtés coupés de la surface de montage car il fournit l’angle approprié pour les tranches hippocampiques. Séparez les hémisphères vers le bas de la ligne médiane avec le scalpel et collez-les sur le disque de montage.

Prenez le disque de montage de la glace et essuyez-le à sec, si nécessaire. Collez ensuite chaque hémisphère devant le bloc d’agar, coupez le côté vers le bas. Assurez-vous que les côtés ventraux des deux hémisphères touchent le bloc d’agar et que les côtés dorsal des deux hémisphères font face à la lame.

Lorsqu’il est collé sur le côté coupé, chaque hémisphère doit être orienté par rapport à la lame d’une manière qui assure des tranches transversales de l’hippocampe dorsale in situ. Submergez le disque avec les hémisphères dans une chambre de coupe contenant du NMDG-aCSF carbogenated glacé. Couper une section de 400 micromètres, puis utiliser une pipette de transfert jetable avec une pointe de coupure pour transférer la tranche dans une chambre de récupération contenant du NMDG-aCSF carbogenated à température ambiante.

Continuez à couper le reste des sections et à les transférer à la chambre de récupération en ne prenant pas plus de 10 minutes pour couper un total de huit à dix tranches de la région dorsale de l’hippocampe. Incuber les tranches à température ambiante pendant environ deux heures avant l’enregistrement. Ce protocole a été utilisé pour générer des tranches hippocampiques à partir de souris adultes.

Un grand nombre de cellules pyramidales dans le champ CA1 et subiculum apparaissent en faible contraste, une caractéristique des cellules saines, lorsqu’elles sont observées sous microscopie à contraste différentiel infrarouge. Les enregistrements patch-clamp peuvent être obtenus à partir de neurones CA1 de souris âgées de plus de six mois. Dans l’exemple d’expérience ici, la fréquence des courants postsynaptiques excitateurs miniatures a été mesurée après que NMDA-LTD ait été induit par rapport aux conditions de contrôle.

La fréquence des courants postsynaptiques excitatifs miniatures était plus faible dans les neurones après une induction de NMDA-LTD, indiquant l’élagage dépendant de l’activité des synopses dans CA1. Des changements dans l’amplitude n’ont pas été détectés. Au cours des enregistrements mEPSC, les cellules CA1 ont également été remplies de biocytine et intacte tonnelle dendritique et habitus cellulaire sain des neurones pyramidaux peuvent être vus ici.

Une distribution robuste du colorant fluorescent dans toute la cellule permet l’analyse des dendrites et des épines dendritiques dans différentes conditions. Une potentialisation à long terme, ou LTP, des synapses CA3-CA1 d’environ 170 % a été observée, ce qui suggère que le maintien des cascades de signalisation nécessaires au LTP est présent dans les tranches préparées à partir de souris adultes. Un signal potentiel excitateur robuste sur le terrain suggère que la connectivité réseau a également été préservée.

Deux aspects critiques du protocole sont la profusion transcardique avec une solution glacée pour induire l’hypothermie et l’introduction d’un NMDG comme substitut d’ion de sodium dans des solutions pour empêcher l’oedème cytotoxique. En utilisant ces précautions, des tranches aiguës peuvent être préparées à partir de n’importe quelle région du cerveau. En outre, les tranches préparées de cette manière peuvent être utilisées pour l’imagerie par calcium et tension à l’aide d’une microscopie à deux photons ou à champ large.

Ce protocole pourrait servir de base à une préparation normalisée pour les tranches hippocampiques aiguës des animaux vieillissants et ainsi faciliter des comparaisons entre les études dans le contexte des mécanismes neurodegenerative de maladie.