Injections de nymphes et d’adultes pour l’arNi et l’édition de gènes CRISPR chez Nasonia vitripennis

Ici, nous décrivons les méthodes d’injections pupales et adultes efficaces dans Nasonia vitripennis comme des alternatives accessibles à la microinjection embryonnaire, permettant l’analyse fonctionnelle des gènes d’intérêt en utilisant soit le silence de l’ARN via l’interférence ARN (ARNi), soit l’élimination du gène via l’édition du génome CRISPR / Cas9.

La recherche sur des modèles d’insectes non canoniques, comme la guêpe parasitoïde, est limitée car la micro-injection embryonnaire est très difficile. Notre méthode contourne ce problème, permettant des mutations germinales spécifiques au site et héréditaires. L’injection de pupes ou de femelles adultes est rapide et élimine la nécessité d’un équipement coûteux ou d’une formation spécialisée nécessaire pour réaliser des micro-injections embryonnaires réussies.

Cette technique ne permettra à aucun laboratoire spécialisé qui n’a pas accès à un équipement coûteux de faire des études fonctionnelles chez toute espèce d’insecte qu’ils utilisent comme modèle. Après l’optimisation, cette méthode peut être utilisée pour étudier la génétique fonctionnelle de nombreux autres gènes dans Nasonia. Nous pensons également que cette méthode peut être utilisée pour délivrer des acides nucléiques pour la transformation génétique de Nasonia ou d’autres insectes.

Commencez par installer environ 20 femelles accouplées individuellement dans de petits tubes à essai en verre bouchés avec du coton. Ajoutez deux hôtes S. bullata par tube et maintenez les guêpes à 25 degrés Celsius et 30 % d’humidité relative avec un cycle d’obscurité légère de 12:12 pendant deux à trois jours. Après deux à trois jours, retirez délicatement les femelles à l’aide d’une brosse à pointe fine pour éviter une surposition continue et une synchronisation dans le développement de la progéniture.

Les femelles retirées peuvent éventuellement être réhébergées ou stockées à cinq degrés Celsius pendant un mois maximum. Maintenir l’hôte parasité à 25 degrés Celsius et à 30 % d’humidité relative avec un cycle d’obscurité de 12:12 pendant sept jours si le stade d’injection souhaité nécessite des pupes blanches, pendant 13 jours, si le stade de développement requis est des pupes noires, ou 14 jours pour les jeunes adultes nouvellement émergés. Lorsque le stade désiré est atteint, ouvrez le puparium de l’hôte avec une aiguille de dissection pour récupérer les pupes et les adultes de N. vitripennis.

Préparez une diapositive de verre en appliquant une ligne de colle scolaire au centre. Étalez la colle avec l’aiguille de dissection pour obtenir une couche épaisse, qui servira à aligner les nymphes. Laissez sécher la colle pendant environ deux minutes avant de transférer les nymphes.

À l’aide d’un microscope à dissection, utilisez une aiguille à dissection pour appliquer de la colle à l’arrière de la tête de la nymphe. Fixez la chrysalide à la couche de colle sur la diapositive avec son abdomen vers le haut. Alignez 20 à 30 pupes côte à côte sur la lame.

Placez la lame avec les pupes et une boîte de Pétri pour laisser la colle rouler pendant environ 10 minutes. Avant de commencer les injections, testez l’adhérence des pupes à la colle en les poussant doucement avec l’aiguille de dissection. Si la plupart des pupes sont détachées, préparez une nouvelle lame.

Vous pouvez également retirer toutes les pupes libres et procéder à l’injection de celles qui sont correctement fixées à la lame. Chargez un tube de verre capillaire dans un extracteur d’aiguille et tirez les aiguilles en suivant les instructions du fabricant. Chargez l’aiguille avec cinq microlitres du mélange d’injection préparé à l’aide des pointes de pipette du microchargeur.

Ouvrez l’aiguille en faisant glisser la pointe sur une surface faite de deux lames qui se chevauchent. Vous pouvez également ouvrir la pointe de l’aiguille à l’aide d’une paire de pinces fines pour créer un bord tranchant. Placez la lame avec les pupes alignées sous un microscope à dissection, puis insérez l’aiguille dans le tube d’injection du femtojet et serrez la tête de préhension.

En regardant l’aiguille au microscope, allumez le femtojet et réglez les paramètres de pression de compensation et de pression d’injection en tournant les boutons rotatifs. Insérez soigneusement l’aiguille entre le deuxième et le troisième segment abdominal visible avec un angle vertical d’environ 30 degrés. Injecter avec un flux continu jusqu’à ce que tout l’abdomen devienne vert dans le cas des pupes blanches ou jusqu’à ce que l’abdomen augmente de taille dans le cas des pupes noires.

Arrêtez d’injecter lorsqu’il est clair que l’abdomen ne peut plus prendre de liquide ou lorsque le liquide commence à s’écouler hors du corps. Déplacez-vous avec précaution vers la nymphe suivante et répétez ces étapes. Transférez la lame avec les pupes injectées dans une boîte de Pétri.

Couvrez le plat avec son couvercle et placez-le à 25 degrés Celsius jusqu’à l’émergence des guêpes. Pour la préparation adulte, séparez des groupes de 20 femelles vierges dans un petit tube à essai propre avec un pinceau fin. Placez une lame de verre sur de la glace et alignez la femelle côte à côte sur la lame froide, l’abdomen vers le haut sous une lunette de dissection.

Chargez une aiguille avec la solution de ribonucléoprotéine à l’aide d’une pointe de microcharge et insérez l’aiguille dans le paquet de connecteur de l’ensemble de tube d’aspirateur. Soutenez les femelles du côté opposé avec des aiguilles de dissection émoussées, tout en injectant lentement dans l’abdomen. Évitez de toucher l’ovipositeur.

Cela endommagera gravement cette structure reproductrice critique. Insérez soigneusement l’aiguille entre le deuxième et le troisième segment abdominal visible avec un angle vertical d’environ 30 degrés. Injecter la solution dans l’abdomen féminin, en s’arrêtant lorsqu’il n’y a plus de liquide ou lorsqu’une fuite de l’excès de solution est observée.

Déplacez-vous avec précaution vers la femelle suivante et répétez ces étapes. Lorsque vous avez terminé, transférez doucement une femelle injectée une seule fois dans un nouveau tube avec un hôte à l’aide d’un pinceau. Laissez-les récupérer à température ambiante pendant environ une heure, confirmez la survie et remettez les tubes dans l’incubateur d’élevage.

Après l’éclosion adulte des pupes injectées, placez les guêpes simples dans un verre à boucher avec du coton et insérez un hôte S. bullata. Pour les expériences d’inactivation CRISPR/Cas9, permettez aux femelles de parasiter l’hôte pendant une journée et de remplacer l’hôte chaque jour pendant trois jours consécutifs. Placez l’hôte parasité, réglez à 25 degrés Celsius jusqu’à l’émergence de la progéniture mâle G0, environ 13 à 14 jours.

Sous un microscope à dissection, dépister les mâles G0 pour les phénotypes mutés. Le gène du cinabre est responsable de la pigmentation des yeux. Les guêpes aux yeux bruns sont de type sauvage et les guêpes aux yeux rouge vif ou aux variations entre les yeux rouges et bruns sont des mutants.

Ce protocole peut être utilisé pour la micro-injection de nymphes ou d’adultes. Les taux de survie de cette procédure varient de 15 à 100 %. Lors de l’injection de pupes ou de femelles adultes, l’aiguille doit être tranchante et être introduite de manière à ce que le liquide ne s’échappe pas immédiatement après l’injection.

Si cela se produit, retirez l’aiguille, assurez-vous que la pointe est fine et tranchante, changez-la si nécessaire ou injectez-la à un autre endroit. Une analyse fonctionnelle peut être effectuée sur le gène d’intérêt ciblé par cette procédure. Cela répondra à une question sur la fonction du gène et si le gène est nécessaire pour le phénotype spécifique étudié.