Isolement de microARN à partir de cultures de glandes salivaires ex vivo et de vésicules extracellulaires

Ce protocole nous permet d’utiliser un nombre réduit de tiques, ce qui réduit le coût d’entretien des colonies et diminue le nombre de vertèbres nécessaires à l’alimentation des tiques. Ce protocole nécessite environ 20 tiques. Cependant, le principal avantage, outre l’utilisation d’un échantillon de petite taille, est que ce protocole peut être appliqué à plusieurs espèces de tiques et à différents stades de vie.

Outre les dissections de tiques ou l’application aux interactions hôte-parasite, l’effet de l’infection pathogène sur la sécrétion de microARN et l’effet des changements physiologiques sur les microARN sécrétés par les tiques. Pour commencer, préparez un milieu sans vésicule en ajoutant du sérum bovin fœtal, du bouillon de phosphate de tryptose, du concentré de cholestérol à 10 % de lipoprotéines, du bicarbonate de sodium à 5 %, du HEPES et du milieu L15C300 dans un flacon centrifugeuse en polycarbonate de 26,3 millilitres et ajustez le volume au besoin. Maintenant, ultracentrifuger le milieu à 100 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant 18 heures.

Retirez délicatement le surnageant sans déranger la pastille et transférez le surnageant dans un tube à centrifuger frais. Ultracentrifugez le tube une fois de plus. Prenez le surnageant et passez-le à travers un filtre de 0,22 micromètre pour éliminer les contaminants.

Introduire le surnageant dans un tube à centrifuger de 50 millilitres et le conserver à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit nécessaire ou jusqu’à trois ans. Ajouter une quantité appropriée d’antibiotiques à 500 microlitres du milieu sans vésicule dans chaque puits d’une plaque de culture de 24 puits. Maintenant, ajoutez PBS avec de la rifampicine aux puits qui ne contiennent pas de milieu sans vésicules pour empêcher la croissance bactérienne.

Placez les tiques sur une lame de verre avec du ruban adhésif double face sous un microscope à dissection. Avant la dissection, ajoutez du PBS contenant de la rifampicine à la tique et, à l’aide de ciseaux Vannas de quatre millimètres, faites une incision d’environ un millimètre sur le côté de chaque femelle. Maintenant, retirez la face dorsale et les glandes salivaires de la tique, puis mettez 20 à 40 glandes salivaires à tiques dans 500 microlitres de milieu sans vésicules ajoutés à un seul puits dans une plaque traitée par culture tissulaire de 24 puits.

Incuber les échantillons de glandes salivaires à 32 degrés Celsius pendant 24 heures pour permettre la sécrétion des vésicules extracellulaires. À la fin de l’incubation, pipeter tout le milieu contenant les glandes salivaires dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre et centrifuger à 300 fois G à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Transférer le surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.

Remettez en suspension la pastille contenant les glandes salivaires dans l’ARN plus tard et stockez-la à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit utilisée ou indéfiniment. Maintenant, retirez les débris cellulaires en centrifugeant le surnageant à 2 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes et pipette le surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Ensuite, centrifugez à 10 000 fois G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer les corps apoptotiques et les vésicules extracellulaires plus grandes et transférer le surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.

Ensuite, assemblez un filtre de seringue en nylon d’un micromètre sur une seringue de 10 millilitres et conservez-le sur un tube ultracentrifugeur. Ajoutez ensuite l’échantillon et remplissez la seringue avec 10 millilitres de PBS. Passez le surnageant à travers le filtre dans le tube.

Après avoir filtré et équilibré les tubes, placez-les dans un rotor de 70 Ti et ultracentrifugez les tubes à 100 000 fois G pendant 18 heures à quatre degrés Celsius. Les vésicules extracellulaires concentrées forment une pastille après ultracentrifugation. Retirer le surnageant sans déranger le granulé et remettre le granulé en suspension dans du PBS.

Pipeter 500 microlitres de la vésicule extracellulaire dans un filtre centrifuge de 300 K et centrifuger à 8 000 fois G pendant 10 minutes à température ambiante et répéter cette procédure jusqu’à ce que toutes les vésicules extracellulaires soient filtrées. Enfin, ajoutez 400 microlitres de PBS stérilisé à la colonne et mélangez soigneusement pour éliminer les vésicules extracellulaires attachées à la membrane. Ensuite, mettez l’échantillon dans un tube libre de 1,5 millilitre d’ADN RNAse.

La concentration et la taille des vésicules extracellulaires variaient en fonction du sexe et du stade de vie des tiques entre les répliques biologiques pour les femelles, les mâles et les nymphes. Pour toutes les réplications biologiques combinées, des résultats similaires ont été observés. L’analyse de petits ARN isolés de la glande salivaire a montré des bandes correspondant à des ARN ribosomales et des microARN.

Cependant, les ARN ribosomales étaient absents dans les vésicules isolées des glandes salivaires, et les échantillons de microARN purifiés à partir de vésicules extracellulaires ont montré plus de dégradation. Après enrichissement, les échantillons de microARN purifiés à partir de VE ont montré une dégradation minimale et une concentration suffisante de microARN pour la synthèse de la banque d’ADNc. La taille de bande attendue d’environ 150 paires de bases après l’obtention de la préparation de la banque d’ADNc signifie de petites bibliothèques d’ADNc d’ARN.

Pendant la préparation sans vésicule, assurez-vous de suivre les étapes pour éviter la contamination externe des vésicules. Pendant la préparation de la plaque de puits, assurez-vous d’ajouter des antibiotiques pour prévenir la contamination bactérienne par le microbiome de la tique. Les microARN extraits à l’aide de ce protocole peuvent être utilisés pour des expériences de profilage et fonctionnelles afin de valider les rôles des microARN tels que la prédiction des cibles de la voie des microARN, l’inhibition et les expériences de mimétisme.