Name: Évaluation des mesures fonctionnelles de la santé des muscles squelettiques dans les microtissus musculaires squelettiques humains (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Découvrez la fabrication et l'analyse de microtissus musculaires humains 3D avec la plateforme MyoTACTIC. Cette méthode permet des mesures répétées de force contractile et de transients calciques pour la biologie musculaire et le criblage de molécules.

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Nous tenons à remercier Mohammad Afshar, Haben Abraha, Mohsen Afshar-Bakooshli et Sadegh Davoudi d’avoir contribué à l’invention de la plateforme de culture MyoTACTIC et d’avoir établi les méthodes de fabrication et d’analyse décrites ici. HL a reçu un financement d’un programme de formation en génie du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie (CRSNG) en génie et en entrepreneuriat d’organes sur puce et d’une bourse d’études supérieures Wildcat de l’Université de Toronto. PMG est titulaire de la Chaire de recherche du Canada en réparation endogène et a reçu le soutien de l’Institut ontarien de médecine régénérative, du Réseau de cellules souches et de Medicine by Design, un programme d’excellence en recherche Canada First. Des diagrammes schématiques ont été créés avec BioRender.com.

<ol><li>Frontera, W. R., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+Muscle%3A+A+brief+review+of+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Skeletal Muscle: A brief review of structure and function.</a> Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).</li>
<li>McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+Duchenne+muscular+dystrophy%3A+From+basic+mechanisms+to+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22DMM+Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Animal models of Duchenne muscular dystrophy: From basic mechanisms to gene therapy.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (3), 195-213 (2015).</li>
<li>Young, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoScreen%2C+a+high-throughput+phenotypic+screening+platform+enabling+muscle+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">MyoScreen, a high-throughput phenotypic screening platform enabling muscle drug discovery.</a> SLAS Discovery. 23 (8), 790-806 (2018).</li>
<li>DiMasi, J. A., Hansen, R. W., Grabowski, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+price+of+innovation%3A+New+estimates+of+drug+development+costs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Health+Economics%22%5BJournal%5D)">The price of innovation: New estimates of drug development costs.</a> Journal of Health Economics. 22 (2), 151-185 (2003).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-screening+platform+based+on+the+contractility+of+tissue-engineered+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+and+Nerve%22%5BJournal%5D)">Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle.</a> Muscle and Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).</li>
<li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+drug+screening+with+contractile+muscle+tissue+engineered+from+dystrophic+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Automated drug screening with contractile muscle tissue engineered from dystrophic myoblasts.</a> The FASEB Journal. 23 (10), 3325-3334 (2009).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinted+human+skeletal+muscle+constructs+for+muscle+function+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D bioprinted human skeletal muscle constructs for muscle function restoration.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12307(2018).</li>
<li>Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+human+contractile+myofiber+sheets+as+a+platform+for+studies+of+skeletal+muscle+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li>
<li>Afshar Bakooshli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+culture+model+of+innervated+human+skeletal+muscle+enables+studies+of+the+adult+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction.</a> eLife. 8, 1-29 (2019).</li>
<li>Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+human+myobundles+mimic+clinical+responses+of+skeletal+muscle+to+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs.</a> eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).</li>
<li>Urciuolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+3D+in+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+at+the+single+fiber+scale%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale.</a> PLoS One. 15 (5), 0232081(2020).</li>
<li>Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D-printed+platform+for+modular+neuromuscular+motor+units%5BTitle%5D)+AND+%22Microsystems+%26+Nanoengineering%22%5BJournal%5D)">A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units.</a> Microsystems & Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).</li>
<li>Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+contractile+muscle+tissue+consisting+of+human+skeletal+myocyte+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line.</a> Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).</li>
<li>Capel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+3D+printed+molds+for+human+tissue+engineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20(2019).</li>
<li>Gholobova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tissue-engineered+skeletal+muscle%3A+a+novel+3D+in+vitro+model+for+drug+disposition+and+toxicity+after+intramuscular+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li>
<li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), 5847(2018).</li>
<li>Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+human+pluripotent+stem+cells+into+a+functional+skeletal+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li>
<li>Maffioletti, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+human+iPSC-derived+artificial+skeletal+muscles+model+muscular+dystrophies+and+enable+multilineage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering.</a> Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).</li>
<li>Chal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+muscle+fibers+and+satellite-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).</li>
<li>Khodabukus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+increases+hypertrophy+and+metabolic+flux+in+tissue-engineered+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle.</a> Biomaterials. 198, 259-269 (2019).</li>
<li>Nagashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+tissues+with+contractility+fabricated+by+immortalized+human+myogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biosystems%22%5BJournal%5D)">In vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells.</a> Advanced Biosystems. , 2000121(2020).</li>
<li>Mills, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+human+skeletal+micro+muscle+platform+with+pacing+capabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Development of a human skeletal micro muscle platform with pacing capabilities.</a> Biomaterials. 198, 217-227 (2019).</li>
<li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+tissue+gauges+to+measure+and+manipulate+forces+from+3D+microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microfabricated tissue gauges to measure and manipulate forces from 3D microtissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (25), 10097-10102 (2009).</li>
<li>Prüller, J., Mannhardt, I., Eschenhagen, T., Zammit, P. S., Figeac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+delivered+in+their+niche+efficiently+generate+functional+myotubes+in+three-dimensional+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Satellite cells delivered in their niche efficiently generate functional myotubes in three-dimensional cell culture.</a> PLOS One. 13 (9), 0202574(2018).</li>
<li>Sakar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+optogenetic+control+of+engineered+3D+skeletal+muscle+bioactuators%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators.</a> Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+to+monitor+statin-induced+myopathy+in+individual+engineered+skeletal+muscle+myobundles%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A system to monitor statin-induced myopathy in individual engineered skeletal muscle myobundles.</a> Lab on a Chip. 18 (18), 2787-2796 (2018).</li>
<li>Rajabian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+skeletal+muscle+as+a+model+of+muscle+aging+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Bioengineered skeletal muscle as a model of muscle aging and regeneration.</a> Tissue Engineering Part A. 27 (1-2), 74-86 (2020).</li>
<li>Afshar, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+96-well+culture+platform+enables+longitudinal+analyses+of+engineered+human+skeletal+muscle+microtissue+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6918(2020).</li>
<li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+pathological+human+myoblasts%3A+Towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skeletal Muscle. 1 (1), 34(2011).</li>
<li>Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Bakooshli, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+model+of+human+skeletal+muscle+innervated+with+stem+cell-derived+motor+neurons+enables+epsilon-subunit+targeted+myasthenic+syndrome+studies%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies.</a> BioRxiv. , 275545(2018).</li>
<li>Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+highly+contractile+tissue-cultured+avian+skeletal+myotubes+in+collagen+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel.</a> Vitro Cellular & Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).</li>
<li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li>
<li>Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+extracellular+matrix+composition+in+structure+and+function+of+bioengineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle.</a> Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Ce manuscrit décrit des méthodes pour fabriquer et analyser un modèle de culture 3D hMMT qui peut être appliqué à des études de biologie musculaire de base, à la modélisation de maladies ou à des tests de molécules candidates. La plate-forme MyoTACTIC est économique, facile à fabriquer et nécessite un nombre relativement faible de cellules pour produire des microtissus musculaires squelettiques. Les mmTh formés au sein de la plateforme de culture MyoTACTIC sont constitués de myotubes alignés, multinucléés et striés, et r...

Le muscle squelettique est l’un des tissus les plus abondants dans le corps humain et soutient les fonctions clés du corps telles que la locomotion, l’homéostasie thermique et le métabolisme1. Historiquement, des modèles animaux et des systèmes de culture cellulaire bidimensionnelle (2D) ont été utilisés pour étudier les processus biologiques et la pathogenèse des maladies, ainsi que pour tester des composés pharmacologiques dans le traitement des maladies musculaires squelettiques2,3. Alors que les modèles animaux ont grandement amélioré nos connaissances sur les muscles squelettiques en santé et en maladie, leur impact translationnel a été entravé par des coûts élevés, des considérations éthiques et des différences inter-espèces2,4. En se tournant vers les systèmes à base de cellules humaines pour étudier le muscle squelettique, les systèmes de culture cellulaire 2D sont favorables en raison de leur simplicité. Cependant, il y a une limite. Ce format échoue souvent à récapituler les interactions cellule-cellule et cellule-matrice extracellulaire qui se produisent naturellement dans le corps5,6. Au cours des dernières années, les modèles de muscles squelettiques tridimensionnels (3D) sont apparus comme une alternative puissante aux modèles animaux entiers et aux systèmes de culture 2D conventionnels en permettant la modélisation de processus physiologiquement et pathologiquement pertinents ex vivo7,8. En effet, une pléthore d’études ont rapporté des stratégies pour modéliser le muscle squelettique humain dans un format de culture 3D bioartificiel1. Une limite pour beaucoup de ces études est que la force active est quantifiée après le retrait des tissus musculaires des plates-formes de culture et la fixation à un transducteur de force, ce qui est destructeur et donc limité à servir de test final9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. D’autres ont conçu des systèmes de culture qui permettent des méthodes non invasives de mesure de la force active, mais tous ne se prêtent pas à des applications de test de molécules à haute teneur7,8,9,10,14 , 18,22,23, 24,25,26,27,28 ,29.
Ce protocole décrit une méthode détaillée pour fabriquer des microtissus musculaires humains (hMMT) dans la plate-forme de muscle squelettique (Myo) microTissue Array deviCe To Investigate forCe (MyoTACTIC); un dispositif à plaque de 96 puits qui prend en charge la production en vrac de microtissus musculaires squelettiques3D 30. La méthode de fabrication de plaques MyoTACTIC permet la génération d’une plaque de culture de polydiméthylsiloxane (PDMS) de 96 puits et de toutes les caractéristiques de puits correspondantes en une seule étape de coulée, chaque puits nécessitant un nombre relativement faible de cellules pour la formation de microtissu. Les microtissus formés dans MyoTACTIC contiennent des myotubes alignés, striés et multinucléés qui sont reproductibles de puits en puits de l’appareil et, à maturation, peuvent répondre à des stimuli chimiques et électriques in situ30. Ici, la technique de fabrication d’un dispositif de plaque de culture PDMS MyoTACTIC à partir d’une réplique en polyuréthane (PU), une méthode optimisée pour mettre en œuvre des cellules progénitrices myogéniques humaines immortalisées pour fabriquer des hMMT, et l’évaluation fonctionnelle de la génération de force hMMT et des propriétés de manipulation du calcium sont décrites et discutées.

<table><tbody><tr><td>Solution saline à 0,9 %,</td><td>marque maison</td> stérile <td>1010</td><td>10 mL d’aliquotes de la solution sont préparées et stockées à 4 ° C</td></tr><tr><td>25G Aiguille</td><td>BD, Medstore, Université de Toronto</td><td>2548-CABD305127</td><td></td></tr><tr><td>Acide 6-aminocaproïque, &ge ; 99 % (titrage), Powder</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A2504-100G</td><td>Une solution mère de 50 mg / mL est générée en dissolvant 5 mg de poudre d’acide 6-aminocaproïque dans 100 mL d’eau distillée autoclave. La solution est filtrée sous vide et des aliquotes de 10 mL sont stockées à 4&deg ; C</td></tr><tr><td>6.35 mm ID Tubing</td><td>VWR</td><td>60985-528</td><td></td></tr><tr><td>AB1167 Myoblast Cell Line</td><td>Institut de Myologie (Paris, France)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Générateur de formes d’onde arbitraires</td><td>Rigol</td><td>DG1022Z</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de membrane basale (Geltrex)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14132-02</td><td>Stocké sous forme d’aliquotes de 50 &micro ; L ou 100 & micro ; L à -80&deg ; </td></tr><tr><td>C Benchtop Benchtop Vacuum Chamber</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>D2672</td><td></td></tr><tr><td>BNC to Aligator Clip Cable</td><td></td><td></td><td>Commandé auprès d’Amazon</td></tr><tr><td>Culture Plastics</td><td>Sarstedt</td><td></td><td>Comprend des plaques de culture, des pipettes sérologiques, etc</td></tr>. <tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>D8418-250ML</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, poudre, sans calcium, sans magnésium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>21600069</tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Il s’agit d’un DMEM à haute teneur en glucose avec de la L-glutamine et du pyruvate de sodium</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Fisher Scientific 10437028</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogène de plasma bovin</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>F8630-5G</td><td>Des aliquotes allant de 7 à 10 mg de poudre de fibrinogène sont fabriquées et stockées à -20&deg ; C</td></tr><tr><td>Filtropur Seringue Filtre, 0,22um Taille des pores</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de cheval</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Insuline recombinante humaine</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>91077C</td><td>La solution mère est 100X et fabriquée en dissolvant 1 mg d’insuline recombinante humaine dans 1 mL de DMEM et 1 &micro ; L de NaOH 10N. La solution est filtrée et stockée sous forme d’aliquotes de 1 mL à 4&deg ; C</td></tr><tr><td>Logiciel d’acquisition d’images</td><td>Olympus</td><td>cellSens Dimension</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de traitement</td><td>d’images National Institutes of Health</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Oven</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>201</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>Microscope - Support de caméra</td><td>Labcam</td><td>Labcam pour iPhone</td><td>Commandé sur Amazon</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Seringues jetables en plastique, 1cc</td><td>BD</td><td>2606-309659</td><td></td></tr><tr><td>Seringues jetables en plastique, 50cc</td><td>BD</td><td>2612-309653</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127, poudre, BioReagent</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P2443-250G</td><td>Une solution mère à 5 % d’acide pluronique est obtenue en dissolvant 5 g de poudre d’acide pluronique dans 100 ml d’eau distillée réfrigérée et autoclavée. La solution est filtrée sous vide et des aliquotes de 10 mL sont stockées à 4&deg ; C</td></tr><tr><td>Polydiméthylsiloxane (kit d’élastomère de silicone Sylgard 184)</td><td>Les kits 4019862 Dow</td><td></td><td>sont également disponibles chez Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc.</td></tr><tr><td>Moule négatif en polyuréthane</td><td>Agent</td> de démoulage interne <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mann Release Technologies</td><td>200</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à vide à palettes rotatives</td><td>Edwards</td><td>A65401906</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Almedic, Medstore, Université de Toronto</td><td>2586-M36-0100</td><td></td></tr><tr><td>Lame de rasoir à simple tranchant</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Cellule musculaire squelettique Basal Medium</td><td>Promocell</td><td>C-23260</td><td>30 mL d’aliquotes sont générées et stockées à 4&deg ;C.</td></tr><tr><td>Milieu de croissance des cellules musculaires squelettiques (prêt à l’emploi)</td><td>Promocell</td><td>C-23060</td><td>42 mL d’aliquotes sont générées et stockées à 4&deg ;C.</td></tr><tr><td>Smartphone (iPhone)</td><td>Apple</td><td>SE</td><td></td></tr><tr><td>Standard Duty Dry Vacuum Pump</td><td>Welch</td><td>2546B-01</td><td></td></tr><tr><td>Sterilization Bag</td><td>Alliance</td><td>211-SCM2</td><td></td></tr><tr><td>Thimble</td><td>Igege</td><td></td><td>Commandé chez Amazon</td></tr><tr><td>Thrombin from human plasma</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T6884-250UN</td><td>100 unités de thrombine sont dissoutes dans 1 mL d’une solution de BSA à 0,1 %. 10 et micro ; Les aliquotes L sont préparées et stockées à - 20 °C.</td></tr><tr><td>Fil de cuivre étamé</td><td>Arco</td><td>B8871K48</td><td>Commandé chez Amazon</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4 %</td><td>Thermo Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA, 0,25 %</td><td>Thermo FIsher Scientific</td><td>25200072 Chambre à</td><td></td></tr><tr><td>vide 2</td><td>SP Bel-Art</td><td>F42027-0000</td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation des mesures fonctionnelles de la santé des muscles squelettiques dans les microtissus musculaires squelettiques humains

Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues

Les modèles in vitro tridimensionnels (3D) du muscle squelettique constituent une avancée précieuse dans la recherche biomédicale, car ils offrent la possibilité d’étudier la réforme et le fonctionnement des muscles squelettiques dans un format évolutif qui se prête à des manipulations expérimentales. Les systèmes de culture musculaire 3D sont souhaitables car ils permettent aux scientifiques d’étudier le muscle squelettique ex vivo dans le contexte des cellules humaines. Les modèles 3D in vitro imitent étroitement certains aspects de la structure tissulaire native du muscle squelettique adulte. Cependant, leur application universelle est limitée par la disponibilité de plates-formes simples à fabriquer, coûteuses et conviviales, et produisant des quantités relativement élevées de tissus musculaires squelettiques humains. De plus, étant donné que le muscle squelettique joue un rôle fonctionnel important qui est altéré au fil du temps dans de nombreux états pathologiques, une plate-forme expérimentale pour les études de microtissu est plus pratique lorsque des mesures de force transitoire et contractile de calcium mini-invasives peuvent être effectuées directement dans la plate-forme elle-même. Dans ce protocole, la fabrication d’une plate-forme de 96 puits connue sous le nom de « MyoTACTIC » et la production en masse de microtissus musculaires squelettiques humains 3D (hMMT) sont décrites. En outre, les méthodes pour une application mini-invasive de la stimulation électrique qui permet des mesures répétées de la force musculaire squelettique et de la manipulation du calcium de chaque microtissu au fil du temps sont rapportées.

Les méthodes décrites ici sont les méthodes permettant de couler une plate-forme de culture myoTACtique à base de PDMS à 96 puits à partir d’un moule PU, de fabriquer des réseaux de tissus répliques hMMT et d’analyser deux aspects de la fonction hMMT dans la génération de force du dispositif de culture et la manipulation du calcium. La figure 1 offre un aperçu schématique de la préparation des puits de culture myotactique avant l’ensemencement de la hMMT. PDMS est un polymère à base de silic...

Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour produire des réseaux de microtissus musculaires squelettiques humains en 3D et des tests de fonction in situ en aval mini-invasifs, y compris des analyses de force contractile et de manipulation du calcium.

Three-dimensional (3D) in vitro models of skeletal muscle are a valuable advancement in biomedical research as they afford the opportunity to study ...

Notre protocole décrit des méthodes détaillées pour fabriquer et analyser une culture de microtissu de muscle squelettique humain en 3D. Les microtissus musculaires peuvent être appliqués à des études de biologie musculaire de base, à la modélisation de maladies ou à des tests de molécules candidates. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’évaluer in situ la force contractile et les transitoires calciques.Pour cette raison, vous pouvez mener des études longitudinales de la fonction du tissu musculaire. Brennen Musgrave et Heta Lad, des étudiants diplômés de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Deux à trois heures avant l’ensemencement cellulaire, placez une portion de six plaques tactiques bien douces dans un plat de culture cellulaire de 10 centimètres.Préparez bien chaque culture myotactique individuelle en ajoutant 100 microlitres d’une solution de F-127 pluronique à 5%. Utilisez le couvercle pour couvrir les puits et appliquez un film de paraffine pour sceller le plat. Centrifugez la boîte à 1 550 fois G pendant une minute dans une centrifugeuse équipée d’un adaptateur de spinner à plaque.Conservez la boîte de culture à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que les cellules soient prêtes pour l’ensemencement. Ensuite, décongelez lentement 150 microlitres aliquotes d’extrait de membrane basale et 110 microlitres aliquotes de thrombine sur la glace dans la hotte de culture. En travaillant dans la hotte de culture cellulaire, ajoutez 700 microlitres de solution saline à 0,9% à un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre contenant sept milligrammes de fibrinogène en poudre.Placez le tube dans un incubateur de culture cellulaire de 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes sans vortex. Retirez et faites glisser doucement le tube, puis faites tourner la solution dissoute dans une microcentrifugation avant de la renvoyer dans la hotte de culture. Filtrer la solution de fibrinogène à l’aide d’une seringue d’un millilitre équipée d’un filtre à seringue de 0,22 micromètre.Ensuite, transférez la solution de fibrinogène dissoute dans la glace à côté de l’extrait de membrane basale et des aliquotes de thrombine. Préparez et préchauffez le milieu de croissance tissulaire à 37 degrés Celsius, qui sera introduit dans les puits de culture après l’ensemencement des tissus. Retirez les plaques de culture cellulaire de l’incubateur et aspirez le milieu de culture.Ensuite, lavez les cellules une fois en ajoutant cinq millilitres de DPBS dans chaque plaque de culture. Aspirer le DPBS et détacher les cellules en ajoutant un millilitre de 0,25% de trypsine EDTA dans chaque boîte de culture. Placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant trois minutes, maintenez la trypsine en ajoutant trois millilitres de milieu de lavage à la boîte de culture, puis transférez les cellules dans un tube conique de taille appropriée.Abattez les cellules en les centrifugant à 400 fois G pendant 10 minutes. Aspirer soigneusement le milieu sans endommager la pastille cellulaire, puis suspendre à nouveau les cellules dans un millilitre du milieu de lavage. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et d’un colorant bleu trypan sous microscopie à champ lumineux.Pour ensemencer six tissus, préparez suffisamment de cellules et de matrice extracellulaire pour huit tissus, tenant ainsi compte des pertes et de la formation de bulles. Transférez 1,2 million de cellules dans un nouveau tube conique, puis augmentez le volume à 10 millimètres avec un milieu de lavage. Abattez les cellules en les centrifugant à 400 fois G pendant 10 minutes.Préparer 150 microlitres de mélange ECM dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et stocker le mélange sur de la glace jusqu’à utilisation. Aspirer le milieu du tube conique contenant les cellules, en prenant soin d’éviter la pastille cellulaire. Agitez vigoureusement l’extrémité du tube avec un doigt ganté jusqu’à ce que la pastille apparaisse comme une boue cellulaire.Transférer 120 microlitres de la solution ECM dans le tube contenant la boue cellulaire et pipeter soigneusement de haut en bas pour suspendre complètement les cellules dans l’ECM afin de générer une suspension à cellule unique. Évitez de créer des bulles, puis placez la suspension ECM cellulaire sur de la glace jusqu’à l’utilisation. Placez le plat réfrigéré de 10 centimètres contenant les puits myotactiques sur un sac de glace à l’intérieur de la hotte de culture cellulaire et aspirez la solution pluronique de F-127 de chaque puits.Laissez la solution pluronique résiduelle de F-127 se libérer du PDMS poreux et déposez-la au fond du puits en laissant les puits reposer pendant cinq minutes sur la glace, puis aspirer à nouveau. Pipettez soigneusement la suspension ECM de la cellule pour les remettre en suspension, puis transférez 105 microlitres de la suspension dans un tube frais et pré-réfrigéré de 1,5 millilitre en le saisissant près du sommet. Ajouter 0,84 microlitre de 100 unités par millilitre de solution mère de thrombine aux 105 microlitres de suspension ECM cellulaire.Pipette rapide et complète pour mélanger, en évitant l’introduction de bulles. Ajouter 15 microlitres du mélange ECM cellulaire à chaque puits sans presser la pipette dans le fond du puits. Avec deux mouvements légers, étalez la suspension cellulaire derrière chaque poteau du puits.Placez le couvercle sur la plaque de culture de 10 centimètres et transférez-le dans un incubateur de culture tissulaire de 37 degrés Celsius pendant environ cinq minutes. Ajouter 200 microlitres de milieux de croissance tissulaire préchauffés à chaque puits myotactique après la polymérisation du mélange ECM cellulaire. Remplacez le couvercle du plat de 10 centimètres et conservez-le dans l’incubateur jusqu’à la différenciation.Au cours d’une période de culture de 14 jours, les myoblastes ont montré les aspects du tissu natif en s’auto-organisant dans le puits de tactique douce pour former un microtissu 3D avec des myotubes striés multi-nucléés. Les myotubes ont des stries de sarcomères, qui ont été visualisées par immunocoloration pour l’alpha-actinine sarcomérique. Pour obtenir des myotubes bien alignés, les erreurs techniques telles que la formation de bulles lors du pipetage ou l’endommagement du revêtement pluronique lors de l’aspiration doivent être évitées.Un déplacement représentatif du poteau de la plaque de puits myotactique en réponse à une stimulation électrique à basse et haute fréquence est montré ici, indiquant que les myotubes répondent à des stimuli électriques variables et se contractent en conséquence. La quantification du post-déplacement permet la conversion en force contractile absolue des HMMT. L’éphémère en calcium sur les HMMT fabriqués à partir de myoblastes transduis par GCaMP6 a également été analysé en réponse à une stimulation à basse et haute fréquence.La quantification de l’intensité fluorescente peut être utilisée comme mesure des propriétés de manipulation du calcium des HMMT. La plupart des personnes qui effectuent cet ensemencement tissulaire pour la première fois ont du mal à ajouter la matrice extracellulaire cellulaire aux puits et à former des bulles. Nous recommandons de pratiquer la technique sur certains puits de culture de microtissu de rechange avec une solution visqueuse très simple avant la première tentative avec des cellules.

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Myo-mécanique Analyse des muscles squelettiques isolés

Ce protocole décrit l'utilisation de leviers de silicium micro-échelle que les surfaces souples de culture pour mesurer la contractilité des cellules musculaires in vitro. Contraction cellulaire provoque une flexion en porte à faux, qui peut être mesuré, enregistré et converti en lectures de force, en fournissant un système non invasif pour la mesure et s'adaptent fonction contractile in vitro.

L'utilisation de Microscale Silicon Cantilevers pour évaluer cellulaire contractile Fonction In Vitro

Ce protocole décrit une méthode robuste, reproductible et simple d'isolement et de culture de cellules myoblastes progénitrices du muscle squelettique des adultes et des personnes âgées. Les muscles utilisés ici comprennent les muscles du pied et de la jambe. Cette approche permet l'isolement d'une population enrichie de myoblastes primaires pour des études fonctionnelles.

Préparation et culture de cellules Myogenic Précurseurs / myoblastes primaires de muscle squelettique des adultes et les humains âgés

Mesure de la fonction contractile du muscle squelettique rongeurs est un outil utile qui peut être utilisé pour suivre la progression de la maladie ainsi que l’efficacité d’intervention thérapeutique. Nous décrivons ici l’évaluation non invasive, in vivo des muscles dorsifléchisseurs qui peut se répéter au fil du temps dans la même souris.

Évaluation non invasif de la fonction musculaire de dorsifléchisseurs chez la souris

Ce rapport technique décrit une variation de la technique modifiée de Bergström pour la biopsie du tibialis de musculus antérieur qui limite les dommages de fibre.

Collection de biopsies musculaires squelettiques du compartiment supérieur du musculus humain tibialis antérieur pour l’évaluation mécanique

La quantification de la force maximale de l’extenseur du genou est impérative pour comprendre les adaptations fonctionnelles au vieillissement, à la maladie, aux blessures et à la réadaptation. Nous présentons une nouvelle méthode pour mesurer à plusieurs reprises le couple tétanique de crête isométrique d’extension du genou in vivo.

Mesure in vivo de la fonction musculaire extensrice du genou chez la souris

Dans ce protocole, une méthode de culture in vitro et d’analyse fonctionnelle des cellules souches musculaires est décrite, qui préserve la plupart de leurs interactions avec leur niche endogène.

Essai de culture de myofibère unique pour l’évaluation de la fonctionnalité des cellules souches musculaires adultes Ex Vivo

Ce protocole fournit des méthodes pour générer des tissus cardiaques et musculaires squelettiques modifiés en 3D et décrit leur utilisation dans les modalités de dépistage préclinique des médicaments. Les méthodes décrites utilisent un système de détection magnétique pour faciliter l’évaluation simultanée de 24 tissus en parallèle.

Tests précliniques de médicaments dans des tissus musculaires 3D évolutifs

Nous décrivons un protocole pour obtenir des fibres dissociées enzymatiquement de différentes longueurs et types à partir de six muscles de souris adultes : trois d’entre eux déjà décrits (fléchisseur des doigts court, extenseur des doigts long, soléaire) et trois d’entre eux dissociés avec succès pour la première fois (extenseur de l’hallucis long, péronier long, péronier des doigts quarti).

Fibres musculaires squelettiques courtes, intermédiaires et longues intactes obtenues par dissociation enzymatique de six muscles des membres postérieurs de souris : au-delà du fléchisseur digitorum brevis

Ici, nous décrivons une méthode complète pour mesurer la phosphorylation oxydative mitochondriale dans les fibres musculaires squelettiques perméabilisées fraîches à partir de muscles humains ou de souris. Cette méthode permet de quantifier en temps réel la respiration mitochondriale et d’évaluer la préférence pour le carburant et la flexibilité métabolique tout en préservant les réseaux mitochondriaux existants et l’intégrité de la membrane.

Mesure de la respiration mitochondriale dans les fibres musculaires squelettiques humaines et murines par respirométrie à haute résolution

Ce protocole utilise la micro-tomodensitométrie pour permettre la quantification rentable de la masse maigre, y compris les muscles squelettiques et les tissus viscéraux, le tissu adipeux et le tissu squelettique chez les petits animaux. Il distingue le tissu maigre du tissu adipeux, ce qui offre des avantages significatifs pour la recherche biomédicale, notamment dans la recherche translationnelle chez les petits animaux.

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Découvrez la fabrication et l'analyse de microtissus musculaires humains 3D avec la plateforme MyoTACTIC. Cette méthode permet des mesures répétées de force contractile et de transients calciques pour la biologie musculaire et le criblage de molécules.

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