Name: Transpupillaire Imagerie in vivo à deux photons de la rétine de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Découvrez l'imagerie in vivo à deux photons de la rétine de souris pour étudier les maladies ophtalmologiques et la fonction rétinienne normale. Cette méthode permet une visualisation haute résolution des cellules ganglionnaires rétiniennes et de leurs axones.

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Ce travail a été soutenu par des subventions de la Research to Prevent Blindness Foundation (Career Development Award à P.R.W. et une subvention sans restriction au Département d’ophtalmologie et de sciences visuelles de la Washington University School of Medicine à St. Louis), National Glaucoma Research (un programme de la Fondation BrightFocus) et le McDonnell Center for Cellular and Molecular Neurobiology. Z.W. est soutenu par un prix de service national de recherche institutionnel T32 EY013360. Ce travail a également été soutenu par le Hope Center Viral Vectors Core de la faculté de médecine de l’Université de Washington.

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La procédure d’imagerie à deux photons décrite ici permet une imagerie longitudinale in vivo de la rétine de la souris. Des images reproductibles de la même région de la rétine peuvent être obtenues pendant une période continue allant jusqu’à 6 h ou plus sous isoflurane. La souris peut également être imagée à différents jours à l’aide de repères cellulaires et vasculaires pour localiser la même zone d’imagerie (Figure 3). L’utilisation d’une immersion en gel transparent combinée à un verre de couverture à cette fin a déjà été appliquée à une gamme de procédures, y compris la visualisation de la rétine pour l’injection sous-rétinienne, les modèles de lésions rétiniennes induites par laser et l’imagerie du fond d’œil20,21,22.
L’anatomie de l’œil présente des défis uniques pour l’imagerie in vivo, car la puissance optique élevée de la cornée et du cristallin de la souris empêche l’imagerie directe à travers la pupille sans correction. Plusieurs autres méthodes d’imagerie in vivo reposent sur l’utilisation d’une lentille de contact plano-concave pour la correction de l’optique antérieure de l’œil de souris 7,17,18,19. Avec seulement une correction optique au niveau de la cornée, la puissance optique élevée de la lentille de la souris entraîne une quantité inévitable de parallaxe, en particulier de structures dans le champ de balayage périphérique, se manifestant par un étirement et un mouvement de translation dans la dimension X-Y à différents plans Z. Pour minimiser la distorsion liée à la parallaxe de l’image en dimensions X et Y, il est essentiel que l’œil de souris soit orienté de telle sorte que le plan tangent à la rétine au niveau de la zone d’imagerie soit perpendiculaire au trajet de la lumière du microscope. La configuration décrite ici est propice à une manipulation précise de l’angle de l’œil pour obtenir cet alignement. Un porte-tête de souris réglable qui permet une rotation le long de deux axes permet des ajustements manuels faciles de l’angle de l’œil lorsque l’expérimentateur fait défiler la dimension Z pour minimiser la parallaxe. Cette inclinaison contourne également l’effet d’arrêt de champ de la pupille pour permettre l’imagerie de plus grandes zones de la rétine. La retenue du support de tête réduit également considérablement les artefacts de mouvement causés par la respiration.
Il faut veiller à maintenir la clarté de l’œil de la souris, car la qualité de l’image se détériorera avec l’opacification pendant l’imagerie continue. La réapplication fréquente de gel lubrifiant pendant l’imagerie et l’application de pommade après chaque séance d’imagerie aident à empêcher l’œil de sécher et de développer des opacités. Certaines opacités cornéennes disparaîtront spontanément après 24-48 h. L’utilisation de gel transparent et de verre de couverture telle que décrite dans ce protocole permet une qualité d’image et une correction d’aberration similaires à celles d’une lentille de contact7, tout en permettant des ajustements plus faciles de l’angle oculaire sans qu’il soit nécessaire de réaligner le verre de couverture. De plus, le gel fournit une hydratation continue à l’œil, ce qui permet d’effectuer des séances d’imagerie aiguë allant jusqu’à plusieurs heures. Enfin, comme le verre de couverture n’entre pas en contact avec la cornée, il provoque une irritation minimale de l’œil qui peut réduire la clarté optique pour des séances d’imagerie répétées.
Une limite de cette approche est le fait que les aberrations optiques ne sont pas entièrement corrigées. Bien que cela diminue considérablement la résolution axiale en raison de la parallaxe lourde, des mesures quantitatives du soma peuvent être obtenues dans des plans à image unique. Il convient de noter que comme l’intensité du signal de fluorescence des neurones rétiniens dépend de l’alignement des échantillons avec cette méthode, les capteurs basés sur le rapport d’excitation et d’émission sont plus appropriés pour les expériences comparant des échantillons de manière chronique à travers différentes sessions d’imagerie. Une approche pour corriger les aberrations optiques au niveau du système est l’optique adaptative, qui permet une résolution subcellulaire dans la rétine 8,9,14,21. Cependant, l’optique adaptative nécessite un équipement hautement spécialisé et une vaste expertise à mettre en œuvre.
Les approches alternatives à l’imagerie rétinienne in vivo à deux photons sont la microscopie confocale ou l’ophtalmoscopie6. L’approche présentée ici devrait être facilement transposable à la microscopie à grand champ ou confocale. L’imagerie monophotonique est peut-être plus robuste et présente moins de risques d’endommager la rétine en raison de la haute énergie du laser à deux photons nécessaire pour obtenir un effet efficace à deux photons à travers la cornée et le cristallin. Pour éviter les dommages causés par le laser à deux photons, le seuil de puissance laser maximale doit être déterminé empiriquement en examinant les rétines entières après l’achèvement des expériences d’imagerie et d’immunomarquage pour les types de cellules dans les couches imagées. Dans le système présenté ici, les CGR étaient étiquetés avec le marqueur pan-RGC, Rbpms, et les densités étaient normales jusqu’à une puissance d’imagerie de 45 mW, tandis que 55 mW causaient une perte importante de CGR (non illustré).
Un inconvénient de l’imagerie monophotonique est le fait que cette approche stimulera très fortement les circuits visuels natifs de la rétine par rapport à l’imagerie biphotonique23. Des expériences antérieures utilisant des montures entières rétiniennes ou des préparations d’œillets ont montré que le balayage laser à deux photons provoque une activation du circuit qui est en grande partie transitoire24. Ici, l’imagerie de l’activité du RGC avec le capteur Ca 2+ Twitch2b montre que le début du balayage laser induit des élévations Ca 2+, qui reviennent à la ligne de base au cours de5-20 s dans la plupart des RGC (Figure 8). Étant donné que la puissance laser dans ce protocole se situe dans la gamme des expériences précédentes rapportant une réponse lumineuse rétinienne in vivo8, la méthode actuellement décrite se prête probablement à des enregistrements de l’activité des circuits dans la rétine. De telles considérations sont importantes pour les expériences qui peuvent être influencées par l’activité du circuit.
Ce protocole démontre l’imagerie in vivo de deux types de neurones rétiniens, les RGC et les cellules amacrines. Un marquage similaire d’autres types de cellules majeures peut être réalisé, y compris les cellules horizontales (Cx57-Cre 25), les cellules bipolaires (Chx10-Cre 26; mGluR6-GFP27), les photorécepteurs coniques (S- ou M-opsin-Cre 28), les photorécepteurs en bâtonnets (Nrl-Cre29), la glie de Müller (Foxg1-Cre 26) et les péricytes (NG2-DsRed9). Des souris transgéniques sont également disponibles pour marquer des sous-ensembles discrets de CGR (p. ex., KCNG4-Cre pour αRGCs30; OPN4-Cre pour ipRGCs31; JAM-B-CreER pour les J-RGCs 32) et les cellules amacrines (par exemple, ChAT-Cre pour les cellules amacrinesstarburst 26 et les pilotes promoteurs de neuropeptides pour divers sous-types de cellules amacrines 3,34). Les vecteurs viraux peuvent être utilisés pour cibler des populations cellulaires spécifiques au lieu de souris transgéniques. Injections intravitréennes d’AAV2 avec un élément promoteur CAG omniprésent marquent presque exclusivement les CGR, les cellules amacrines et les cellules horizontales25. L’association de la capside AAV2.7m8-Y444F modifiée avec une construction promotrice mGluR6 modifiée permet un large marquage des cellules bipolaires ON35. Les injections sous-rétiniennes d’AAV conduisent à un enrichissement des photorécepteurs, le sérotype AAV2/5 ayant l’efficacité de transduction la plus élevée36. Shh10, une protéine de capside AAV6 modifiée, associée à des éléments promoteurs de protéines acides fibrillaires gliales, a été démontrée spécifique pour la glie de Müller37.
La capacité d’observer les cellules du système nerveux central avec une approche complètement non invasive peut être utilisée pour étudier à la fois les propriétés de base des circuits neuronaux8, ainsi que les mécanismes de la neurodégénérescence 3,4,5,6,38. De nombreuses maladies cécitantes ciblent les populations cellulaires de la rétine, et des approches d’imagerie in vivo chez la souris ont été utilisées pour étudier les lésions du nerf optique 1,3,4, la dégénérescence maculaire13, l’accident vasculaire cérébral5, le glaucome 2,6 et l’uvéite 7. En outre, de nombreuses affections neurodégénératives du système nerveux central se manifestent dans la rétine, notamment la maladie d’Alzheimer39, la sclérose en plaques40 et la maladie de Parkinson41. Par conséquent, cette technique facilement accessible pour l’imagerie in vivo de la rétine peut être appliquée comme un outil pour étudier un large éventail de maladies neurodégénératives.

La visualisation in vivo du système nerveux central nécessite généralement des procédures invasives telles que l’amincissement du crâne et l’installation de fenêtres en verre ou de lentilles relais optiques. La rétine est la seule structure du système nerveux qui peut être directement observée sans avoir besoin d’une préparation invasive car elle reçoit nativement la lumière de l’environnement. La facilité d’accès optique à la rétine en fait un système modèle attrayant pour l’étude du système nerveux central.
L’imagerie fluorescente vivante de la rétine chez la souris a été utilisée pour suivre la mort du CGR dans des modèles de glaucome 1,2, de lésion du nerf optique 1,3,4 et d’accident vasculaire cérébral5, ainsi que les changements dans l’activation microgliale 6,7,8 et le système vasculaire 9 dans des conditions dégénératives. Les signaux intrinsèques peuvent également être utilisés pour visualiser les photorécepteurs 10,11,12 et les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes 13. De nombreuses approches de l’imagerie in vivo de la rétine utilisent soit des dispositifs hautement spécialisés spécifiquement conçus à des fins ophtalmologiques6, soit des systèmes optiques hautement modifiés pour corriger les aberrations natives de la cornée et du cristallin 8,9,11,12,13,14.
Le présent protocole démontre une approche de l’imagerie in vivo des signaux fluorescents dans la rétine à la résolution cellulaire, en utilisant une méthode de base de correction partielle de l’optique antérieure de l’œil de souris. Cette stratégie nécessite des adaptations très mineures aux configurations de microscope multiphotonique qui sont couramment utilisées pour l’imagerie in vivo du cerveau. Comme cette approche est simple à mettre en place et que les souris sont peu stressées, elle est propice à la réalisation d’expériences en accéléré sur des durées aiguës et chroniques. De plus, les procédures génétiques et à base de colorants organiques qui marquent les composants rétiniens individuels, y compris les CGR, les cellules amacrines, la microglie et le système vasculaire, sont compatibles avec cette technique d’imagerie et permettent l’observation in vivo des types de cellules et des structures critiques pour la fonction rétinienne. Ces outils peuvent être adaptés pour marquer la plupart des autres types de cellules neuronales ainsi que les composants gliaux et vasculaires de la rétine.

<table><tbody><tr><td>#1.5 lamelle ThermoFisher</td><td></td><td>152440</td><td>Richard-Allan #1.5 Seringue en verre de 24 mm x 40 mm</td></tr><tr><td>50 mL</td><td>Hamilton</td><td>80950</td><td>22G aiguille cimentée</td></tr><tr><td>Virus adéno-associé (AAV2)</td><td>Hope Center Viral Core</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à air d’anesthésie</td><td>RWD Life Science</td><td>R510-30</td><td></td></tr><tr><td>Atropine</td><td>Sigma</td><td>A0132</td><td>Pour la pupille solution de dilatateur</td></tr><tr><td>Appareil d’anesthésie de base pour petits animaux</td><td>RWD Life Science</td><td>R500IE</td><td></td></tr><tr><td>Verre borosilicaté capillaire</td><td>Sutter</td><td>B150-86-10</td><td>Diamètre extérieur 1,50 mm, diamètre intérieur 0,86 mm, longueur 10 cm</td></tr><tr><td>CFP/YFP cube de filtre</td><td>Chroma</td><td>custom</td><td>480/40, 505 long pass, 535/30</td></tr><tr><td>ChromoFlex - Unité de détection PMT à deux canaux</td><td>Scientifica</td><td>S-MPLG-1002</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à chaleur circulante</td><td>Braintree Scientific</td><td>tp-700</td><td>Réglée à 37 &deg ; C</td></tr><tr><td>Film alimentaire</td><td>VWR</td><td>10713-916</td><td></td></tr><tr><td>Porte-filtre compact</td><td>ThorLabs</td><td>DH1</td><td>Maintient la lamelle sur l’œil</td></tr><tr><td>de souris souris transgéniques Cx3cr1-GFP (B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>005582</td><td></td></tr><tr><td>Châssis du contrôleur DAQ</td><td>National Instruments</td><td>PXIe-1073</td><td></td></tr><tr><td>Périphérique d’acquisition de données</td><td>National Instruments</td><td>BNC-2090A</td><td></td></tr><tr><td>Evans Blue dye</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1677409</td><td></td></tr><tr><td>Module FPGA avec numériseur</td><td>National Instruments</td><td>NI-5734</td><td></td></tr><tr><td>Appareil d’évacuation de gaz</td><td>RWD Life Science</td><td>R546W</td><td></td></tr><tr><td>GenTeal Gel pour les yeux lubrifiant sévère&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Alcon</td><td>(de la pharmacie locale)</td><td>Pour une utilisation lors de l’imagerie</td></tr><tr><td>GFP/Cube de filtre rouge</td><td>Chroma</td><td>custom</td><td>535/30, 560 long pass, 605/70</td></tr><tr><td>Coussin chauffant</td><td>McKesson Medical and Surgical</td><td>190147</td><td></td></tr><tr><td>HyperScope Launch Optics pour une utilisation avec Pockels Cell</td><td>Scientifica</td><td>S-MP-101080</td><td></td></tr><tr><td>HyperScope Module principal</td><td>Scientifica</td><td>S-MP-100466</td><td></td></tr><tr><td>HyperScope Scan Path</td><td>Scientifica</td><td>S-MP-100406</td><td></td></tr><tr><td>HyperScope X galvo Module</td><td>Scientifica</td><td>MP-100443</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Fiji software</td><td></td><td>Freeware</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson Veterinary</td><td>NDC 14043-704-06</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane filtre à gaz cinner (balayage actif)</td><td>RWD Life Science</td><td>R510-31</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à gaz isoflurane (balayage passif)</td><td>RWD Life Science</td><td>R510-31S</td><td></td></tr><tr><td>kétamine HCl (100 mg/mL)</td><td>Vedco</td><td>NDC 50989-161-06</td><td></td></tr><tr><td>Adaptateur M32 vers M26</td><td>Logiciel GUI ThorLabs</td><td>M32M26S</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai</td><td>Spectra-Physics</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>NA</td><td>R2015b</td></tr><tr><td>méloxicam (5 mg/mL)</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>NDC 0010-6013-01</td> Micorscope <td>analgésique</td></tr><tr><td>Objectif</td><td>Edmund Optics</td><td>46-404</td><td>Extracteur de micropipettes Mitutoyo WE715042319</td></tr><tr><td></td><td>Sutter Flaming</td><td>/Brown Modèle P-97</td><td></td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>Fisher</td><td>BP2629-1</td><td></td></tr><tr><td>Pince hémostatique Mini bulldog Fine</td><td>Science Tools</td><td>18053-28</td><td></td></tr><tr><td>Tube EVA miniature 0.02 » ID, 0.06 » OD</td><td>McMaster Carr</td><td>1883T1</td><td></td></tr><tr><td>Tube EVA miniature 0.05 » ID, 0.09 » OD</td><td>McMaster Carr</td><td>1883T4</td><td></td></tr><tr><td>Support de tête de souris</td><td>Narishige</td><td>SGM-4</td><td></td></tr><tr><td>No. 5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Poteaux optiques 1/2"</td><td>ThorLabs</td><td>TR3-P5</td><td></td></tr><tr><td>Kit de wattmètre optique</td><td>ThorLabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>pE-300 Ultra LLG Deivery</td><td>Scientifica</td><td>COO-LED3ULLG</td> Chlorhydrate de <td></td></tr><tr><td>phényléphrine</td><td>Sigma</td><td>P6126</td><td>Pour solution de dilatateur pupillaire</td></tr><tr><td>Cellule Pockels</td><td>Conoptiques</td><td>350-80-02</td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur de cellule Pockels</td><td>Conoptiques</td><td>Modèle 302RM</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de proparacaïne</td><td>Sigma</td><td>1571001</td><td>Pour l’immobilisation oculaire</td></tr><tr><td>Rouge & Filtre passe-court Far Red Cube</td><td>Chroma</td><td>custom</td><td>560 Passe-court</td></tr><tr><td>rotatif 1/2" pince de poteau</td><td>ThorLabs</td><td>SWC</td><td></td></tr><tr><td>ScanImage package</td><td>Vidrio Technologies</td><td>Logiciel</td><td>d’acquisition d’images gratuit ; la version 5.4.0 (2018) ; nécessite une</td></tr><tr><td>solution de chlorure de sodium MATLAB, stérile (0,9 %)</td><td>Fresenius Kabi</td><td>NDC 63323-186-01</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Leica</td><td>S9 E</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de table</td><td>Oxford</td><td>Benchmate C8</td><td></td></tr><tr><td>Terramycine oxytétracycline/polymyxine B antibiotique pommade ophtalmique</td><td>Zoetisus</td><td>NA</td><td>À utiliser après injection</td></tr> <tr><td>intravitréenneSystème de refroidissement ThermoRack</td><td>Systèmes de refroidissement à semi-conducteurs</td><td>ThermoRack 401</td><td>réglé sur 20 &deg ; C</td></tr> Souris transgéniques <tr><td>ultrarapides Ti :Sapphire</td><td>Laser Spectra-Physics</td><td>Mai Tai DeepSee</td><td></td></tr><tr><td>Vgat-Cre (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>016962</td><td></td></tr><tr><td>souris transgéniques VGlut2-Cre (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>016963</td><td></td></tr><tr><td>VivoScope for In Vivo Imaging</td><td>Scientifica</td><td>S-MPVS-1200-00P</td><td></td></tr><tr><td>Huile de vaseline blanche, huile minérale, lubrifiant, pommade pour les yeux</td><td>, Stevel</td>, <td>NA</td>, <td>À utiliser après l’imagerie</td></tr><tr><td>de la xylazine HCl (20 mg/mL)</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-110-20</td><td></td></tr></tbody></table>

transpupillaire imagerie in vivo à deux photons de la rétine de souris

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

La rétine transforme les signaux lumineux de l’environnement en signaux électriques qui se propagent au cerveau. Les maladies de la rétine sont répandues et provoquent une déficience visuelle et la cécité. Comprendre comment ces maladies progressent est essentiel pour formuler de nouveaux traitements. La microscopie in vivo dans des modèles animaux de la maladie est un outil puissant pour comprendre la neurodégénérescence et a conduit à des progrès importants vers le traitement de maladies allant de la maladie d’Alzheimer à l’accident vasculaire cérébral. Étant donné que la rétine est la seule structure du système nerveux central intrinsèquement accessible par des approches optiques, elle se prête naturellement à l’imagerie in vivo. Cependant, l’optique native du cristallin et de la cornée présente certains défis pour un accès efficace à l’imagerie.
Ce protocole décrit des méthodes d’imagerie in vivo à deux photons de cohortes cellulaires et de structures dans la rétine de la souris à résolution cellulaire, applicables aux expériences d’imagerie de durée aiguë et chronique. Il présente des exemples d’imagerie des cellules ganglionnaires de la rétine (RGC), des cellules amacrines, microgliales et vasculaires à l’aide d’une série de techniques de marquage, notamment des vecteurs de virus adéno-associés (AAV), des souris transgéniques et des colorants inorganiques. Il est important de noter que ces techniques s’étendent à tous les types de cellules de la rétine et que des méthodes suggérées pour accéder à d’autres populations cellulaires d’intérêt sont décrites. Vous trouverez également des exemples de stratégies de post-traitement manuel d’images pour l’affichage et la quantification. Ces techniques sont directement applicables aux études de la fonction rétinienne dans la santé et la maladie.

Diverses approches de marquage de colorants transgéniques, viraux ou inorganiques peuvent être utilisées pour visualiser spécifiquement plusieurs types et structures de cellules rétiniennes in vivo à l’aide d’une simple adaptation d’un microscope multiphotonique de base. Pour visualiser les CGR et les cellules amacrines, les souris transgéniques VGlut2-Cre et VGat-Cre, respectivement, ont reçu une injection intravitréenne d’une construction d’expression AAV dépendante de Cre codant pour Twitch2b, un capteur Ca 2+ basé sur le transfert d’énergie par résonance de fluorescence cytoplasmique (FRET) qui contient des protéines fluorescentes cyan et jaune (CFP et YFP, respectivement) et le domaine de liaison Ca2+ de la troponine15 . Chez les souris VGlut2-Cre, les somas RGC sont clairement discernables et les fascicules des axones sont souvent apparents (Figure 3).
Il convient de noter que la trajectoire des axones et l’image négative du système vasculaire rendent très simple l’identification de la tête du nerf optique chez les souris VGlut2-Cre, ce qui est utile comme point de repère dans les expériences d’imagerie chronique (Figure 3). Bien que les cellules amacrines semblent moins brillantes que les CGR, peut-être en raison de leur taille de soma plus petite et / ou de leur transduction AAV moins efficace, leurs somas sont toujours facilement apparents dans la couche nucléaire interne. Contrairement aux CGR, les neurites des cellules amacrines sont plus souvent observées dans les couches plexiformes internes (Figure 4). La microglie rétinienne peut être imagée dans la lignée de souris transgéniques Cx3cr1-GFP6. Les microglies s’associent au système vasculaire, ce qui permet de retrouver la même région dans des expériences d’imagerie time-lapse.
Cette approche peut être utilisée pour suivre la dynamique des processus microgliaux fins, une procédure qui a une meilleure résolution spatiale dans les images à plan unique, ou si des projections d’intensité maximale sont préparées en se concentrant sur des cellules individuelles (Figure 5). La faible résolution axiale causée par l’aberration optique à travers la lentille de la souris empêche l’examen des détails fins dans la dimension z. Pour déterminer si cette technique d’imagerie permet d’observer des changements dégénératifs dans l’ultrastructure cellulaire, 1 μL de 50 mM de N-méthyl-D-aspartate (NMDA) a été injecté dans le vitré pour induire une lésion excitotoxique. Un jour après l’injection, la microglie a montré des processus courts ou une morphologie amiboïde (Figure 5) conformément aux rapports précédents16. Il convient de noter que les cellules de la lignée transgénique Cx3cr1-GFP présentaient une expression de protéines fluorescentes plus uniforme et complète dans la cohorte cellulaire que dans les expériences de livraison médiée par AAV de cassettes d’expression de protéines fluorescentes. Les avantages d’un étiquetage varié et clairsemé par rapport à un étiquetage complet et uniforme doivent être pris en compte lors de la conception des expériences.
Pour marquer le système vasculaire rétinien comme décrit précédemment8, des souris ont été injectées par voie intrapéritonéale avec 200 μL de colorant bleu Evans (20 mg / mL dans une solution saline stérile) 30 à 60 minutes avant l’imagerie. Cela a conduit à un fort marquage des vaisseaux sanguins émanant de la tête du nerf optique (Figure 6). Étonnamment, le signal fluorescent d’une seule injection a persisté pendant au moins sept jours. Deux méthodes distinctes ont été utilisées pour estimer les dimensions des images in vivo. Tout d’abord, les mêmes régions rétiniennes ont été imagées in vivo et après fixation dans des montures rétiniennes entières aplaties à l’aide de la microscopie confocale (Figure 7). Des paires de cellules aléatoires ont été sélectionnées à partir de quatre échantillons in vivo différents, et la distance réelle entre les paires de cellules a été mesurée dans des balayages confocaux et appariée à la distance de pixels in vivo pour obtenir une taille moyenne de pixels de 0,99 μm avec un grossissement numérique 1x. L’utilisation de méthodes similaires corrélant des images in vivo avec des balayages confocaux complets a révélé qu’une seule position de la tête permet d’imager sur une plaque de rétine d’environ 650 mm2 .
Le repositionnement du support de tête le long d’un axe de torsion peut permettre d’accéder à une région linéaire de la rétine de 2,2 mm de longueur (non représentée). De plus, des microsphères fluorescentes de 1 ou 2 μm de diamètre ont été injectées dans les yeux de souris et leur diamètre a été mesuré en largeur pleine largeur demi-maximum de balayages linéaires à partir d’images in vivo avec zoom numérique 10x. Cela a donné une estimation de la taille des pixels légèrement plus grande, mais avec plus de variance (Figure 7). Dans l’ensemble, l’imagerie confocale d’échantillons entiers après la fin des expériences in vivo est la méthode la plus cohérente pour attribuer une échelle à des images individuelles, car la variance des propriétés de la cornée et de la lentille peut modifier l’échelle de l’image d’un échantillon à l’autre.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig1v2.jpg"> Figure 1 : Schéma du chemin de lumière. Les composants de base du microscope à deux photons utilisés dans ce protocole consistent en une cellule Pockels pour moduler la puissance laser, une paire de lentilles pour réduire le diamètre du faisceau laser afin de correspondre à l’ouverture arrière de l’objectif du microscope et une paire de miroirs à balayage galvo pour la direction du faisceau. Une paire de rétroviseurs est présente avant chaque composant optique majeur. La mise au point est contrôlée par un moteur qui entraîne le montage de l’objectif. Le trajet de la lumière d’émission peut être personnalisé pour différents fluorophores en remplaçant les filtres dichroïques et barrières. Une configuration générale pour l’imagerie cyan/jaune/rouge est affichée dans laquelle un miroir dichroïque passe-court dirige la lumière rouge vers le premier PMT, et un miroir dichroïque passe-long associé à des filtres passe-bande appropriés est utilisé pour séparer les émissions cyan et jaune. Abréviation : PMT = tube photomultiplicateur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig1v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig2v2.jpg"> Figure 2 : Positionnement des souris pour l’imagerie in vivo. Pour positionner la souris avec la pupille sur l’axe avec le trajet de la lumière, la souris anesthésiée est d’abord retenue dans un support de tête, la tête est tournée et inclinée, une grosse goutte de gel lubrifiant pour les yeux est placée sur l’œil et la souris est placée sur la scène. Un capset est monté dans le porte-couvercle perpendiculaire au trajet de la lumière et abaissé vers l’œil. Le bordereau de couverture ne doit pas entrer en contact avec la cornée ou la tête de souris (à gauche), ce qui sera évident si le capot est dévié. Cependant, la lamelle de couverture doit également être suffisamment proche pour éviter la déformation de la gouttelette (à droite), car cela aura un effet démagnifiant sur l’échantillon. Après avoir appliqué l’immersion de gel et fixé la lamelle de couverture, la platine doit être déplacée directement sous l’objectif du microscope. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig2v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig3v3.jpg"> Figure 3 : Imagerie des cellules ganglionnaires de la rétine. Pour l’affichage de l’image, des projections d’intensité maximale avec les plans z contenant des cellules d’intérêt sont créées, et les images résultantes sont filtrées médianes pour éliminer le bruit de prise de vue PMT. Deux exemples de cellules ganglionnaires de la rétine marquées par injection d’AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b à des souris transgéniques VGlut2-Cre sont présentés, en particulier le signal CFP. Les images ont été acquises lors de séances à quatre jours d’intervalle, et des repères vasculaires ont été utilisés pour revenir dans la même région près de la tête du nerf optique. La tête du nerf optique est orientée vers le bas de l’image. Bien que les deux échantillons montrent une certaine variance dans l’orientation (les régions avec une intensité réduite sont indiquées par des flèches), la plupart des cellules sont présentes aux deux points temporels. Barre d’échelle = environ 50 μm. Abréviations : PMT = tube photomultiplicateur; AAV = virus adéno-associé; EF1α = facteur d’allongement 1alpha; FLEX = flip-excision; VGlut2 = transporteur vésiculaire du glutamate 2; CFP = protéine cyan fluorescente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig3v3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig5v2.jpg"> Figure 4 : Imagerie des cellules amacrines. Les cellules amacrines ont été marquées en injectant AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b à des souris transgéniques VGat-Cre. Le signal CFP de Twitch 2b est spécifiquement affiché. De petites projections d’intensité maximale axées sur les profondeurs de la couche nucléaire interne indiquent des somas de cellules amacrines, tandis que se concentrer sur le plexiforme interne résout les neurites des cellules amacrines (flèche). La tête du nerf optique est orientée vers la droite de l’image. Barre d’échelle = environ 50 μm. Abréviations : AAV = virus adéno-associé; EF1α = facteur d’allongement 1alpha; FLEX = flip-excision; VGat = transporteur vésiculeux d’acide gamma aminobutyrique; CFP = protéine cyanfluorescente; INL = couche nucléaire interne; IPL = couche plexiforme interne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig5v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig4v2.jpg"> Figure 5 : Microglie d’imagerie. La lignée de souris transgéniques Cx3cr1-GFP a été utilisée pour marquer la microglie. Une projection d’intensité maximale du volume de balayage complet montre de nombreuses microglies, certaines avec des détails de processus fins qui peuvent être résolus. Notez que les cellules vers le bas à gauche du champ ont moins de distorsion dans la projection maximale que celles vers le haut à droite en raison de la parallaxe dans cette région. Les projections d’intensité maximale ne contenant que la cellule d’intérêt réduisent considérablement cette parallaxe (centre, encadrée dans les couleurs correspondantes). De plus, cette stratégie d’imagerie peut documenter la dynamique du remodelage du processus de microglie fine (panneaux inférieurs). Comparativement, de nombreuses microglies peuvent être observées avec des processus courts ou une morphologie amiboïde un jour après une lésion excitotoxique par injection intravitréenne de 50 mM NMDA (à droite). Barre d’échelle = environ 50 μm. Abréviations : GFP = protéine fluorescente verte; Cx3cr1 = récepteur 1 de chimiokine Cx3; NMDA = N-méthyl-D-aspartate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig4v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig6v2.jpg"> Figure 6 : Étiquetage des repères vasculaires. Des souris ont reçu 200 μL de bleu Evans à 20 mg/mL par voie intrapéritonéale 30 à 60 minutes avant la première séance d’imagerie. Les projections d’intensité maximale de pleine épaisseur démontrent une fluorescence durable dans le système vasculaire rétinien qui a persisté pendant au moins sept jours. Barre d’échelle = environ 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig6v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig7v2.jpg"> Figure 7 : Dimensions de l’image. Les cellules ganglionnaires de la rétine marquées par injection d’AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b à des souris transgéniques VGlut2-Cre ont été imagées in vivo, et la même région a ensuite été imagée par microscopie confocale à balayage laser après fixation et préparation complète de la rétine. Le canal protéique fluorescent jaune est indiqué pour les deux. Les paires de flèches colorées indiquent la même cellule dans les deux préparations (panneaux supérieurs). Image monoplan de microsphères fluorescentes de 2 μm de diamètre injectées par voie intravitréenne et imagée in vivo (panneau inférieur gauche). Les microsphères ne se sont pas déposées et étaient donc en mouvement constant, ce qui rendait impossible la mesure de la résolution axiale. Tailles de pixels calculées à partir de mesures demi-maximales pleine largeur de microsphères fluorescentes in vivo ou de mesures confocales corrélatives prises à partir de 2 à 4 rétines par groupe (en bas à droite). Barre d’échelle = 50 μm. Abréviations : AAV = virus adéno-associé; EF1α = facteur d’allongement 1alpha; FLEX = flip-excision; VGlut2 = transporteur vésiculaire du glutamate 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig7v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig8v2.jpg"> Figure 8 : Activité calcique induite par le balayage à deux photons. Cellules ganglionnaires rétiniennes marquées par injection d’AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b à des souris transgéniques VGlut2-Cre, YFP est pseudocoloré magenta et CFP vert, imagé dans un seul plan comme une série chronologique à 4,22 Hz. Tous les RGC avaient un ratio YFP/CFP de départ similaire. La plupart ont répondu par une augmentation du rapport FRET (à l’exclusion de la cellule orange), et un a maintenu un rapport YFP/CFP élevé tout au long de la série chronologique (cellule jaune). Les rapports YFP/CFP ont été normalisés à la moyenne de la première image, et les cercles colorés correspondent aux traces colorées. Les astérisques indiquent des points temporels avec des images représentatives affichées à gauche. Barre d’échelle = 20 μm. Abréviations : AAV = virus adéno-associé; EF1α = facteur d’allongement 1alpha; FLEX = flip-excision; VGlut2 = transporteur vésiculaire du glutamate 2; YFP = protéine fluorescente jaune; CFP = protéine cyanfluorescente; RGC = cellules ganglionnaires de la rétine; FRET = transfert d’énergie par résonance de fluorescence. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig8v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

L’imagerie in vivo est un outil puissant pour l’étude de la biologie dans la santé et la maladie. Ce protocole décrit l’imagerie transpupillaire de la rétine de la souris avec un microscope standard à deux photons. Il démontre également différentes méthodes d’imagerie in vivo pour marquer par fluorescence plusieurs cohortes cellulaires de la rétine.

Transpupillaire Imagerie in vivo à deux photons de la rétine de souris

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Cette méthode d’imagerie in vivo des cellules rétiniennes permet d’étudier les maladies ophtalmologiques et de comprendre les fonctions normales de la rétine. Cette méthode fournit une approche simple et hautement reproductible de l’imagerie in vivo de la rétine par microscopie à deux photons. Une stabilisation correcte de la souris est essentielle pour obtenir des images in vivo de qualité.Entraînez-vous à placer la souris dans le support de tête et familiarisez-vous avec la procédure avant d’essayer d’acquérir des images. Sédater l’animal conformément au protocole d’utilisation approuvé de l’animal. Appliquez la solution de dilatation des pupilles et laissez la souris dans l’obscurité pendant cinq minutes pour permettre aux pupilles de se dilater.Fixez la broche du conduit auditif inférieur en position étendue vers l’intérieur et la broche du conduit auditif supérieur en position retirée. Faites pivoter le bras principal du support de tête jusqu’à ce que la barre de l’écouteur soit inclinée à un angle de 60 degrés au-dessous de l’horizontale. Avec la souris face à la barre de morsure, montez une oreille sur la broche inférieure étendue avec la broche insérée dans le conduit auditif.Après avoir desserré la vis fixant la goupille du conduit auditif supérieur, étendez la broche dans l’autre conduit auditif et serrez à nouveau la vis pour fixer la tête. Assurez-vous que la souris est bien fixée dans le support de tête. Appuyez sur le dessus de la tête.La souris doit rester solidement dans les barres d’oreille et sa tête doit tourner librement autour de l’axe des conduits auditifs. Avec la barre de morsure positionnée vers la tête de la souris, surlevez doucement la tête de la souris pour permettre aux incisives maxillaires d’être abaissées dans le porte-barre de morsure et rétractez la barre de morsure avec une force douce pour sécuriser la tête. Utilisez la vis pour fixer la barre de morsure en position et placez la souris et le support sur la platine du microscope.Appliquez des gouttes oculaires lubrifiantes sur les deux yeux de la souris. Faites pivoter le bras principal du support de tête jusqu’à ce que la pupille d’un œil soit orientée en fonction du trajet de la lumière et placez un couvercle numéro 1,5 dans le porte-filtre compact. Après avoir fixé le support à l’étage du microscope, abaissez la lamelle de couverture jusqu’à ce qu’elle entre en contact avec le gel lubrifiant pour les yeux sans toucher la cornée, et ajustez la platine dans la dimension X-Y et la position Z de l’objectif jusqu’à ce que la lumière d’excitation à grand champ recouvre complètement la cornée.Utilisez l’oculaire pour continuer à ajuster la position Z jusqu’à ce que les cellules fluorescentes ou les structures de la rétine entrent en ligne de compte, augmentant ainsi l’illuminateur d’épifluorescence si nécessaire pour résoudre les cellules ou les structures d’intérêt individuelles. Affiner l’alignement de la rétine avec le trajet de la lumière d’imagerie. Ajustez l’angle de la tête jusqu’à ce que seule l’expansion ou la contraction de la lumière floue se produise lors de la modification du plan focal, minimisant ainsi les distorsions X-Y.Ensuite, éteignez l’illuminateur d’épifluorescence et fermez l’obturateur de l’illuminateur. Pour l’imagerie à deux photons, suivez tous les protocoles de sécurité laser institutionnels. Éteignez et couvrez toute la lumière ambiante, et basculez le chemin de la lumière d’excitation vers le laser et le chemin de la lumière d’émission vers les PMT.Dans le logiciel d’acquisition d’images, définissez la taille de l’image sur 512 par 512 et la moyenne de l’image sur trois. Réglez le pas en Z pour qu’il commence en haut de la pile et progresse vers le bas, minimisant ainsi l’activation laser à deux photons des photorécepteurs. Allumez et activez les PMT, et réglez la tension à 680 volts.Activez les obturateurs d’imagerie et d’émission. Commencez un aperçu de l’image en direct du tissu cible, en commençant par une puissance laser de 1 %, et ajustez automatiquement la luminosité de l’écran pour visualiser les cellules ou les structures d’intérêt. Si le tissu cible est sombre ou peu clair, augmentez le pourcentage de puissance laser jusqu’à ce que les structures deviennent visibles sans dépasser 45 milliwatts.Manœuvrez l’étage du microscope dans la direction X-Y pour vous centrer sur une zone d’imagerie souhaitée et naviguez vers le plan Z avec les structures d’intérêt dans la mise au point. Pour une expérience de time-lapse chronique, ouvrez une image précédemment obtenue pour l’utiliser comme référence pour les cellules d’intérêt, en veillant à ce que l’angle d’imagerie dans l’image actuelle soit similaire à celui des images précédentes. Ensuite, accédez aux plans Z supérieurs et inférieurs d’intérêt pour définir les limites Z de la pile d’images et acquérir l’image.Lorsque toutes les images ont été acquises, désactivez les PMT et l’obturateur laser. Basculez le chemin de la lumière d’excitation sur l’éclairage d’épifluorescence et le chemin de la lumière d’émission vers l’oculaire. Ensuite, quittez le logiciel d’acquisition d’images, éteignez le laser dans l’interface de l’ordinateur et arrêtez le matériel dans l’ordre de démarrage inverse, à l’exception de l’équipement toujours actif.À la fin de l’analyse, retirez la souris du support de tête et utilisez un mouchoir non pelucheux pour retirer délicatement le gel pour les yeux. Ensuite, appliquez une pommade oculaire lubrifiante sur les deux yeux et placez la souris sur un coussin chauffant de circulation d’eau chaude de 37 degrés Celsius avec surveillance jusqu’à la position couchée complète, avant de remettre la souris dans son boîtier. Chez les souris VGlut-2-Cre, les somas des cellules ganglionnaires de la rétine sont clairement discernables et les fascicules axonaux sont souvent apparents.La trajectoire des axones et l’image négative du système vasculaire facilitent l’identification de la tête du nerf optique chez les souris VGlut-2-Cre, ce qui est utile comme point de repère dans les expériences d’imagerie chronique. Contrairement aux cellules ganglionnaires de la rétine, les neurites des cellules amacrines sont plus souvent observées dans les couches plexiformes internes. Un jour après l’injection intraoculaire de NMDA, la microglie rétinienne présente des processus courts ou une morphologie amiboïde conformément aux rapports précédents.L’administration du colorant bleu Evans par une seule injection intrapéritonéale 30 à 60 minutes avant l’imagerie induit un fort marquage des vaisseaux sanguins émanant de la tête du nerf optique qui persiste pendant au moins sept jours. Après fixation, la distance réelle entre les paires de cellules dans les montures entières rétiniennes aplaties peut être mesurée par balayage confocale et comparée à des distances de pixels in vivo pour déterminer la taille moyenne des pixels des images in vivo. Les microsphères fluorescentes injectées dans les yeux de souris permettent de mesurer le diamètre de la microsphère in vivo, ce qui donne une estimation de la taille des pixels légèrement plus grande mais avec plus de variance.L’imagerie in vivo peut être associée à des analyses histologiques telles que l’immunomarquage et l’hybridation in situ. Ces méthodes permettent d’identifier des types cellulaires spécifiques et d’examiner l’expression génique de cellules imagées.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Source : Wang, Z., et al. Imagerie transpupillaire à deux photons in vivo de la rétine de souris.  J. Vis. Exp. (2021). Cette vidéo présente une technique d’imagerie rétinienne in vivo utilisant la microscopie à deux photons. Les souris anesthésiées sont préparées pour l’imagerie en fixant leur tête, en appliquant un lubrifiant pour les yeux et en plaçant une lamelle sur l’œil. Les cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) exprimant des protéines fluorescentes sont d’abord visualisées à l’aide...

Imagerie in vivo à deux photons de la rétine de la souris

Source : Bosco, A., et al.  In vivo Dynamique de l’activation microgliale rétinienne au cours de la neurodégénérescence : imagerie ophtalmoscopique confocale et morphométrie cellulaire dans le glaucome de souris. J. Vis. Exp. (2015) Cette vidéo montre l’imagerie in vivo de la microglie rétinienne dans un modèle murin de glaucome. Une souris transgénique avec une microglie rétinienne exprimant des protéines fluorescentes est positionnée sous un ophtalmoscope. L’éclairage infrarouge est utilisé...

Imagerie in vivo de la microglie rétinienne dans un modèle murin de glaucome

Source : Jongbloets, B. C., et al. Visualisation de l’activité de la protéine kinase A chez des souris ayant un comportement fixe à l’aide de la microscopie d’imagerie à vie à vie à fluorescence à deux photons in vivo. (2019){{}} Cette vidéo présente une procédure de microscopie d’imagerie à vie de fluorescence à deux photons pour visualiser l’activité de la protéine kinase A chez des souris ayant un comportement fixe pendant la locomotion forcée.

Visualisation de l’activité de la protéine kinase A chez une souris à l’aide de la microscopie d’imagerie à vie par fluorescence à deux photons 

Source : Jagodzinska, J., et. al., Tomographie par cohérence optique : imagerie des cellules ganglionnaires rétiniennes de souris In Vivo. J. Vis. Exp. (2017)  Dans cette vidéo, nous démontrons l’utilisation de la tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral (SD-OCT) pour imager les couches rétiniennes et évaluer les changements structurels dans un modèle de souris génétiquement modifié avec neuropathie optique.

Imagerie in vivo de la rétine de souris par tomographie par cohérence optique

Source : Mizuno, H., et al. In Vivo Imagerie à deux photons des neurones corticaux chez les souris néonatales. J. Vis. Exp. (2018)Cette vidéo présente l’utilisation de la microscopie à deux photons pour imager les neurones dans le cerveau d’un bébé souris transgénique anesthésié. Le laser à deux photons permet une imagerie plus profonde avec une résolution spatiale élevée et une diffusion minimale de la lumière, ce qui permet de capturer en détail la morphologie neuronale, y compris les...

Microscopie à deux photons pour l’imagerie de la morphologie neuronale chez un bébé souris

Source : Nishimura, C.  et al. Quantification de l’architecture vasculaire cérébrale à l’aide de la microscopie à deux photons dans un modèle murin de neuroinflammation induite par le VIH. J. Vis. Exp. (2016). Cette vidéo démontre la visualisation in vivo des capillaires corticaux dans le cerveau de la souris à l’aide de la microscopie à deux photons. Il décrit les étapes à suivre pour injecter un colorant fluorescent dans une souris anesthésiée avec une fenêtre corticale crânienne mince,...

 Microscopie à deux photons pour l’imagerie in vivo de la microvascularisation du cerveau de souris 

Source : Kulkarni, M. et al. Imagerie Ca2+ Dynamique dans les terminaux axonaux des photorécepteurs coniques de la rétine de la souris. J. Vis. Exp. (2015)Cette vidéo montre l’utilisation de la microscopie à deux photons pour surveiller la dynamique calcique dans les photorécepteurs coniques d’une rétine de souris transgénique. Il décrit les étapes de préparation des coupes rétiniennes, d’imagerie des biocapteurs de calcium basés sur FRET et d’analyse des changements de fluorescence pour...

Microscopie à deux photons pour la surveillance de la dynamique calcique dans les photorécepteurs coniques rétiniens de souris

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Simultanée à deux photons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie d&#39;entrées synaptiques et les cibles postsynaptiques dans le Cortex Souris rétrosplénial

Nous présentons ici l’utilité de longitudinal en vivo imagerie dans le suivi des modifications morphologiques de la néovascularisation choroïdienne induite par laser chez les souris.

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La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) permet une imagerie sans étiquette des biomolécules en fonction de leur vibration intrinsèque de liaisons chimiques spécifiques. Dans ce protocole, la configuration instrumentale d’un SRS intégré et d’un microscope à fluorescence à deux photons est décrite pour visualiser les structures cellulaires dans la moelle épinière de souris vivantes.

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Microscopie intravitale à deux photons du poumon de souris transplanté

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Transpupillaire Imagerie in vivo à deux photons de la rétine de souris

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