Name: Reconstitution de cortex minimembranaires d’actine sur des bicouches lipidiques soutenues (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Découvrez comment assembler des réseaux d'actomyosine ancrés à la membrane pour étudier leur dynamique par microscopie à fluorescence avancée. Cette méthode permet l'ajout séquentiel de protéines sans perturber l'intégrité du réseau cytosquelettique.

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Ce travail a été soutenu par le fonds de recherche AXA et le programme de biomédecine quantitative Warwick-Wellcome (Wellcome ISSF, RMRCB0058) pour DVK, NCBS-TIFR pour AB et ST, et la bourse Wellcome-DBT Margdarshi (IA/M/15/1/502018) pour SM. DVK tient également à remercier la Biophysical Society d’avoir permis l’événement de réseautage virtuel « Challenges in understanding multi-component cytoskeletal networks from the molecular to the meso-scale », qui a contribué à la création de cette collection de protocoles.

<ol><li>Köster, D. V., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+and+the+plasma+membrane%3A+Inextricably+intertwined%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cortical actin and the plasma membrane: Inextricably intertwined.</a> Current Opinion in Cell Biology. 38, 81-89 (2016).</li>
<li>Rao, M., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+organization+of+membrane+constituents+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Active organization of membrane constituents in living cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 29, 126-132 (2014).</li>
<li>Honigmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lipid+bound+actin+meshwork+organizes+liquid+phase+separation+in+model+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A lipid bound actin meshwork organizes liquid phase separation in model membranes.</a> eLife. 3, 01671(2014).</li>
<li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stratification+relieves+constraints+from+steric+hindrance+in+the+generation+of+compact+actomyosin+asters+at+the+membrane+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Stratification relieves constraints from steric hindrance in the generation of compact actomyosin asters at the membrane cortex.</a> Science Advances. 6 (11), (2020).</li>
<li>Köster, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+dynamics+drive+local+membrane+component+organization+in+an+in+vitro+active+composite+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Actomyosin dynamics drive local membrane component organization in an in vitro active composite layer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (12), 1645-1654 (2016).</li>
<li>Vogel, S. K., Heinemann, F., Chwastek, G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+MACs+%28minimal+actin+cortices%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">The design of MACs (minimal actin cortices).</a> Cytoskeleton. 70 (11), 706-717 (2013).</li>
<li>Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+contractile+actomyosin+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of contractile actomyosin arrays.</a> Methods in Enzymology. 540, 265-282 (2014).</li>
<li>Mosby, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+filament+dynamics+in+actin+networks+revealed+with+interferometric+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Myosin II filament dynamics in actin networks revealed with interferometric scattering microscopy.</a> Biophysical Journal. 118 (8), 1946-1957 (2020).</li>
<li>Seara, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entropy+production+rate+is+maximized+in+non-contractile+actomyosin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Entropy production rate is maximized in non-contractile actomyosin.</a> Nature Communications. 9 (1), 4948(2018).</li>
<li>Linsmeier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disordered+actomyosin+networks+are+sufficient+to+produce+cooperative+and+telescopic+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility.</a> Nature Communications. 7, 12615(2016).</li>
<li>Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+motors+fragment+and+compact+membrane-bound+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments.</a> eLife. 2, 00116(2013).</li>
<li>Ditlev, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+composition-dependent+molecular+clutch+between+T+cell+signaling+condensates+and+actin%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A composition-dependent molecular clutch between T cell signaling condensates and actin.</a> eLife. 8, 42695(2019).</li>
<li>Banjade, S., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+transitions+of+multivalent+proteins+can+promote+clustering+of+membrane+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Phase transitions of multivalent proteins can promote clustering of membrane receptors.</a> eLife. 3, 04123(2014).</li>
<li>Heinemann, F., Vogel, S. K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+membrane+diffusion+modulated+by+a+minimal+actin+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Lateral membrane diffusion modulated by a minimal actin cortex.</a> Biophysical Journal. 104 (7), 1465-1475 (2013).</li>
<li>Vogel, S. K., Greiss, F., Khmelinskaia, A., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+lipid+domain+organization+by+a+biomimetic+contractile+actomyosin+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Control of lipid domain organization by a biomimetic contractile actomyosin cortex.</a> eLife. 6, 24350(2017).</li>
<li>Block, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brownian+motion+at+lipid+membranes%3A+A+comparison+of+hydrodynamic+models+describing+and+experiments+quantifying+diffusion+within+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Brownian motion at lipid membranes: A comparison of hydrodynamic models describing and experiments quantifying diffusion within lipid bilayers.</a> Biomolecules. 8 (2), 30(2018).</li>
<li>JoVE, JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Methods+Collection.+In+vitro+reconstitution+of+cytoskeleton+networks+for+biomaterials%2C+biophysics+and+active+matter+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Methods Collection. In vitro reconstitution of cytoskeleton networks for biomaterials, biophysics and active matter research.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Pardee, J. D., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+muscle+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Purification of muscle actin.</a> Methods in Enzymology. 85, 164-181 (1982).</li>
<li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction.+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li>
<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+purification+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Myosin purification and characterization.</a> Methods in Cell Biology. 24, 331-371 (1982).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+protein+with+SDS-PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Separating protein with SDS-PAGE.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WH2+and+proline-rich+domains+of+WASP-family+proteins+collaborate+to+accelerate+actin+filament+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">WH2 and proline-rich domains of WASP-family proteins collaborate to accelerate actin filament elongation.</a> The EMBO Journal. 37 (1), 102-121 (2018).</li>
<li>Shrivastava, R., Köster, D., Kalme, S., Mayor, S., Neerathilingam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailor-made+ezrin+actin+binding+domain+to+probe+its+interaction+with+actin+in-vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tailor-made ezrin actin binding domain to probe its interaction with actin in-vitro.</a> PLoS One. 10 (4), 0123428(2015).</li>
<li>Nye, J. A., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+control+of+histidine-tagged+protein+surface+density+on+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Kinetic control of histidine-tagged protein surface density on supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 24 (8), 4145-4149 (2008).</li>
<li>Honigmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+STED-FCS+reveals+spatiotemporal+heterogeneity+of+lipid+interaction+in+the+plasma+membrane+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Scanning STED-FCS reveals spatiotemporal heterogeneity of lipid interaction in the plasma membrane of living cells.</a> Nature Communications. 5, 5412(2014).</li>
<li>Selden, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+programmed+cell+adhesion+with+membrane-anchored+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Chemically programmed cell adhesion with membrane-anchored oligonucleotides.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (2), 765-768 (2012).</li>
<li>Seu, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+surface+treatment+on+diffusion+and+domain+formation+in+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).</li>
<li>Kang, M., Day, C. A., Kenworthy, A. K., DiBenedetto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+equation+to+extract+diffusion+coefficients+from+confocal+FRAP+data%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Simplified equation to extract diffusion coefficients from confocal FRAP data.</a> Traffic. 13 (12), 1589-1600 (2012).</li>
<li>Kang, M., Day, C. A., Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+computational+framework+for+D%28t%29+from+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching+data+reveals+various+anomalous+diffusion+types+in+live+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">A novel computational framework for D(t) from Fluorescence Recovery after Photobleaching data reveals various anomalous diffusion types in live cell membranes.</a> Traffic. 20 (11), 867-880 (2019).</li>
<li>Lorén, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+recovery+after+photobleaching+in+material+and+life+sciences%3A+Putting+theory+into+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Fluorescence recovery after photobleaching in material and life sciences: Putting theory into practice.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (3), 323-387 (2015).</li>
<li>Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motors+robustly+drive+active+gels+to+a+critically+connected+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state.</a> Nature Physics. 9 (7), 1-7 (2013).</li>
<li>Andrecka, J., Spillane, K. M., Ortega-Arroyo, J., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+and+control+of+Supported+lipid+bilayer+formation+with+interferometric+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Direct observation and control of Supported lipid bilayer formation with interferometric scattering microscopy.</a> ACS Nano. 7 (12), 10662-10670 (2013).</li>
<li>Lin, W. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+membrane+formation%2C+characterization%2C+functionalization%2C+and+patterning+for+application+in+biological+science+and+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Supported membrane formation, characterization, functionalization, and patterning for application in biological science and technology.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 2 (4), 235-269 (2010).</li>
<li>Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+solid-supported+lipid+bilayers%3A+An+integrated+view%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view.</a> Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).</li>
<li>Sapuri-Butti, A. R., Butti, R. C., Parikh, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+supported+membranes+on+topographically+patterned+polymeric+elastomers+and+their+applications+to+microcontact+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Characterization of supported membranes on topographically patterned polymeric elastomers and their applications to microcontact printing.</a> Langmuir. 23 (25), 12645-12654 (2007).</li>
<li>Leptihn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+droplet+interface+bilayers+from+the+contact+of+aqueous+droplets+in+oil%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulated+actomyosin+patterns+drive+cell-like+membrane+shape+changes%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes.</a> iScience. 25 (5), 104236(2022).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+encapsulation+of+reconstituted+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), e63332(2021).</li>
<li>Murrell, M., Chen, S., Sun, Z. G. In vitro reconstitution of actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurrell%2C+M+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22">Journal of Visualized Experiments</a>. , (2022).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Ce protocole présente une plate-forme polyvalente et un point de départ pour concevoir des expériences visant à étudier l’interface membrane-cortex des cellules. Les étapes critiques sont la préparation de lames de verre propres, l’utilisation de lipides frais pour une formation efficace de SUV (les deux affectant la qualité des SLB), et l’utilisation de protéines de myosine II fraîchement recyclées pour la réorganisation dynamique du filament d’actine. Lors de l’imagerie de la dynamique sur une longue période, il est très important d’incorporer un système de piégeage de l’oxygène (par exemple, l’acide protocatéchuique et la protocatéchuate 3 4-dioxygénase 5,31).
La conception à chambre ouverte permet l’ajout séquentiel de composants à un système existant sans induire de flux lipidiques. Cela peut être un avantage important par rapport aux approches à chambre fermée couramment utilisées ou au travail utilisant des protéines encapsulées dans les liposomes36. Les effets contraires tels que la déformation membranaire induite par les protéines ne peuvent pas être étudiés avec des bicouches lipidiques adsorbées par du verre.
Les bicouches lipidiques peuvent être formées avec une large gamme de compositions lipidiques. Elle commence par l’adsorption des vésicules lipidiques à la surface du verre hydrophile, suivie soit d’une rupture spontanée des vésicules due aux interactions surface-vésicule et vésicule-vésicule directe, soit par les vésicules adsorbées atteignant une couverture critique, après quoi une petite fraction des vésicules se rompt, formant des bords actifs, ce qui conduit finalement à la formation de bicouche32 . Outre le verre, divers substrats peuvent être utilisés pour former des bicouches lipidiques supportées, telles que le mica (par exemple, pour la microscopie à force atomique), les substrats mous (par exemple, le poly-di-méthyl-siloxane), les coussins polymères33,34,35, couvrant entre les trous des grilles de microscopie électronique 14. Les bicouches d’interface gouttelettes sont une autre méthode intéressante pour créer des bicouches lipidiques stableset autonomes 36. L’inclusion de réseaux d’acto-myosine dans des vésicules ou des émulsions est une méthode très puissante pour étudier ce système minimal dans une géométrie cellulaire37,38, et qui est décrite en détail ailleurs 39.

La membrane plasmique d’une cellule animale vivante interagit constamment avec le cytosquelette d’actine adjacent, et ensemble ils forment un matériau composite actif qui remplit une multitude de fonctions cellulaires 1,2. Pour étudier les processus à cette interface membrane lipidique-actine, la reconstitution des réseaux cytosquelettiques au-dessus des bicouches lipidiques (SLB) prises en charge s’est avérée très utile. Cette approche systémique minimale permet le contrôle précis des composants du réseau du cytosquelette et de la composition lipidique. Par rapport aux membranes lipidiques autonomes des vésicules unilamellaires géantes, la géométrie plane des SLB permet une utilisation efficace des techniques de microscopie de pointe telles que la super-résolution3,4, la fluorescence par réflexion interne totale (TIRF)5,6,7 ou la diffusion interférométrique 8 étudier l’organisation spatiale et la dynamique des réseaux cytosquelettiques. TIRF fournit le contraste le plus élevé pour les composants marqués par fluorescence, car le signal des molécules marquées non liées dans la solution contribuant au signal de fond est minime.
Nous décrivons ici un protocole de base pour la formation de réseaux d’actomyosine attachés à des bicouches lipidiques supportées, qui sont largement utilisés dans le domaine pour étudier la physique des réseaux actifs quasi-2D 9,10,11 et leur effet sur l’organisation membranaire3,5,12,13,14,15,16 (Figure 1 ). Cette approche ne se limite pas aux réseaux à base d’actine, mais peut également être facilement adaptée pour explorer des microtubules, des filaments intermédiaires ou des réseaux composites de nature mixte et pour étudier une variété d’interactions entre les protéines membranaires lipidiques et les composants du cytosquelette à l’aide de méthodes de microscopie sensibles à la surface.
Pour garder ce protocole ciblé, nous avons exclu une description détaillée de la purification et du marquage des protéines d’actine et de myosine ou des détails sur la façon de régler et de contrôler la contractilité et l’organisation des réseaux d’actomyosine. Il convient de se référer à d’autres protocoles publiés parallèlement à celui-ci dans la collection de méthodes JoVE, In Vitro Reconstitution of Cytoskeleton Networks for Biomaterials, Biophysics and Active Matter Research17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63968/63968fig01.jpg"> Figure 1 : Schéma du système composite actif actine-membrane in vitro. Créé avec Biorender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/63968fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>1,2 dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- (lissamine, rhodamine B, sulfonyle)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810158</td><td>16:0 RhoPE</td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3- [(N-(5-amino-1 carboxypentyl) iminodiacetic) succinyl] (sel de nickel)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790404</td><td>DGS-NTA-Ni2+</td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td>DOPC</td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850355</td><td>DPPC</td></tr><tr><td>Flacons en verre ambré</td><td>ThermoFisher</td><td>B7990-2A</td><td></td></tr><tr><td>ATP Sel disodique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Chambre cellulaire Attofluor</td><td>ThermoFisher</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Sonicateur à bain</td><td>GT Sonic</td><td>1860QTS</td><td></td></tr><tr><td>bêta-caséine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6905</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>12135</td><td></td></tr><tr><td>chloroforme</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650471</td><td>alternativement de Electron Microscopy Sciences, 50980296</td></tr><tr><td>Couvercles, #1, 25 mm de diamètre, Gold Seal</td><td>Harvard Apparatus</td><td>64-0705B</td><td></td></tr><tr><td>Feuillets de protection, #1, 40x22 mm, Sceau d’or</td><td>ThermoFisher</td><td>48404-031</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>G12635</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Himedia</td><td>MB130</td><td></td></tr><tr><td>Seringues en verre étanches au gaz, avec aiguille amovible, émoussée, volumes 10 & micro ; L, 100 et micro ; L, 500 et micro ; L</td><td>Hammilton</td><td>série 1700</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Hellma Analytics</td><td>Z805939</td><td>solution de nettoyage</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Himedia</td><td>RM380</td><td></td></tr><tr><td>KaH2PO4</td><td>ThermoFisher</td><td>G13405</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>ThermoFisher</td><td>G13305</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>ThermoFisher</td><td>G26708</td><td></td></tr><tr><td>Extrudeuse de lipides</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>61000-1EA</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>G15535</td><td></td></tr><tr><td>Sonicateur à micropointes</td><td>Sonics</td><td>VC750</td><td>3 mm Diamètre de l’embout</td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>ThermoFisher</td><td>G15955</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Himedia</td><td>GRM853</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>ThermoFisher</td><td>G15825</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>ThermoFisher</td><td>G27815</td><td></td></tr><tr><td></td> Microscope <td></td><td>Nikon Ti Eclipse Nikon</td><td>Avec une unité TIRF reliée par une fibre optique préservant la polarisation à un combineur laser monolithique Agilent MLC400 avec plusieurs lignes laser avec un objectif à huile Nikon 100X, 1,45 NA avec deux caméras EMCCD de 512 x 512 pixels (Photometrics Evolve 512) avec un objectif à huile Nikon 100X, 1,45 NA avec deux caméras EMCCD de 512 x 512 pixels (Photometrics Evolve 512)</td></tr><tr><td>NOA88</td><td>Norland Products</td><td>8801</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler revêtue de PTFE Sonde de style #2A</td><td>de structure</td><td>0S2AT-XD</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse réfrigérée</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>ThermoFisher</td><td>G15925</td><td></td></tr><tr><td>L’illuminateur UV</td><td>Novascan</td><td>PSD PRO-UV</td><td>a besoin d’un vide et d’une alimentation en O2</td></tr></tbody></table>

reconstitution de cortex minimembranaires d’actine sur des bicouches lipidiques soutenues

Reconstitution of Membrane-Tethered Minimal Actin Cortices on Supported Lipid Bilayers

La surface d’une cellule vivante fournit une plate-forme active polyvalente pour de nombreux processus cellulaires, qui découlent de l’interaction de la membrane plasmique avec le cortex d’actine sous-jacent. Au cours des dernières décennies, des systèmes minimaux reconstitués basés sur des bicouches lipidiques soutenues en combinaison avec des réseaux de filaments d’actine se sont révélés très utiles pour démêler les mécanismes de base et les conséquences des réseaux d’actine attachés à la membrane, ainsi que pour étudier les fonctions des protéines individuelles associées à la membrane. Ici, nous décrivons comment reconstituer de tels systèmes composites actifs in vitro qui consistent en des bicouches lipidiques soutenues par un fluide couplées via des protéines de liaison à l’actine associées à la membrane à des filaments d’actine dynamiques et des moteurs de myosine qui peuvent être facilement observés par microscopie à fluorescence par réflexion interne totale. Une conception à chambre ouverte permet d’assembler le système étape par étape et de contrôler systématiquement de nombreux paramètres tels que la concentration de protéines de liaison, la concentration d’actine, la longueur du filament d’actine, le rapport actine / myosine, ainsi que les niveaux d’ATP. Enfin, nous discutons de la façon de contrôler la qualité du système, de la façon de détecter et de résoudre les problèmes courants et de certaines limites de ce système par rapport à la surface de la cellule vivante.

Pour la représentation, voici un profil post-blanchiment typique de la 1ère image après photoblanchiment (image à t = 0 s sur la figure 3A) et son ajustement à la fonction suivante28 (voir Figure 6A) :
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63968/63968eq04.jpg" style="margin: auto;">
La valeur de r e (23,94 μm) calculée par l’ajustement à cette courbe est très similaire à la valeur r e calculée à l’étape 2.8.4. (23,24 μm). Ici, K est un paramètre de profondeur d’eau de Javel qui peut être directement estimé à partir de F0 (décrit à l’étape 2.8.4.). De même, la figure 6B montre le profil de récupération et son ajustement à la fonction28 suivante :
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63968/63968eq05.jpg" style="margin: auto;">
Nous constatons que la valeur ajustée du coefficient de diffusion est de 1,34 μm 2/s, une valeur qui correspond étroitement à la valeur de 1,39 μm 2/s calculée par la formule de l’étape2.8.4. Ici, MF représente la fraction mobile de la bicouche lipidique qui représente la fraction de la population blanchie qui se rétablit. La mobilité des molécules ancrées dans les lipides dépend bien sûr de la composition lipidique et de son état physique (phase liquide ou gel). Pour nos expériences utilisant des membranes lipidiques à base de DOPC, la mobilité doit être de &gt;1 μm2/s, et la fraction mobile ne doit pas être inférieure à 0,9 pour indiquer une bonne bicouche lipidique. Nous recommandons l’utilisation de la méthode sans ajustement manuel pour un test rapide de la qualité et de la mobilité de la bicouche. La méthode d’ajustement peut être utile lors de l’automatisation de l’analyse de nombreuses courbes FRAP. De plus, si l’on veut effectuer une expérience FRAP plus sophistiquée pour caractériser systématiquement la diffusion dans le système, nous recommandons au lecteur de cette revue de Lorén et al.30 pour plus de détails sur les modèles d’ajustement et les pièges potentiels dans la conception expérimentale.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63968/63968fig06.jpg"> Figure 6 : Quantification du coefficient de diffusion des bicouches lipidiques. (A) Profil linéaire de la première image après photoblanchiment (t = 0 s sur la figure 3A) et son ajustement à l’équation 4 pour calculer le rayon effectif d’eau de Javel. (B) Le profil de récupération de la région blanchie et son adéquation à l’équation 5 pour calculer le coefficient de diffusion et la fraction mobile. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/63968fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Un résultat typique des expériences décrites ci-dessus montrant l’assemblage dynamique et l’organisation d’un réseau d’acto-myosine lié à une bicouche lipidique supportée imagée par microscopie TIRF est illustré à la figure 7 et à la vidéo supplémentaire S1.
La figure 7 montre un montage d’image de la protéine de liaison, de la F-actine et de la myosine-II.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63968/63968fig07.jpg"> Figure 7 : Les flux d’actomyosine contractile entraînent le regroupement local de la protéine de liaison membrane-actine HYE. Instantanés TIRF de HYE (marqué YFP), de filaments d’actine (marqués avec Atto-635 maleimide) et de filaments de myosine II (marqués avec Atto-565 maleimide) lors de l’ajout de myosine II à un SLB contenant HYE et F-actine. Le temps est indiqué en haut : 0 min est immédiatement avant que les myofilaments fluorescents ne commencent à apparaître dans le champ FRBR. HYE et F-actine sont répartis de manière homogène sur la bicouche lipidique avant l’ajout de myosine (0 min). L’activité de la myosine induit des flux d’actomyosine contractile, qui émergent en structures de type aster à l’état d’équilibre (15 min), entraînant un regroupement local du composant membranaire couplé (HYE). La rangée inférieure est une fusion d’images d’actine (jaune) et de myosine II (magenta) montrant l’organisation de l’actine et de la myosine à différents moments. Les images utilisées dans la réalisation de ces montages ont été corrigées aux Fidji pour le signal de fond, les motifs d’intensité non uniformes et les mouvements de translation. Barre d’échelle = 10 μm. Pour plus de détails, voir Vidéo supplémentaire S1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/63968fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nom de la mémoire tampon</td>
			<td colspan="2">Composition</td>
		</tr><tr><td>Tampon de réhydratation lipidique</td>
			<td colspan="2">50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5% saccharose, pH 7,5</td>
		</tr><tr><td>Tampon SLB Formation</td>
			<td colspan="2">50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 5-6</td>
		</tr><tr><td>Tampon de stockage SLB</td>
			<td colspan="2">50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,2</td>
		</tr><tr><td>Tampon de dilution des protéines</td>
			<td colspan="2">20 mM HEPES, 100 mM KCl, 1mM TCEP ou DTT, pH 7,2</td>
		</tr><tr><td>Tampon échangeur d’ions 1X ME ou Actin</td>
			<td colspan="2">50 mM MgCl2, 0,2 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7,2 (conserver à 4°C)</td>
		</tr><tr><td>1X tampon de polymérisation KMEH ou Actine</td>
			<td colspan="2">50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 50 mM HEPES, pH 7,2</td>
		</tr><tr><td>100 mM de stock ATP</td>
			<td colspan="2">100 mM de sel disodique ATP, 50 mM de Tris, 50 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2, 2 mM d’EGTA, pH 7,5 (à conserver à -20°C)</td>
		</tr><tr><td>2x Tampon cible</td>
			<td colspan="2">2x KMEH, 2 mg/ml de BSA, 2mM d’ATP, 5mM de PTCE (conservés à 4°C)</td>
		</tr><tr><td>G-buffer</td>
			<td colspan="2">Tris 2 mM, CaCl2 0,1 mM, 0,2 mM ATP, 0,5 mM de PTCE, NaN3 à 0,04 %, pH 8 (à conserver à 4 °C)</td>
		</tr><tr><td>Tampon myosine II</td>
			<td colspan="2">500 mM KCl, 1 mM EDTA, 10-20 mM Hepes, pH 7,0</td>
		</tr><tr><td>Tampon de chromatographie par filtration sur gel</td>
			<td colspan="2">50 mM Tris-HCl, 150-300 mM NaCl, 5 mM TCEP, 0,1% Tween-20, pH 7,5</td>
		</tr><tr><td>Protéine de bouchage Tampon de stockage</td>
			<td colspan="2">10 mM Tris· Cl, 50 mM NaCl, 1 mM de PTCE, pH 7,5, glycérol à 20 %</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Liste des compositions tampons utilisées dans le présent protocole.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Problèmes courants et leur dépannage</td>
			<td>Problème</td>
			<td colspan="4">Cause</td>
			<td colspan="4">Solutions possibles</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>La bicouche lipidique ne montre aucune diffusion</td>
			<td colspan="4">La cause la plus probable de ce problème est le verre de couverture sale qui peut se produire lorsque la solution de nettoyage est vieillie ou que le chauffage n’a pas eu lieu pendant la sonication du bain. Ces bicouches ont un aspect « vésiculaire » car les vésicules éclatées collent au verre de couverture mais ne fusionnent pas les unes avec les autres. L’utilisation de VUM de plus de 6 semaines ou de VUS de plus de 6 jours, ou l’ajout de faibles quantités de VUS peut également entraîner la formation de bicouches vésiculeuses.</td>
			<td colspan="4">Utilisez une solution de nettoyage fraîche. Assurez-vous que le chauffage est allumé et que la température se situe entre 45 et 65 °C. Utilisez des mélanges de lipides frais. (L’utilisation d’une sonde lipidique fluorescente par rapport à une sonde protéique fluorescente peut parfois se manifester différemment. Par exemple, si la bicouche présente des défauts de sous-diffraction et que l’étape de passivation de surface est sautée (ou ne fonctionne pas), la sonde lipidique montrera une distribution d’intensité uniforme, mais la sonde protéique fluorescente peut afficher des taches fluorescentes brillantes.)</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>La bicouche lipidique a des taches brillantes</td>
			<td colspan="4">Une longue incubation de VUS pour la formation de bicouches peut créer une bicouche lipidique qui diffuse globalement, mais avec des taches lumineuses occasionnelles. Ces patchs peuvent être des bicouches multicouches qui peuvent attirer de grandes quantités de sondes fluorescentes.</td>
			<td colspan="4">15-20 min d’incubation avec des SUV suffisent. Assurez-vous que la sonde ne s’agrège pas : un spin dur rapide de la protéine linker (300 x g pendant 15 min à 4 °C) peut éliminer les agrégats</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>La bicouche lipidique a des trous sombres</td>
			<td colspan="4">Cela se produit lorsque la bicouche est fabriquée à partir de vieux VUS et imagée pendant des heures prolongées (&gt; 4 heures après la formation), ou lorsque le pH de la solution change radicalement en raison d’une imagerie prolongée (par exemple, dans l’état ATP élevé et en présence de certains piégeurs d’oxygène), ou lorsque la surface est sur-passivée avec de la bêta-caséine (ajouter trop de bêta-caséine pendant plus de 10-15 minutes et ou ne pas la laver).</td>
			<td colspan="4">Utilisez des lipides frais. Réduisez la fréquence d’images de l’imagerie ou le temps d’éclairage laser effectif. Utilisez des tampons avec une capacité de mise en mémoire tampon plus élevée.</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>La bicouche lipidique montre une diffusion lente</td>
			<td colspan="4">Les bicouches lipidiques avec un pourcentage élevé de cholestérol, des lipides saturés longs ou des lipides chargés diffusent plus lentement.</td>
			<td colspan="4">Dans de tels cas, préparez votre échantillon à haute température. On peut également utiliser une composition lipidique simple et testée comme témoin avec des compositions lipidiques complexes et non testées. Assurez-vous que le verre est propre.</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>L’actine ne polymérise pas</td>
			<td colspan="4">Le tampon cible est ancien, le stock de G-actine est trop vieux, l’ancienne et la nouvelle G-actine ont été copolymérisées.</td>
			<td colspan="4">Assurez-vous que le Ca 2+ est remplacé par Mg2+ avant polymérisation (en utilisant un tampon ME). Utilisez du bouillon d’ATP-Mg2+ frais. Utilisez de la G-actine fraîchement recyclée. Assurez-vous que la concentration de F-actine (en termes de G-actine) ajoutée à la bicouche est supérieure à 0,2 μM. Pour des concentrations plus faibles, utilisez de la F-actine stabilisée à la phalloïdine.</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>L’actine ne se lie pas à la bicouche</td>
			<td colspan="4">L’agent de liaison membrane-actine n’est pas ajouté ou ajouté à une très faible concentration, ce qui peut être déduit de la fluorescence de la protéine de liaison. Si la fluorescence est décente, l’agent de liaison membrane-actine a perdu sa capacité de liaison à l’actine. De plus, si la protéine de liaison est non spécifiquement liée à la surface du verre (lorsque la bicouche est mauvaise), elle pourrait ne pas recruter de filaments d’actine.</td>
			<td colspan="4">Assurez-vous que la bicouche diffuse. Utilisez une protéine de liaison fraîche</td>
		</tr><tr><td>7</td>
			<td>Le signal fluorescent F-actine est faible</td>
			<td colspan="4">Le rapport entre l’actine marquée et l’actine foncée est trop faible. L’actine marquée ou l’actine non marquée est trop ancienne et elles ne copolymérisent pas l’une avec l’autre.</td>
			<td colspan="4">Recyclez à nouveau l’actine et recommencez la ploymérisation avec de l’actine fraîchement recyclée. Les photodommages peuvent détruire ou dépolymériser la F-actine; Si possible, utilisez des colorants rouges ou rouge lointain pour l’actine (et la myosine).</td>
		</tr><tr><td>8</td>
			<td>La myosine ne montre pas de contractilité</td>
			<td colspan="4">on peut observer qu’après l’ajout d’ATP au système infusé de myosine, il n’y a pas de contractilité de l’acto-myosine.</td>
			<td colspan="4">Vérifiez si la concentration ou le niveau de pureté de la myosine est bon. Utilisez de la myosine fraîchement recyclée (utilisez dans les 6 semaines suivant le recyclage). L’ajout d’ATP frais au mélange de myosine peut aider. Tampons de dégazage et utilisation de piégeurs d’oxygène, etc. peut réduire les photodommageables des moteurs.  D’autres informations peuvent être trouvées dans les protocoles de Plastino et al. ou Stam et al. de la même collection de méthodes</td>
		</tr><tr><td>9</td>
			<td>Le verre de couverture n’est pas hydrophile</td>
			<td colspan="4">Le verre de couverture n’est pas nettoyé correctement.</td>
			<td colspan="4">Un verre de couverture hydrophillique propre est crucial pour la formation de bicouche lipidique. Une lecture visuelle utile de l’hydrophilie du verre de couverture après le protocole de nettoyage consiste à observer le mouillage du verre par l’eau. Ajoutez un petit volume d’eau à une lamelle de couverture plate. L’eau restera sous la forme d’une gouttelette ronde si la lamelle de couverture n’est pas nettoyée correctement. Cependant, le même volume d’eau va s’étaler et former une fine couche, sur un verre hydrophile traité. Ce comportement mouillant de l’eau sur la surface du verre de couverture peut être utilisé pour déterminer si les étapes de nettoyage avec la solution de nettoyage / NaOH ont fonctionné.</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 2 : Guide de dépannage résumant les problèmes courants et les solutions correspondantes. 
Vidéo supplémentaire S1 : Les flux contractiles d’actomyosine entraînent le regroupement local de la protéine de liaison membrane-actine HYE. Timelapse TIRF de HYE (marqué YFP), de filaments d’actine (marqués avec Atto-635 maleimide) et de filaments de myosine II (marqués avec Atto-565 maleimide) lors de l’ajout de myosine II à un SLB contenant HYE et F-actine. Le temps est indiqué en haut : 0 min est immédiatement avant que les myofilaments fluorescents ne commencent à apparaître dans le champ FRBR. Barre d’échelle = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/S1Movie_Act_myo_Hye_merge_timestamp_15fps.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Ce protocole décrit la formation de bicouches lipidiques soutenues et l’ajout de filaments cytosquelettiques et de protéines motrices pour étudier la dynamique de réseaux cytosquelettiques reconstitués et attachés à la membrane à l’aide de la microscopie à fluorescence.

Reconstitution de cortex minimembranaires d’actine sur des bicouches lipidiques soutenues

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane ...

Ici, nous démontrons une procédure relativement simple et directe pour assembler des réseaux d’actomyosine attachés à la membrane et étudier la dynamique à l’aide de techniques avancées de microscopie optique. Le principal avantage est que notre test permet l’ajout séquentiel de protéines et de petites molécules sans perturber les réseaux attachés à la membrane. Cette méthode peut être facilement adaptée pour étudier d’autres protéines cytosquelettiques ou des réseaux composites.La partie la plus critique du protocole est de s’assurer que la bicouche lipidique supportée est formée correctement, donc d’abord, nous avons dû maîtriser cette étape avant de commencer à ajouter les protéines cytosquelettiques. Pour commencer, prenez trois à cinq lamelles de verre rectangulaires et placez-les dans un pot de colin. Allumez le sonicateur de bain et réglez la température à 65 degrés Celsius.Remplissez le pot de coplin avec une solution de nettoyage à 2% pour immerger complètement les lamelles de couverture et placez-le dans le sonicateur pendant 30 minutes en mode pleine impulsion. Utilisez des pinces émoussées revêtues de PTFE pour retirer les lamelles de couvercle une par une. Rincez-les abondamment à l’eau distillée et placez-les dans un autre pot de coplin rempli de deux hydroxydes de sodium normaux.Sonicer les lames de couverture pendant 20 minutes en mode pleine impulsion. Retirez les lames de couverture, rincez abondamment à l’eau distillée et placez-les dans un autre pot de coplin rempli d’eau distillée. Avant de commencer l’expérience, prenez le pot dans une hotte chimique équipée d’une alimentation en azote gazeux.Utilisez des gants et des pinces pour retirer les lamelles de couverture afin de les sécher sous le jet d’azote. Séchez les deux côtés et placez-les sur une grille en plastique propre avec un couvercle. Placez la boîte avec les lamelles de couverture dans un dessiccateur pour éviter tout contact avec des particules de poussière, puis prenez des tubes PCR autoclavés et découpez leurs couvercles et leurs moitiés coniques inférieures avec une lame chirurgicale tranchante.Prenez les tubes cylindriques demi-coupés, appliquez un adhésif durcissable aux UV sur le bord lisse de chaque tube coupé et placez-le inversé sur un couvercle fraîchement nettoyé de sorte que le bord repose à plat sur le couvercle. Ne déplacez pas le cylindre latéralement une fois qu’il est positionné sur la lamelle de couverture pour vous assurer que la colle ne se répand pas dans l’espace central de la chambre. Placez les lamelles de recouvrement du roulement de la chambre à l’intérieur d’un nettoyeur à ozone UV avec une alimentation en oxygène et un aspirateur.Allumez la lumière UV et allumez-la pendant trois à cinq minutes pour permettre à l’adhésif de polymériser. Retirez les lamelles de couverture et testez les chambres pour détecter les fuites, et jetez les chambres qui fuient. Lavez chaque chambre avec un tampon de formation SLB, en laissant 100 microlitres de tampon à la fin.Marquez le niveau du tampon à 100 microlitres avec un marqueur permanent, puis ajoutez deux microlitres de chlorure de calcium 0,1 molaire dans la chambre, suivis de huit microlitres de la solution SUV dans chaque chambre et incuber pendant 15 minutes à 25 degrés Celsius. Retirez 50 microlitres du tampon de formation SLB, en ne laissant que 50 microlitres dans la chambre d’échantillonnage, puis ajoutez 100 microlitres d’un XKMEH dans la chambre et mélangez doucement. Retirez 100 microlitres du tampon sans toucher le fond.Répétez les lavages huit à 10 fois en ajoutant 100 microlitres d’un XKMEH et en retirant 100 microlitres. Ajouter 10 microlitres d’un milligramme par millilitre de bêta-caséine à la bicouche, mélanger doucement et incuber pendant cinq à 10 minutes à température ambiante. Laver la caséine bêta trois fois avec un XKMEH et ramener le niveau de tampon à la marque des 100 microlitres.Pendant l’incubation de la caséine bêta, retirez une partie aliquote de la protéine de liaison membrane-actine pour moins 80 degrés Celsius décongelée rapidement à 37 degrés Celsius, puis conservez-la sur la glace. Diluer l’aliquote avec un tampon de dilution protéique jusqu’à une concentration d’une micromolaire. Ajouter la protéine de liaison à la solution à une concentration finale définie et mélanger doucement.Incuber pendant 30 à 40 minutes à température ambiante et laver trois à cinq fois avec un tampon XKMEH pour éliminer la protéine HSE non liée. Ramenez le niveau tampon dans chaque chambre à la marque des 100 microlitres. L’échantillon est maintenant prêt pour l’imagerie.Allumez le microscope, les lasers d’excitation et les caméras de détection. Assurez-vous que le laser est aligné, que l’objectif est nettoyé et que le logiciel est prêt à acquérir des images. Mettez de l’huile sur l’objectif 100 fois, montez l’échantillon sur la platine du microscope et concentrez l’objectif sur la bicouche.Assurez-vous que la position du laser est telle qu’il subisse une réflexion interne totale sur l’échantillon. Utilisez une excitation de 488 nanomètres. Pour déterminer l’intégrité de la bicouche, effectuez un test FRAP rapide en sélectionnant une région d’intérêt sur la bicouche et en enregistrant quelques images du champ de vision en utilisant des conditions d’imagerie qui fournissent un rapport signal sur bruit de cinq à un ou plus.Mettez l’enregistrement en pause et fermez le diaphragme de champ du microscope TIRF pour concentrer un faisceau laser concentré sur une petite région circulaire de la bicouche afin de blanchir localement les fluorophores. Allumez le laser à sa sortie maximale pour photoblanchir la petite région pendant trois à 10 secondes, puis éteignez le laser. Rouvrez le diaphragme de champ à son rayon d’origine, réajustez l’état d’imagerie aux paramètres pré-blanchiment et reprenez immédiatement l’enregistrement de la récupération du signal fluorescent dans le champ de vision.Vérifiez si la bicouche est fluide et enregistrez les images sous forme de fichiers TIF à points 16 bits. Mélangez la G-actine non marquée et marquée par fluorescence dans un rapport molaire de 10 à un, et complétez-la avec un tampon G de sorte que la concentration de G-actine soit de 20 micromolaires. Ajouter un dixième de 10 fois le tampon ME au mélange pour une solution unique, et incuber pendant deux minutes à température ambiante.Ensuite, décongelez rapidement le flacon de bouillon de protéines à 37 degrés Celsius, puis conservez-le sur la glace. Diluer avec des tampons G de telle sorte que la concentration de protéine de coiffage soit maintenant deux fois sa concentration finale souhaitée, puis ajouter un volume égal de la solution de protéine de coiffage diluée au mélange d’actine. Enfin, ajoutez un volume égal de tampon frais deux fois cible au mélange réactionnel.Le volume final de la solution doit être quatre fois le volume du mélange d’actine. Assurez-vous que la concentration finale des composants est telle que décrite dans le manuscrit du texte. Incuber les échantillons dans l’obscurité à 25 degrés Celsius pendant 45 à 60 minutes pour permettre la polymérisation.Extraire doucement à la pipette cinq actines polymérisées micromolaires avec une pointe de pipette émoussée et l’ajouter à un tube de PCR autoclavé propre. Ajouter un XKMEH au tube pour faire le volume final plus de 20 microlitres, et mélanger doucement pour éviter de cisailler la F-actine. De la chambre d’échantillonnage montée, retirez un volume égal du tampon.Ajouter la solution d’actine polymérisée dans la chambre et pipeter doucement de haut en bas trois fois sans toucher la bicouche au fond. Montez l’échantillon sur le microscope TIRF et laissez-le reposer pendant 20 à 30 minutes. Enregistrez quelques images de différents champs de vision après que l’ajout de F-actine ait atteint un état stable.Après 30 minutes d’incubation d’actine, remontez l’échantillon sur le microscope. Vérifiez le signal sur la protéine de liaison et les canaux F-actine. Ajustez les conditions d’imagerie si nécessaire.Sélectionnez une bonne région pour un enregistrement en accéléré de longue durée. Enregistrez 10 à 15 images de 0,1 à 0,2 hertz avant l’ajout de myosine et mettez l’enregistrement en pause. Extraire à la pipette le volume requis de myosine musculaire recyclée deux du flacon d’origine à l’aide d’une pointe de pipette émoussée et l’ajouter à un tube PCR autoclavé propre.Ajouter immédiatement un XKMEH dans le tube pour faire le volume plus de 20 microlitres, et mélanger doucement. Retirez délicatement un volume égal du tampon KMEH de la chambre d’échantillonnage montée sans la déranger, et ajoutez doucement la solution de myosine dans la chambre d’échantillonnage. Ne pas pipeter de haut en bas, car cela perturberait les filaments liés à la surface.Reprenez immédiatement l’enregistrement en accéléré et enregistrez toutes les images, puis prenez des images d’arrière-plan pour tous les canaux à l’aide d’un échantillon de mémoire tampon uniquement. Enregistrez toutes les images en tant que fichiers TIF. La valeur ajustée du coefficient de diffusion était de 1,34 micromètre carré par seconde, ce qui correspondait étroitement à la valeur calculée sur la base d’une formule de 1,39 micromètre carré par seconde.Le profil linéaire après photoblanchiment et le profil de récupération de la région blanchie correspondent respectivement aux équations quatre et cinq. La fraction mobile de la bicouche lipidique représentant la fraction de la population blanchie qui se rétablit était supérieure à 0,9, indiquant une bonne bicouche lipidique. L’activité de la myosine a induit des flux d’actomyosine contractile qui ont émergé dans des structures astro-semblables à l’état d’équilibre, entraînant un regroupement local du composant membranaire couplé.On peut utiliser une variété de techniques de microscopie telles que la microscopie à diffusion interférométrique pour étudier la dynamique des réseaux d’actomyosine non marqués sans induire de dommages photo, ou utiliser la microscopie à fluorescence à super résolution. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs intéressés à comprendre comment les complexes protéiques membranaires interagissent avec un réseau dynamique d’actomyosine pour moduler leur architecture et leur composition.

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