Name: Combinaison d’organoïdes humains et de la technologie Organ-on-a-Chip pour modéliser des fonctionnalités spécifiques à la région intestinale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Découvrez comment combiner des organoïdes intestinaux dérivés de biopsies avec la technologie organ-on-a-chip pour modéliser la physiologie intestinale humaine. Cette méthode permet d'étudier la pharmacocinétique, les interactions médicamenteuses et la dysfonction de la barrière épithéliale.

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Nous remercions le professeur Mark Donowitz pour avoir fourni les organoïdes dérivés de la biopsie intestinale et Brett Clair pour la conception des illustrations scientifiques de la puce, du module portable et du module de culture. Toutes les autres illustrations scientifiques ont été générées à l’aide du BioRender.

<ol><li>Fritz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+clinically+relevant+drug-metabolizing+enzymes+along+the+human+intestine+and+their+correlation+to+drug+transporters+and+nuclear+receptors%3A+An+intra-subject+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+and+Clinical+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Expression of clinically relevant drug-metabolizing enzymes along the human intestine and their correlation to drug transporters and nuclear receptors: An intra-subject analysis.</a> Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 124 (3), 245-255 (2019).</li>
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<li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+not+men%3A+Differences+between+mouse+and+human+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Of mice and not men: Differences between mouse and human immunology.</a> The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li>
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<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%E2%80%99s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).</li>
<li>Durel, J. F., Nerurkar, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+vertebrate+gut+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of vertebrate gut morphogenesis.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 63, 45-52 (2020).</li>
<li>Gayer, C. P., Basson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+mechanical+forces+on+intestinal+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology.</a> Cellular Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+activates+Piezo1+to+promote+mucin2+expression+in+goblet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology+and+Hepatology+%28Australia%29%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation activates Piezo1 to promote mucin2 expression in goblet cells.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology (Australia). 36 (11), 3127-3139 (2021).</li>
<li>Navabi, N., McGuckin, M. A., Lindén, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+cell+lines+form+polarized+epithelia+with+an+adherent+mucus+layer+when+cultured+in+semi-wet+interfaces+with+mechanical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal cell lines form polarized epithelia with an adherent mucus layer when cultured in semi-wet interfaces with mechanical stimulation.</a> PLoS One. 8 (7), 68761(2013).</li>
<li>Kasendra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+primary+human+Small+Intestine-on-a-Chip+using+biopsy-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li>
<li>Kasendra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duodenum+intestine-chip+for+preclinical+drug+assessment+in+a+human+relevant+model%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Duodenum intestine-chip for preclinical drug assessment in a human relevant model.</a> eLife. 9, 50135(2020).</li>
<li>Apostolou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+microphysiological+colon+platform+to+decipher+mechanisms+driving+human+intestinal+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A novel microphysiological colon platform to decipher mechanisms driving human intestinal permeability.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (5), 1719-1741 (2021).</li>
<li>Jalili-Firoozinezhad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Author+correction%3A+A+complex+human+gut+microbiome+cultured+in+an+anaerobic+intestine-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Author correction: A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 583(2019).</li>
<li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+enhances+differentiation+of+jejunal+human+enteroids+in+Intestine-Chip%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress enhances differentiation of jejunal human enteroids in Intestine-Chip.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (3), 258-271 (2021).</li>
<li>Sontheimer-Phelps, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colon-on-a-chip+enables+continuous+in+vitro+analysis+of+colon+mucus+layer+accumulation+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human colon-on-a-chip enables continuous in vitro analysis of colon mucus layer accumulation and physiology.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 507-526 (2020).</li>
<li>Tovaglieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-specific+enhancement+of+enterohemorrhagic+E.+coli+pathogenesis+mediated+by+microbiome+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Species-specific enhancement of enterohemorrhagic E. coli pathogenesis mediated by microbiome metabolites.</a> Microbiome. 7 (1), 43(2019).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+of+human+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfabrication of human organs-on-chips.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).</li>
<li>Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genetic+engineering+of+human+intestinal+organoids+using+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1474-1485 (2015).</li>
<li>Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).</li>
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<li>Kerns, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunocompetent+organ-on-chip+platforms+allow+safety+profiling+of+tumor-targeted+t-cell+bispecific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Human immunocompetent organ-on-chip platforms allow safety profiling of tumor-targeted t-cell bispecific antibodies.</a> eLife. 10, 67106(2021).</li>
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<li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+engineering+human+pathophysiology+with+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reverse engineering human pathophysiology with organs-on-chips.</a> Cell. 164 (6), 1105-1109 (2016).</li>
</ol>

Gauri Kulkarni, Athanasia Apostolou, Lorna Ewart, Carolina Lucchesi et Magdalena Kasendra sont des employés actuels ou anciens d’Emulate Inc. et peuvent détenir des actions. Emulate Inc. est la société qui fabrique les dispositifs de puce d’organe et a publié des brevets pertinents pour le travail énoncé dans cet article.

La combinaison de la technologie des organes sur puce et des organoïdes intestinaux est prometteuse pour une modélisation précise de la physiologie intestinale humaine et de la physiopathologie. Ici, nous fournissons un protocole étape par étape simple et robuste (décrit à la figure 1) pour l’établissement de la puce intestinale contenant l’épithélium de l’intestin grêle ou du côlon dérivé de la biopsie et des cellules endothéliales microvasculaires intestinales co-cultivées dans un disposit...

L’intestin humain est un organe complexe et multitâche capable de s’auto-régénérer. Il est divisé en petit et gros intestin. La fonction principale de l’intestin grêle est de digérer davantage les aliments provenant de l’estomac, d’absorber tous les nutriments et de transmettre les résidus au gros intestin, qui récupère l’eau et les électrolytes. L’intestin grêle est en outre divisé en plusieurs régions anatomiquement distinctes: le duodénum, le jéjunum et l’iléon, chacune étant adaptée pour remplir des fonctions spécifiques. Par exemple, le duodénum aide à décomposer le chyme (contenu de l’estomac) pour permettre la bonne absorption des nutriments impliquant des protéines, des glucides, des vitamines et des minéraux dans le jéjunum. Cette partie proximale de l’intestin grêle est également le principal site d’absorption et de métabolisme des médicaments intestinaux, et elle se caractérise par l’expression plus élevée des enzymes métabolisant les médicaments (par exemple, le CYP3A4) par rapport à leur expression dans l’iléon et le côlon1. En plus de son rôle principal dans la digestion et l’absorption des nutriments, l’intestin est également une barrière efficace contre les contenus luminaux potentiellement nocifs, tels que les micro-organismes pathogènes, les métabolites microbiens, les antigènes alimentaires et les toxines 2,3. Il est à noter que le côlon humain est habité par un grand nombre de micro-organismes, dépassant de loin celui des cellules totales du corps humain, qui offrent de nombreux avantages pour la nutrition, le métabolisme et l’immunité. Par conséquent, le maintien de l’intégrité de la barrière muqueuse formée par les cellules épithéliales intestinales est essentiel pour permettre la relation symbiotique entre le microbiote intestinal et les cellules hôtes en les séparant physiquement afin d’éviter une activation inutile des cellules immunitaires2. En outre, la mort cellulaire intestinale programmée joue un rôle essentiel en tant que mécanisme d’autoprotection empêchant les cellules infectées de persister ou de proliférer – disséminant ainsi des agents pathogènes potentiels3 – tandis que l’auto-renouvellement continu de l’épithélium intestinal tous les quatre à sept jours compense la perte cellulaire assurant l’intégrité de la barrière et l’homéostasie tissulaire. Les déficiences des fonctions intestinales décrites, y compris l’absorption des nutriments, l’intégrité de la barrière ou le déséquilibre dans la mort et l’auto-renouvellement des cellules intestinales, peuvent entraîner le développement d’une gamme de troubles gastro-intestinaux, y compris la malnutrition et les maladies inflammatoires de l’intestin (MII)2,3.
Auparavant, des modèles animaux et des lignées cellulaires intestinales transformées dérivées du cancer ont été utilisés pour étudier les fonctions physiologiques et physiopathologiques du tissu intestinal humain. Cependant, les préoccupations de plus en plus importantes concernant la transférabilité de la recherche animale à l’homme, causées par la présence de disparités importantes entre les deux espèces, ont mis en évidence la nécessité de méthodes alternatives pertinentes pour l’homme4. Les lignées cellulaires intestinales in vitro couramment utilisées comprennent les cellules T84, Caco-2 et HT29. Bien qu’ils imitent certains aspects de la fonction de barrière intestinale et du transport membranaire, ils se caractérisent par une expression altérée des enzymes métabolisant les médicaments5, des récepteurs de surface et des transporteurs4. De plus, ils manquent de spécificité du segment intestinal et ne parviennent pas à récapituler la complexité de l’épithélium intestinal, chaque modèle ne contenant qu’un seul des cinq types de cellules épithéliales présentes dans l’intestin6.
Récemment, des cultures organoïdes intestinales humaines établies à partir de biopsies fraîches de l’intestin grêle et du côlon 7,8 ou de cellules souches pluripotentes induites (CSPi)9 ont été introduites comme modèles expérimentaux alternatifs ayant le potentiel de compléter, de réduire et peut-être de remplacer l’expérimentation animale à l’avenir. Bien que les CSPi puissent être obtenues de manière non invasive, l’établissement d’organoïdes à partir de CSPi nécessite l’utilisation de protocoles complexes et longs (avec plusieurs étapes expérimentales) et génère des cultures ressemblant à du tissu fœtal humain. En revanche, les organoïdes dérivés de la biopsie sont hautement évolutifs, car ils peuvent tirer parti de la capacité de renouvellement inhérente du tissu intestinal et peuvent être indéfiniment passés et propagés in vitro. Il est important de noter que les organoïdes dérivés de la biopsie maintiennent les caractéristiques spécifiques de la maladie et de la région intestinale du tissu primaire à partir duquel ils ont été développés et émulent la diversité cellulaire de l’épithélium intestinal. Les organoïdes peuvent être utilisés comme avatars spécifiques au patient in vitro pour démêler la biologie et la pathogenèse de divers troubles gastro-intestinaux et améliorer leur gestion thérapeutique. Bien que les organoïdes intestinaux aient atteint un degré impressionnant de fonctionnalité physiologique, ils ne parviennent toujours pas à reproduire la complexité des organes natifs en raison de leur manque de composants stromaux critiques – y compris les vaisseaux sanguins, le tissu conjonctif, les nerfs périphériques et les cellules immunitaires – ainsi que de stimulation mécanique. Les paramètres mécaniques, tels que l’écoulement, la contrainte de cisaillement, l’étirement et la pression, sont connus pour influencer la morphogenèse tissulaire et l’homéostasie in vivo et il a déjà été démontré qu’ils amélioraient la maturation des cellules in vitro10,11,12,13. Un autre inconvénient important des systèmes organoïdes est l’inaccessibilité de la lumière et, par conséquent, du côté apical de l’épithélium. Cela représente un défi pour l’étude de divers mécanismes associés à l’expression polarisée des transporteurs d’ions et de médicaments, aux interactions hôte-microbiome et aux tests de toxicité pharmaceutique. Enfin, les cultures organoïdes souffrent d’une variabilité considérable de taille, de morphologie et de fonction, en raison de la nature stochastique du processus d’auto-organisation in vitro et des choix de destin cellulaire. Par conséquent, pour réaliser le plein potentiel des organoïdes intestinaux dans la modélisation des maladies, le dépistage des médicaments et la médecine régénérative, il est nécessaire d’explorer de nouvelles stratégies qui réduisent la variabilité du développement organoïde, améliorent l’accès au compartiment luminal et intègrent les interactions cellule-cellule manquantes.
La technologie Organ-on-a-Chip a introduit de nombreuses techniques pour l’incorporation de forces mécaniques et d’écoulement de fluide dans les cultures de cellules intestinales in vitro. Cependant, étant donné que la plupart des études initiales de preuve de concept ont utilisé des lignées cellulaires dérivées du cancer qui ne présentaient pas une diversité cellulaire suffisante, la pertinence de ces systèmes a été remise en question. Récemment, nous avons combiné de manière synergique des organoïdes intestinaux et la technologie organ-on-a-chip pour incorporer les meilleures caractéristiques de chaque approche dans un système in vitro 14,15,16. La puce intestinale résultante récapitule l’architecture multicellulaire de l’épithélium intestinal, la présence d’une interface tissulaire épithéliale-endothéliale et les forces mécaniques de l’écoulement et de l’étirement des fluides, permettant l’émulation des fonctions au niveau des organes in vitro. De plus, l’utilisation d’organoïdes dérivés de tissus primaires (qui peuvent être échantillonnés dans différentes régions de l’intestin humain) comme matériau de départ augmente la polyvalence de ce modèle, car des puces représentant le duodénum, le jéjunum, l’iléon et le côlon humains peuvent être établies à la suite de procédures d’ensemencement et de culture similaires. Il est important de noter que les puces intestinales permettent d’évaluer en temps réel: l’intégrité de la barrière intestinale; activité de la bordure de la brosse et des enzymes du métabolisme des médicaments; production de mucines; sécrétion de cytokines; et l’interaction des cellules intestinales avec des micro-organismes pathogènes et commensaux, comme le démontrent les rapports publiés précédemment. Notamment, lorsque les puces intestinales ont été établies à l’aide d’organoïdes générés à partir de tissus de différents individus, ces modèles ont capturé la variabilité attendue entre donneurs dans les réponses fonctionnelles à divers médicaments et traitements. Dans l’ensemble, la fusion des organoïdes avec la technologie Organ-on-a-Chip ouvre la porte à des modèles plus avancés, personnalisés et pertinents in vivo qui pourraient améliorer la pertinence physiologique et la précision des résultats in vitro ainsi que leur extrapolation aux humains. Ici, un protocole détaillé est présenté pour établir la puce intestinale et son application dans les études des fonctions physiologiques des deux segments intestinaux: duodénum et côlon. Tout d’abord, les méthodes d’évaluation de l’activité de l’enzyme métabolisant le médicament CYP3A4 dans la puce du duodénum, ainsi que son induction par des composés prototypiques tels que la rifampicine et la vitamine D3, sont décrites. Deuxièmement, les étapes nécessaires pour modéliser « l’intestin qui fuit » dans la puce du côlon sont décrites dans le protocole, la perturbation de la barrière épithéliale étant effectuée à l’aide de cytokines caractéristiques impliquées dans la pathogenèse de la MII. En bref, les organoïdes dérivés de biopsies humaines sont propagés in vitro, soumis à une digestion enzymatique et introduits dans le canal supérieur de la puce. En présence d’une perfusion continue avec des milieux enrichis en facteur de croissance, ils se développent en une monocouche épithéliale confluente avec une architecture 3D et une surface cellulaire apicale facilement accessible. Le compartiment inférieur de la puce « vasculaire » est ensemencé de cellules endothéliales microvasculaires isolées du petit ou du gros intestin. L’épithélium et l’endothélium sont séparés par une membrane extensible poreuse, qui facilite les interactions paracrines entre les deux tissus et, lorsqu’ils sont soumis à des déformations cycliques, émule les mouvements de l’intestin humain semblables à ceux du péristaltisme. La co-culture est maintenue dans les conditions d’écoulement dynamique générées par la perfusion luminale et vasculaire avec des milieux de culture cellulaire appropriés. Enfin, nous décrivons de nombreux types d’essais et d’analyses des paramètres qui peuvent être effectués directement sur puce ou à partir d’effluents de culture cellulaire échantillonnés.

<table><tbody><tr><td>intestin grêle Cellules endothéliales microvasculaires intestinales humaines</td><td>AlphaBioRegen</td><td>ALHE15</td><td>0,5 cellules M/ml ; côlon cryoconservé</td></tr><tr><td>Cellules endothéliales microvasculaires intestinales humaines</td><td>AlphaBioRegen</td><td>ALHE16</td><td>0,5 cellules M/ml ;</td></tr><tr><td>organoïdes duodénaux humains dérivés de biopsie</td><td>cryoconservés Université de John Hopkin</td><td>-</td><td>Les organoïdes ont été fournis par le professeur Mark Donowitz (numéro du comité d’examen institutionnel : NA_00038329).</td></tr><tr><td>Organoïdes du côlon humain dérivés de la biopsie</td><td>Université de John Hopkin</td> <td>-</td> <td>Les organoïdes ont été fournis par le professeur Mark Donowitz (numéro du comité d’examen institutionnel : NA_00038329).</td></tr><tr><td>Zo&euml ; CM-1&commerce ; &nbsp ; Module de culture</td><td>Emulate&nbsp ;Inc.</td><td>-</td><td>Module de culture</td></tr><tr><td>Orb-HM1& commerce ; &nbsp ; Émulation du module de moyeu</td><td>&nbsp ;Inc.</td><td>-</td><td>5 % de CO2, étirement sous vide et alimentation</td></tr><tr><td>Chip-S1&commerce ; Émulation de puce extensible</td><td>&nbsp ;Inc.</td><td>-</td><td>Pod&commerce de puces d’organe</td></tr><tr><td> ; Émulation de modules</td><td>portables&nbsp ;Inc.</td><td>-</td><td>Module portable</td></tr><tr><td>Boîte de lumière UV</td><td>Emulate&nbsp ;Inc.</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Chip Cradle</td><td>Emulate&nbsp ;Inc.</td><td>-</td><td>1 par plat de culture carré</td></tr><tr><td>Filtres Steriflip&reg ;-HV EMD</td><td>Millipore</td><td>SE1M003M00</td><td>0,45&nbsp ; &mu ; m&nbsp ; Filtre PVDF</td></tr><tr><td>Plat de culture cellulaire carré (120 x 120 mm)</td><td>VWR</td><td>82051-068-Handheld</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; vide&nbsp ; aspirateur</td><td>Corning</td><td>4930</td><td>&nbsp ;-</td></tr><tr><td>Aspirateur&nbsp ; pipettes</td><td>Corning / Falcon</td><td>357558</td><td>2 mL,&nbsp ; polystyrène, à l’unité enveloppé</td></tr><tr><td>Embouts d’aspiration</td><td>&nbsp ;-</td><td></td><td>Stériles (autoclavés)</td></tr><tr><td>Sérologiques&nbsp ; pipettes</td><td></td><td>&nbsp ;-</td><td>2 mL, 5 mL,&nbsp ; 10 mL,&nbsp ; et&nbsp ; 25 mL&nbsp ; Pipette</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>P20, P200, P200, à faible teneur en endotoxines. P1000&nbsp ; et pipette multicanaux standard</td></tr><tr><td>&nbsp ; astuces&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>P20, P200,&nbsp ; et&nbsp ; P1000.</td></tr><tr><td>Tubes coniques&nbsp ;( Protéine&nbsp ; LoBind&reg ; Tubes)</td><td>Eppendorf</td><td>0030122216 ; &nbsp ; 0030122240</td><td>tubes de 15 mL, 50 mL</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp ; Tubes&reg ; &nbsp ; lo-bind</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td>tubes de 1,5 mL</td></tr><tr><td>96 puits plaque à paroi noire</td><td>-</td><td>-</td><td>pour l’analyse de la perméabilité épithéliale</td></tr><tr><td>Microscope (avec caméra)</td><td>-</td><td>-</td><td>Pour fond clair&nbsp ; imagerie</td></tr><tr><td>Bain-marie (ou billes)</td><td>-</td><td>-</td><td>Réglé à 37&deg ; C</td></tr><tr><td>Configuration du vide</td><td>&nbsp ;-</td><td>-</td><td>Minimum&nbsp ; pression : -70 kPa</td></tr><tr><td>Racleurs cellulaires</td><td>Biotium</td><td>220033</td><td></td></tr><tr><td>T75 flacons</td><td>BD Falcon</td><td>353136</td><td>Flacon de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Emulate Reagent-1&nbsp ;( ER-1)</td><td>Émuler Inc.</td><td>-</td><td>Solution de revêtement de copeaux</td></tr><tr><td>émulation réactif-2&nbsp ;( ER-2)</td><td>Emulate Inc.</td><td>-</td><td>Solution de revêtement de copeaux</td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS&nbsp ; (DPBS)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>1X</td></tr><tr><td>Eau de qualité culture cellulaire</td><td>Corning</td><td>MT25055CV</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma</td><td>93595</td><td>Pour le comptage cellulaire</td></tr><tr><td>TryplE&nbsp ; ThermoFisher Express</td><td>&nbsp ; </td><td></td><td>Organoïdes scientifiques 12604013 dissociation&nbsp ; et les cellules endothéliales détachement&nbsp ; solution</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>ThermoFisher&nbsp ; Scientifique</td><td>12634028</td><td>Média</td></tr><tr><td>IntestiCult&commerce ; Milieu de croissance organoïde (humain)</td><td>Technologies des cellules souches</td><td>06010</td><td>Milieu de croissance organoïde</td></tr><tr><td>Milieu de croissance cellulaire endothéliale MV 2</td><td>Promocell</td><td>C-22121</td><td>Milieu endothélial</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Sérum Primocin&trade ; &nbsp ;</td><td>InvivoGen</td><td>ANT-PM-1</td> agent <td>antimicrobien</td></tr><tr><td>Facteur d’attachement&commerce ;</td><td>Cell Systems</td><td>4Z0-210</td><td>solution de revêtement pour flacon</td></tr><tr><td>Matrigel - Facteur de croissance réduit</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Matrice de membrane basale solubilisée</td></tr><tr><td>Collagène IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>Composant ECM</td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>Corning</td><td>356008</td><td>composant ECM</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Technologies de cellules souches</td><td>72304</td><td>Supplément de média organoïde</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Reprocell</td><td>04-0004-10</td><td>supplément de média organoïde</td></tr><tr><td>Solution de récupération cellulaire</td><td>Corning</td><td>354253</td><td>Basement mebrane matrix dissociationsolution</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9576</td><td>30 %, Eau</td></tr> stérile de <tr><td>qualité de culture cellulaire</td><td>Corning</td><td>MT25055CV</td><td>Stérile, Eau</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>solvant</td></tr><tr><td>3KDa Dextran Cascade Blue</td><td>Invitrogen</td><td>D7132</td><td>10 mg</td></tr><tr><td>poudre Rifampicine (RIF)</td><td>Sigma</td><td>Cat# R3501</td><td>Inducteur CYP</td></tr><tr><td>Hydrate de testostérone</td><td>Sigma</td><td>T1500</td><td>Substrat CYP</td></tr><tr><td>1,25-dihyroxy Vitamine D3 (VD3)</td><td>Sigma</td><td>Cat# D1530</td><td>Inducteur CYP</td></tr><tr><td>Acétonitrile avec 0,1 % (v/v) Acide formique</td><td>Sigma</td><td>159002</td><td>Solution d’arrêt LCMS</td></tr><tr><td>IFN&gamma ;</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>4 % Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>EMS</td><td>157-4</td><td>Fixateur</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td>Sérum</tr><tr><td>d’âne normal (NDS)</td><td>Sigma</td><td>566460</td><td></td></tr><tr><td>anti-Occludine</td><td>ThermoFisher&nbsp ; Scientific</td><td>33-1500</td><td>marqueur de jonctions serrées</td></tr><tr><td>anti-Claudin 4</td><td>ThermoFisher&nbsp ; Scientific</td><td>36-4800</td><td>marqueur de jonctions serrées</td></tr><tr><td>anti-E-cadhérine</td><td>Abcam</td><td>ab1416</td><td>jonctions épithéliales adhérentes</td></tr> marqueur <tr><td>anti-VE-cadhérine</td><td>Abcam</td><td>ab33168</td><td>jonctions endothéliales adhérentes</td></tr><tr><td>marqueur anti- Zonula Occludens 1 (ZO-1)</td><td>Thermo Fischer</td><td>339194</td><td>marqueur de jonctions serrées</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher&nbsp ; Scientific</td><td>62248</td><td>coloration nucléaire</td></tr><tr><td>2-mercaptoéthanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>PureLink RNA Mini Kit</td><td>Invitrogen</td><td>12183020</td><td>kit de lyse, d’isolement et de purification de l’ARN</td></tr><tr><td>SuperScript&trade ; IV VILO&trade ; Master Mix</td><td>Invitrogen</td><td>11756050</td><td>kit de transcriptase inverse</td></tr><tr><td>TaqMan&trade ; Fast Advanced Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444557</td><td>réactif qPCR</td></tr><tr><td>QuantStudio&trade ; 5 Système de PCR en temps réel</td><td>Applied Biosystems</td><td>A28573</td><td>Testeur de PCR en temps réel</td></tr><tr><td>18S amorce ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>Hs99999901_s1</td><td>Eucaryote 18S ARNr</td></tr><tr><td>CYP3A4 amorce</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs00604506_m1</td><td>Cytochrome&nbsp ; famille 3 sous-famille A membre 4</td></tr><tr><td>Pierce&trade ; Coomassie Plus (Bradford) Kit de dosage</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23236</td><td>Kit de quantification des protéines</td></tr><tr><td>MSD Tampon de lyse Tris</td><td>Meso Scale Diagnostics</td><td>R60TX-3</td><td>Tampon</td></tr> de <tr><td>lysat de cellules entières Caspase-3 clivée/totale Lysat de cellules entières</td><td>Meso Scale Diagnostics</td><td>K15140D</td><td>Kit de détection Caspase 3</td></tr><tr><td>V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human</td><td>Scale Diagnostics K15198D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V-PLEX Human Proinflammatory Panel II (4-Plex)</td><td>Meso Scale Diagnostics</td><td>K15053D</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880</td><td></td> <td>Microscope confocal</td><td>Zeiss</td></tr> <tr><td>LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27</td><td>Zeiss-20X</td><td></td> <td>Objectifs longue distance</td></tr><tr><td>Zeiss AXIOvert.A1</td><td>Microscope à</td><td></td> <td>fond clair</td></tr><tr><td>Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1</td><td>Objectifs Zeiss-10X</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

combinaison d’organoïdes humains et de la technologie organ-on-a-chip pour modéliser des fonctionnalités spécifiques à la région intestinale

Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality

La muqueuse intestinale est une barrière physique et biochimique complexe qui remplit une myriade de fonctions importantes. Il permet le transport, l’absorption et le métabolisme des nutriments et des xénobiotiques tout en facilitant une relation symbiotique avec le microbiote et en limitant l’invasion des micro-organismes. L’interaction fonctionnelle entre les différents types de cellules et leur environnement physique et biochimique est vitale pour établir et maintenir l’homéostasie des tissus intestinaux. La modélisation de ces interactions complexes et de la physiologie intestinale intégrée in vitro est un objectif formidable avec le potentiel de transformer la façon dont de nouvelles cibles thérapeutiques et de nouveaux candidats médicaments sont découverts et développés.
Les technologies Organoïdes et Organ-on-a-Chip ont récemment été combinées pour générer des puces intestinales pertinentes pour l’homme adaptées à l’étude des aspects fonctionnels de la physiologie intestinale et de la physiopathologie in vitro. Les organoïdes dérivés des biopsies du petit (duodénum) et du gros intestin sont ensemencés dans le compartiment supérieur d’une puce d’organe, puis se développent avec succès en monocouches tout en préservant les caractéristiques cellulaires, moléculaires et fonctionnelles distinctes de chaque région intestinale. Les cellules endothéliales microvasculaires spécifiques du tissu intestinal humain sont incorporées dans le compartiment inférieur de la puce de l’organe pour recréer l’interface épithéliale-endothéliale. Cette nouvelle plate-forme facilite l’exposition luminale aux nutriments, aux médicaments et aux micro-organismes, permettant des études sur le transport intestinal, la perméabilité et les interactions hôte-microbe.
Ici, un protocole détaillé est fourni pour l’établissement de puces intestinales représentant le duodénum humain (puce du duodénum) et le côlon (puce du côlon), et leur culture ultérieure sous des déformations continues et de type péristaltisme. Nous démontrons des méthodes d’évaluation du métabolisme des médicaments et de l’induction du CYP3A4 dans la puce du duodénum à l’aide d’inducteurs et de substrats prototypiques. Enfin, nous fournissons une procédure étape par étape pour la modélisation in vitro de la perturbation de la barrière médiée par l’interféron gamma (IFNγ) (syndrome de l’intestin perméable) dans une puce du côlon, y compris des méthodes d’évaluation de l’altération de la perméabilité paracellulaire, des changements dans la sécrétion de cytokines et du profilage transcriptomique des cellules de la puce.

La figure 1D résume la chronologie de la culture de la puce intestinale et illustre les cellules endothéliales intestinales et les organoïdes avant et après l’ensemencement sur la puce. De plus, il démontre les différences morphologiques distinctes entre le duodénum et les puces du côlon, mises en évidence par la présence de formations ressemblant à des villosités dans la puce du duodénum et représentatives de l’architecture de l’intestin grêle.
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Les organoïdes intestinaux dérivés de la biopsie et les technologies d’organes sur puce sont combinés dans une plate-forme microphysiologique pour récapituler la fonctionnalité intestinale spécifique à la région.

Combinaison d’organoïdes humains et de la technologie Organ-on-a-Chip pour modéliser des fonctionnalités spécifiques à la région intestinale

The intestinal mucosa is a complex physical and biochemical barrier that fulfills a myriad of important functions. It enables the transport, absorption, ...

Ce protocole montre comment utiliser les organoïdes intestinaux dérivés de la biopsie et la technologie des organes sur puce pour générer une puce intestinale physiologiquement pertinente qui peut ensuite être utilisée pour prédire la pharmacocinétique et l’interaction médicamenteuse et pour étudier le dysfonctionnement de la barrière épithéliale intestinale. L’unification des organoïdes dans la technologie des organes sur puce nous permet de reproduire la complexité de l’épithélium intestinal. De plus, il permet un meilleur contrôle expérimental des signaux mécaniques, de la distribution des flux et des gradients biochimiques.Cette méthode émule la physiologie complexe de l’intestin humain, ce qui permet de mieux comprendre les bases cellulaires et moléculaires des fonctions intestinales normales et pathologiques. Cela permet de mieux prédire la pharmacocinétique et la pharmacodynamie et les candidats médicaments potentiels pour prévenir les dommages inflammatoires. L’ensemencement est une étape critique du protocole.Une fragmentation excessive ou une densité d’ensemencement inexacte des fragments organoïdes intestinaux peut compromettre le développement et la différenciation de l

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Ce protocole permet de différencier les cellules pluripotentes humaines en organoïdes intestinaux. Le protocole imite le développement humain normal en différenciant les cellules en une population d’endoderme définitif, d’endoderme de l’intestin postérieur, puis d’épithélium intestinal. Cela rend le protocole adapté à la fois à l’étude du développement intestinal et aux applications de modélisation des maladies.

Génération d’organoïdes intestinaux dérivés de hiPSC pour des applications de modélisation du développement et des maladies

Nous présentons ici deux protocoles qui permettent la modélisation des interactions apicales-spécifiques intestinales. Les monocouches intestinales organoïdes-dérivées et les cultures d’interface air-liquide (ALI) facilitent la génération d’épithélium bien différencié accessible des côtés luminal et basolatéral, tandis que les organoïdes intestinaux inversés à polarité exposent leur côté apical et se présentent à des analyses à haut débit.

Méthodes de culture pour étudier les interactions spécifiques aux apicales à l’aide de modèles organoïdes intestinaux

Ce protocole décrit un modèle apico-out d’entérocolite nécrosante (ECN) dans une boîte utilisant des entéroïdes intestinaux grêles à polarité inversée, permettant l’accès à la surface apicale. Nous fournissons un protocole de coloration immunofluorescente pour détecter la perturbation épithéliale liée à l’ECN et une méthode pour déterminer la viabilité des entéroïdes à sortie apicale soumis au protocole NEC-in-a-dish.

In vitro Modèle entéroïde apical-out de l’entérocolite nécrosante

neuroHuMiX est un modèle avancé d’intestin sur puce permettant d’étudier les interactions des cellules bactériennes, épithéliales et neuronales dans des conditions de co-culture proximales et représentatives. Ce modèle permet de démêler les mécanismes moléculaires sous-jacents à la communication entre le microbiome intestinal et le système nerveux.

Un modèle d’intestin sur puce pour étudier l’axe microbiome intestinal-système nerveux

Nous présentons ici un protocole permettant de générer des organoïdes intestinaux de rat et de les utiliser dans plusieurs applications en aval. Les rats sont souvent un modèle préclinique privilégié, et le système organoïde intestinal robuste répond au besoin d’un système in vitro pour accompagner les études in vivo .

Génération et manipulation d’organoïdes intestinaux de rat

Ce protocole décrit un modèle in vitro d’entérocolite nécrosante (NEC), qui peut être utilisé pour des études mécanistiques de la pathogenèse de la maladie. Il est doté d’une puce microfluidique ensemencée d’entéroïdes intestinaux dérivés de l’intestin néonatal humain, de cellules endothéliales et du microbiome intestinal d’un nouveau-né atteint d’une NEC sévère.

Modèle microfluidique d’entérocolite nécrosante incorporant des entéroïdes intestinaux néonatals humains et un microbiome dysbiotique

L’intégration d’organoïdes intestinaux canins et d’un système microfluidique Gut-on-a-Chip offre des modèles translationnels pertinents pour les maladies intestinales humaines. Les protocoles présentés permettent la morphogenèse 3D et la modélisation dynamique in vitro de l’intestin, ce qui contribue au développement de traitements efficaces pour les maladies intestinales chez les chiens et les humains avec One Health.

Morphogenèse tridimensionnelle dans l’intestin canin sur puce à l’aide d’organoïdes intestinaux dérivés de patients atteints de maladies inflammatoires de l’intestin

Notre protocole détaillé décrit la création et l’utilisation du modèle avancé d’intestin sur puce, qui simule la muqueuse intestinale humaine avec des structures 3D et divers types de cellules, permettant une analyse approfondie des réponses immunitaires et des fonctions cellulaires en réponse à la colonisation microbienne.

Modèle d’intestin sur puce immunocompétent pour l’analyse des réponses immunitaires de la muqueuse intestinale

Le protocole combine la technologie des organoïdes intestinaux humains avec l’analyse transcriptomique d’une seule cellule pour fournir des informations significatives sur la biologie intestinale jusqu’alors inexplorée.

Utilisation d’organoïdes intestinaux humains pour comprendre l’épithélium de l’intestin grêle au niveau transcriptionnel d’une seule cellule

Les organoïdes intestinaux humains doivent être innervés pour mieux récapituler la structure et la fonction de l’intestin humain natif. Ici, nous présentons une méthode pour incorporer un système nerveux entérique dans ces constructions.

Innervation des organoïdes intestinaux humains

Découvrez comment combiner des organoïdes intestinaux dérivés de biopsies avec la technologie organ-on-a-chip pour modéliser la physiologie intestinale humaine. Cette méthode permet d'étudier la pharmacocinétique, les interactions médicamenteuses et la dysfonction de la barrière épithéliale.

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Combinaison d’organoïdes humains et de la technologie Organ-on-a-Chip pour modéliser des fonctionnalités spécifiques à la région intestinale

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