In vivo Lecture des lésions vasculaires dans la rétine de souris pour favoriser la reproductibilité

Ce protocole permet à l’utilisateur de mesurer quantitativement des marqueurs cliniquement analogues de dommages dans l’imagerie rétinienne de souris, ce qui renforce la traduisibilité des résultats ultérieurs. Ces méthodes nous permettent de rationaliser l’analyse et nous donnent la possibilité de comparer de manière fiable l’imagerie entre les animaux de laboratoire. Bien que ces méthodes aient été développées pour étudier une vue d’ensemble du modèle murin, elles peuvent facilement s’étendre à la recherche sur toutes les maladies de la rétine qui utilisent les mêmes techniques d’imagerie.

Allumez le boîtier lumineux du microscope imageur rétinien, l’appareil de tomographie par cohérence optique et la plate-forme de souris chauffée. Allumez l’ordinateur et ouvrez le programme d’imagerie. Ajouter une goutte de phényléphrine et de tropicamide à chaque œil.

Injecter 100 microlitres de 1% de fluorescéine intrapéritonéale. Accueillez la souris sur la plate-forme. Ajustez la hauteur et l’angle de la plate-forme jusqu’à ce que la vue du fond d’œil rétinien soit claire et nette.

Prenez une photo du fond d’œil. Ouvrez le logiciel d’imagerie et de tomographie par cohérence optique. Dans le programme de tomographie par cohérence optique, ajustez le nudge à 10.

Prenez une image de tomographie par cohérence optique, ajoutez 75 micromètres distaux de la brûlure. Répétez l’opération pour les trois autres quadrants de la rétine. Basculez la caméra sur un filtre de 488 nanomètres.

Augmentez le gain de la caméra à 5. Prenez une photo du fond d’œil exactement 5 minutes après l’injection de fluorescéine. Ouvrez l’image de fluorescéine sur le logiciel de traitement d’image.

Dupliquez l’image. À l’aide d’un outil de sélection, tracez soigneusement les principaux navires. Ignorez tous les navires qui se ramifient à partir de ces navires.

Dans la première image, supprimez la sélection, ne laissant que le vaisseau. Enregistrez cette image masquée. Déplacez la sélection vers la deuxième image, inversez la sélection et supprimez-la, isolant l’arrière-plan.

Enregistrez cette image masquée. Ouvrez l’image d’arrière-plan et mesurez la densité intégrée. Ouvrez l’image des vaisseaux, sélectionnez le contour des vaisseaux, puis mesurez l’intensité moyenne.

Diviser la densité intégrée du bruit de fond par l’intensité moyenne des vaisseaux, générant le rapport de fuite pour l’œil. Notez ce rapport de fuite pour chaque œil dans une cohorte expérimentale. Pour mieux contrôler le bruit de fond, normaliser les yeux expérimentaux au rapport de fuite moyen des yeux témoins non blessés.

Ouvrez l’image de tomographie par cohérence optique dans le logiciel de traitement d’image. Tracez les bordures de la couche de cellules ganglionnaires, de la couche plexiforme interne, de la couche nucléaire interne, de la couche plexiforme externe, de la couche photoréceptrice et de la couche RPE. Exportez les fichiers au format CSV.

Mesurer l’épaisseur moyenne de chaque couche et répéter pour chaque œil de la cohorte expérimentale. Ouvrez l’image de tomographie par cohérence optique dans l’image J.À l’aide de l’outil de ligne, mesurez la distance où le bord supérieur de la couche plexiforme externe est indistinct. Mesurez horizontalement, en maintenant la latitude où commence la désorganisation.

Calculez la somme des distances désorganisées dans l’image. Divisez la durée de désorganisation par la longueur totale de la rétine pour obtenir le rapport de désorganisation. Répétez la mesure et le calcul des images de tomographie par cohérence optique des trois autres quadrants de la rétine.

Prenons la moyenne des rapports de désorganisation à partir des quatre images de tomographie par cohérence optique. Ce nombre représente la désorganisation moyenne pour l’ensemble de la rétine. Répéter pour chaque œil de la cohorte expérimentale.

Les images masquées utilisées pour le calcul du ratio de fuite pour chaque image de la rétine peuvent être comparées à d’autres et analysées, séparant le système vasculaire majeur des autres zones de la rétine. La quantification de la fluorescéine permet de comparer la gravité des blessures et l’efficacité du traitement, ainsi que d’étudier les changements dans les fuites au cours de la période de la blessure. Une délimitation des couches de la rétine dans une image OCT est observée.

La quantification de l’épaisseur pour chaque couche rétinienne montre que la réponse œdémateuse initiale a un effet plus profond sur les couches internes de la rétine. À partir d’une analyse de l’évolution temporelle des lésions de l’occlusion veineuse rétinienne, le gonflement inflammatoire initial des couches rétiniennes et l’amincissement dégénératif éventuel peuvent être observés. La couche nucléaire interne subit une réponse beaucoup plus importante à la blessure initiale, mais la couche plexiforme interne présente un amincissement plus sévère après que l’œdème initial a été stabilisé et revient à la ligne de base.

La désorganisation de la couche interne de la rétine se manifeste par une disparition de la limite supérieure de la couche plexiforme externe, mélangeant les couches plexiformes externes et nucléaires internes. La désorganisation rétinienne de deux groupes expérimentaux a été comparée pour étudier l’efficacité d’un inhibiteur dans l’atténuation des dommages rétiniens. La qualité de l’image est d’une importance vitale pour la qualité de l’analyse.

Lors de l’acquisition d’images rétiniennes, prenez le temps de vous assurer que le fond d’œil et les couches rétiniennes sont aussi clairs et concentrés que possible. Ces méthodes non invasives peuvent être utilisées longitudinalement et en conjonction avec l’étude biochimique et immunohistochimique des tissus pour créer des profils plus multidimensionnels et détaillés de la maladie. Cette technique permet de quantifier de manière fiable les données d’imagerie rétinienne in vivo dans des modèles de maladies neurovasculaires afin que les données puissent être plus facilement traduites en maladie humaine.