Name: Un test de fluorescence calcique à double addition pour le criblage à haut débit de récepteurs couplés à la protéine G recombinante (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-02T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Découvrez un test de fluorescence calcique à double addition pour le criblage à haut débit des récepteurs couplés aux protéines G. Cette méthode permet de détecter simultanément agonistes et antagonistes dans les cellules CHO-K1.

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Ce travail a été soutenu par le prix USDA-NIFA-AFRI Animal Health and Well-Being Award (numéro de prix 2022-67015-36336, PVP [Project Director]) et par des fonds compétitifs du Texas A&M AgriLife Research Insect Vector Diseases Grant Program (FY'22-23) à P.V.P. Le groupe de professeurs A.W.E.S.O.M.E. du College of Agriculture and Life Sciences, TAMU, est reconnu pour son aide dans l’édition du manuscrit. Le tableau supplémentaire S2 contient des données provenant d’une bibliothèque interne aléatoire de petites molécules obtenues du laboratoire du Dr James Sacchettini à la Texas A&M University et de Texas A&M AgriLife Research.

1. Entretien des cellules
REMARQUE : UNE LIGNÉE CELLULAIRE CHO-K1 qui exprime de façon stable le récepteur des kinines de R. microplus, nommée BMLK3, a été développée par Holmes et al.16. Les détails du développement de la lignée cellulaire sont présentés ailleurs14. Toutes les étapes suivantes sont effectuées dans des conditions stériles dans une enceinte de biosécurité de classe II.
<ol><li>Cultiver la lignée cellulaire recombinante dans un milieu sélectif (milieu F-12K contenant 10 % de sérum fœtal bovin [FBS] et 800 μg/mL de sulfate G418) pour assurer l’expression du récepteur cible. Entreposer les cellules exprimant de façon stable le récepteur dans 1 mL de milieu de congélation (FBS à 90 % et 10 % de diméthylsulfoxyde [DMSO]) dans un cryovial de 2 mL dans un congélateur à -80 °C. REMARQUE: Pour le stockage à long terme des cellules congelées, stockez-les dans de l’azote liquide.</li>
	<li>Préchauffer tous les milieux avant la culture cellulaire. Dans une enceinte de biosécurité, transférer 13 mL de milieu sélectif préchauffé (milieu F-12K contenant 10 % de FBS et 800 μg/mL de sulfate G418) dans une fiole T-75 et la conserver dans l’enceinte de biosécurité. Décongeler un flacon de3 cellules BMLK congelées (~1,5 × 106 cellules) dans un bain-marie à 37 °C pendant 2-3 min. Transvaser les cellules décongelées dans le ballon T-75. Maintenir les cellules dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2 , sauf indication contraire.</li>
	<li>Lorsque les cellules atteignent 90% de confluence (1-2 jours), préchauffer tout le milieu à 37 ° C, à l’exception de la solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco, qui est maintenue à température ambiante. Dans une enceinte de biosécurité, retirer le milieu usé de la fiole T-75, laver les cellules pendant 5 s avec 10 mL de DPBS en remuant doucement la fiole, puis retirer la DPBS à l’aide d’une pipette sérologique. REMARQUE: Une image de cellules CHO-K1 à 90% de confluence est montrée dans Lu et al.14.</li>
	<li>Détacher les cellules du ballon T-75 en ajoutant 2 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % et incuber pendant 3 à 5 minutes à 37 °C dans l’incubateur. Ensuite, ajouter 8 mL de milieu sélectif et bien mélanger en pipetant et en relâchant doucement 2x-3x avec la même pipette sérologique.</li>
	<li>Transvaser 2 mL de la suspension cellulaire (~1 × 106 cellules) de l’étape 1.4 dans une nouvelle fiole T-75 contenant 10 mL de milieu sélectif chaud. Cultivez les cellules pendant 1-2 jours dans l’incubateur jusqu’à ce qu’elles atteignent 90% de confluence.</li>
	<li>Utilisez les cellules pour le test en suivant les étapes suivantes, ou répétez les étapes 1.4-1.5 une ou deux fois avant d’utiliser les cellules dans le test. REMARQUE: Ne pas dépasser trois à quatre passages, car le signal de dosage avec certaines lignées cellulaires peut s’affaiblir avec d’autres passages.</li>
</ol>2. Dosage de fluorescence calcique
<ol><li>Enduire la plaque cellulaire.<ol><li>Utiliser un système de manipulation des liquides placé à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité pour toutes les étapes de pipetage dans les plaques de 384 puits. Créez des programmes personnalisés pour le pipetage dans les plaques 384 puits31 (tableau supplémentaire S1). Enduisez à l’avance les plaques stériles à 384 puits. Dans une enceinte de biosécurité, charger 10 μL/puits d’une solution aqueuse de Poly-D-lysine (PDL) à 0,05 mg/mL dans chaque plaque et incuber pendant 5 min à température ambiante.</li>
		<li>Videz l’assiette en la retournant rapidement et en l’épongeant doucement sur des serviettes en papier stériles. Ensuite, rincez chaque puits avec 10 μL d’eau, videz l’assiette et laissez l’assiette sécher dans l’enceinte de biosécurité pendant la nuit sans couvercle. Fermez la plaque avec le couvercle et conservez à 4 °C au réfrigérateur. NOTE: Les plaques revêtues peuvent être conservées à 4 ° C jusqu’à 6 mois.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 1<ol><li>Sortez la plaque de médicament (100 μM dans 90% de DPBS + 10% de DMSO, la concentration finale dans le puits pour HTS sera de 2 μM) stockée dans le congélateur à -20 °C et placez-la à température ambiante. NOTE: Disposition de la plaque médicamenteuse: Chaque plaque de 384 puits (24 colonnes x 16 rangées) contient 320 puits avec différents composés de bibliothèque et 64 puits avec solvant blanc (DPBS contenant 10% de DMSO), qui sont disposés en quatre colonnes, avec deux colonnes sur le bord de chaque côté. Voir le tableau supplémentaire S2 pour la disposition des plaques.</li>
		<li>Lorsque les cellules atteignent une confluence de ~70 % à 90 % dans le ballon T-75, détacher les cellules du ballon T-75 comme décrit ci-dessous. Préchauffer tout le média à 37 °C à l’exception de la DPBS (température ambiante).<ol><li>Retirez le milieu usé, lavez les cellules avec 10 ml de DPBS, puis retirez le DPBS. Détacher les cellules du ballon T-75 à l’aide de 2 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % pendant 3 à 5 min à 37 °C dans l’incubateur, ajouter 8 mL de milieu sélectif et transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL pour centrifuger à 1 000 × g pendant 3 min.</li>
			<li>Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 10 mL de milieu F-12K contenant 1 % de FBS et 400 μg/mL de sulfate G418. Gardez la suspension dans l’enceinte de biosécurité tout en déterminant le nombre de cellules.</li>
		</ol></li>
		<li>Déterminer la densité cellulaire de la suspension en vue d’une dilution ultérieure : Mélanger 20 μL de suspension cellulaire dans 20 μL de bleu de trypan à 0,4 %, puis charger 20 μL du mélange dans une chambre de comptage de cellules pour être lu par un compteur de cellules pour la densité cellulaire.</li>
		<li>Diluer la suspension cellulaire dans le même milieu (milieu F-12K contenant 1 % de FBS et 400 μg/mL de sulfate de G418) jusqu’à obtenir un volume final d’au moins 15 mL à une densité de 4 × 105 cellules/mL.</li>
		<li>Ensemencez les cellules dans la plaque de 384 puits recouverte de PDL. Transférer 15 mL de la suspension cellulaire ci-dessus (4 × 105 cellules/mL) dans un réservoir de réactif auto-respectueux de 150 mL. Distribuer 25 μL de la suspension cellulaire (~10 000 cellules/puits) dans chaque puits des 384 puits de la plaque à l’aide d’un système de manipulation des liquides en deux étapes. Charger 384/12,5 μL de pointes à faible rétention sur la tête du manipulateur de liquides, aspirer 12,5 μL du réservoir (vitesse 5,2 μL/s) et distribuer dans chaque puits (vitesse : 3,1 μL/s).</li>
		<li>Répéter le pipetage comme à l’étape précédente 2.2.5 pour atteindre 25 μL par puits. Ensuite, incuber la plaque pendant une nuit (14-16 h) à 37 °C et 5% de CO2 dans l’incubateur humidifié. REMARQUE: Comme le volume maximal de pipetage est de 12,5 μL pour cette tête spécifique, le pipetage pour 25 μL est effectué en deux étapes.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 2<ol><li>Le lendemain matin, vérifiez la plaque cellulaire couverte au microscope; Si elles ne sont pas confluentes, attendez que les cellules atteignent 90% de confluence.</li>
		<li>Préparez une solution mère de colorant fluorescent : Remettez en suspension le colorant fluorescent lyophilisé dans 100 μL de DMSO et évitez la lumière directe sur la solution mère. Enveloppez le tube avec du papier d’aluminium pour éviter le photoblanchiment. NOTA : Le stock peut être aliquote en aliquotes de 15 μL pour chaque essai sur plaque afin d’éviter la congélation et la décongélation répétées; les aliquotes peuvent être conservées à −80 °C jusqu’à 1 mois.</li>
		<li>Dans l’enceinte de biosécurité avec les lumières éteintes, préparer le colorant de chargement (1x) dans un tube conique de 15 mL enveloppé de papier d’aluminium, en combinant 15 μL de la solution mère de colorant fluorescent (à partir de l’étape 2.3.2) et le reste des composants préchauffés de la trousse (37 °C) : 13,5 mL de 1x HHBS (tampon de Hank avec 20 mM HEPES) et 1,5 mL de réactif B (inhibiteur d’efflux de colorant). REMARQUE: La lumière de la pièce est allumée pendant cette étape.</li>
		<li>Fermez le tube et mélangez bien en le retournant doucement plusieurs fois (généralement 3 à 5 fois). NOTE: Conserver à température ambiante et utiliser le mélange de colorant de chargement dans les 30 minutes.</li>
		<li>Lorsque les cellules atteignent 90 % de confluence, retirer le milieu usé de la plaque d’essai à 384 puits en retournant rapidement la plaque et en épongeant doucement sur du papier absorbant stérile; Répétez ce mouvement 2x-3x pour retirer tout le liquide de la plaque. Jetez les serviettes mouillées.</li>
		<li>Éteignez la plupart des lumières directes artificielles dans la pièce (en laissant une lampe de bureau douce et faible allumée ou similaire pour permettre des conditions de travail visibles) et dans l’armoire de biosécurité pour toutes les étapes jusqu’à la fin du test (environ pendant 1,5 h).</li>
		<li>Placer 15 mL du colorant de chargement (1x) de l’étape 2.3.3 dans un réservoir auto-friendly de 150 mL.<ol><li>Transférer 25 μL du colorant de chargement (1x) du réservoir dans chaque puits à l’aide d’un système de manutention de liquide avec 384/12,5 μL de pointes de faible rétention en distribuant 12,5 μL dans chaque puits de la plaque (vitesse d’aspiration et de distribution : 3,8 μL/s).</li>
		</ol></li>
		<li>Répéter l’étape de pipetage comme au point 2.3.7.1 pour atteindre un volume final de 25 μL dans chaque puits de la plaque. Couvrez et enveloppez la plaque avec du papier d’aluminium pour la protéger de la lumière ambiante.</li>
		<li>Incuber la plaque cellulaire couverte à 37 °C dans l’incubateur humidifié au CO2 pendant 30 min, la retirer de l’incubateur et l’équilibrer à température ambiante à l’intérieur du lecteur de plaques ou sur le banc, en gardant la plaque couverte et enveloppée de papier d’aluminium pendant encore 30 min. Les cellules sont alors prêtes pour le criblage à haut débit (HTS).</li>
		<li>Préparation chimique: Faire tourner la plaque de médicament de l’étape 2.2.1 à 1 200 × g dans une centrifugeuse à plaques pendant 1 min à température ambiante.<ol><li>Préparer une solution peptidique agoniste 10x de Rhimi-K-1 (QFSPWGamide) (10 μM) en remettant en suspension 100 nmoles de peptide lyophilisé dans 10 mL de 1x HHBS contenant 0,1% de DMSO, et transférer la solution dans un réservoir auto-friendly de 150 mL.</li>
		</ol></li>
		<li>Mesurer le signal de fond : Pour l’ensemble du test HTS dans le lecteur de plaques, sous Protocoles, choisissez le mode de fluorescence du point final. NOTE: Le signal fluorescent est lu à partir du bas de la plaque à des longueurs d’onde d’excitation/émission de 495 nm/525 nm.<ol><li>Insérez la plaque cellulaire dans le lecteur de plaque. Dans le tableau de bord, sélectionnez ajuster le gain, sélectionnez un puits aléatoire sur la plaque, attribuez-le à 5 % à 10 % de la valeur de fluorescence maximale mesurable et sélectionnez ajuster la hauteur (lecture).</li>
			<li>Cliquez sur Démarrer la mesure pour lire la plaque entière pour le signal de fluorescence de fond en unités de fluorescence relative (RFU).</li>
		</ol></li>
		<li>Essai de « double addition »<ol><li>À l’aide du système de manipulation des liquides avec des pointes de 384/12,5 μL, pour mélanger la solution médicamenteuse dans chaque puits de la plaque médicamenteuse, pipeter 3x de haut en bas de 10 μL de la solution médicamenteuse (dans DPBS contenant 10% de DMSO) (vitesse de pipetage: 5,2 μL / s) et « aspirer » 1,5 μL de chaque puits de la plaque médicamenteuse (vitesse d’aspiration: 1,0 μL / s).</li>
			<li>« Distribuer » 0,5 μL des composés dans la plaque d’essai cellulaire (vitesse de pipetage : 1 μL/s) pour atteindre une concentration finale de 2 μM dans du DMSO à 0,2 %.</li>
			<li>Placez immédiatement la plaque de dosage dans le lecteur de plaque après avoir ajouté les composés de criblage. Lisez la même plaque dans les directions de lecture avant et arrière. Pour obtenir ces lectures, définissez un programme à lire à partir de « puits 1-384 » et immédiatement à partir de « 384-1 ». REMARQUE: La lecture dans les deux sens prend 2 min au total. Cette conception de lecture vise à compenser la diminution de l’intensité du signal qui se produit pendant la lecture de la plaque dans chaque direction. Voir l’étape 3.1 pour les analyses de lecture.</li>
			<li>Éliminer le reste de 1 μL de solution médicamenteuse dans les embouts en immergeant les embouts dans un réservoir de déchets de 150 mL contenant ~50 mL de DPBS (vitesse de distribution : 1,0 μL/s).</li>
			<li>Incuber les composés de criblage avec les cellules pendant un total de 5 minutes (y compris les 2 minutes de lecture sur plaque) à température ambiante dans l’enceinte de biosécurité avec les lumières éteintes. Ajouter 3 μL du peptide agoniste, Rhimi-K-1 (QFSPWGamide), du réservoir (vitesse d’aspiration : 3,1 μL/s) dans la plaque d’essai à l’aide du système de manipulation du liquide (vitesse de distribution : 3,1 μL/s) avec des pointes de 384/12,5 μL.</li>
			<li>Placez la plaque dans le lecteur de plaque immédiatement après l’ajout du peptide agoniste. Lire la plaque dans les directions avant et arrière en utilisant le même programme qu’à l’étape 2.3.12.3</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>3. Analyse des données
<ol><li>À l’aide du logiciel d’analyse associé au lecteur de plaques installé sur un ordinateur, calculer les réponses de fluorescence cellulaire (en RFU) pour les deux lectures après la première addition de composé (Première lecture; RFUago [Tableau supplémentaire S2]) et après les étapes d’addition agoniste (Deuxième lecture = RFU ant [Tableau supplémentaire S2]). Chaque lecture est obtenue en faisant la moyenne des deux valeurs obtenues (non représentées) par les lectures sur plaque avant et arrière de l’étape 2.3.12.3 et de l’étape 2.3.12.6, respectivement. NOTE: Il y a RFU, les fourmis RFU désignent les unités de fluorescence relatives des hits agonistes potentiels (lire à l’étape 2.3.12.3) et des hits antagonistes potentiels (lire à l’étape 2.3.12.6), respectivement.</li>
	<li>Exportez les trois ensembles de données, RFU bg, RFUago et RFUant, du logiciel d’analyse vers trois feuilles de calcul distinctes. Chaque feuille de calcul n’aura que deux colonnes: position du puits et RFU brute (fichiers non affichés ici). NOTE: RFU bg fait référence à la RFU de l’arrière-plan lu à l’étape 2.3.11.2.</li>
	<li>Mettez en forme les données des trois feuilles de calcul et organisez les données ci-dessus dans un fichier csv (voir l’exemple du tableau supplémentaire S2). Soustrayez le signal de fond lu de la RFU ago et de la RFU ant, respectivement (colonnes G et H dans le tableau supplémentaire S2).</li>
	<li>Importez le fichier csv dans une « plateforme de données HTS en ligne » disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) pour l’analyse des données en aval (tableau 1) et le stockage.</li>
	<li>Calculer manuellement le facteur Z' pour le contrôle de la qualité de chaque essai sur plaque à l’aide de l’équation (1) : Équation (1): <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64505/64505eq01.jpg" style="margin: auto;">(1) NOTE: μ c- et μc+ représentent les UFR moyennes des lectures des mêmes puits, qui servent de témoins négatifs dans la première addition après l’ajout du solvant (solvant blanc, n = 64; nombres en bleu dans le tableau supplémentaire S2) et servent de témoins positifs après l’ajout de l’agoniste (solvant blanc + agoniste, n = 64; nombres en magenta), respectivement. De plus, σ c- et σc+ représentent leurs écarts-types (ET) correspondants.</li>
	<li>Sélectionnez manuellement les molécules d’impact à partir des cartes thermiques sur la « plate-forme de données HTS en ligne » et calculez le pourcentage normalisé d’activation (NPA) et d’activité inhibitrice (Io) pour les hits agonistes et les hits antagonistes à l’aide de l’équation (2) et de l’équation (3): <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/64505/64505eq02.jpg" style="margin: auto;">(2) <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/64505/64505eq03.jpg" style="margin: auto;">(3)</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

L’objectif de HTS est d’identifier les molécules frappées en criblant un nombre massif de petites molécules. Par conséquent, les résultats de cet exemple ne représentent qu’une petite partie d’une expérience HTS conventionnelle. De plus, les molécules hit, identifiées, doivent être validées dans des essais en aval tels qu’un dosage dose-dépendant sur la même lignée cellulaire recombinante et sur une lignée cellulaire CHO-K1 ne portant que le vecteur vide, qui peut être réalisé simultanément pour sauver de petites molécul...

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), qui sont présents de la levure à l’homme, représentent la plus grande superfamille de récepteurs dans de nombreux organismes1. Ils jouent un rôle essentiel dans la régulation de presque tous les processus biologiques chez les animaux. Il y a 50 à 200 RCPG dans le génome des arthropodes, ce qui signifie qu’ils représentent la plus grande superfamille de récepteurs membranaires2. Ils sont classés en six classes principales, A-F, en fonction de leur similitude de séquence et de leurs fonctions3. Les RCPG transduisent divers signaux extracellulaires, tels que ceux des hormones, des neuropeptides, des amines biogènes, du glutamate, du proton, des lipoglycoprotéines et des photons4. Les RCPG se couplent aux protéines G hétérotrimères (Gα, Gβ et Gγ) pour transmettre des signaux en aval. Les RCPG couplés aux protéines Gαs ou Gαi/o augmentent ou diminuent, respectivement, les niveaux intracellulaires d’adénosine monophosphate (AMPc) 3', 5'-cyclique en activant ou en inhibant l’adénylylcyclase. Les RCPGs couplés à Gαq/11 induisent la libération de calcium à partir des réserves de calcium du réticulum endoplasmique en activant la voie phospholipase C (PLC)-inositol-1,4,5-triphosphate (IP3). Les RCPGs couplés à Gα12/13 activent les facteurs d’échange nucléotidiquesde la RhoGTPase 5,6. Les RCPG sont la cible de plus de 50% des médicaments humains et d’un acaricide, l’amitraze4. Comme les RCPG transduisent des signaux aussi divers, ils sont des cibles prometteuses pour le développement de nouveaux pesticides qui perturbent les fonctions physiologiques spécifiques aux invertébrés.
L’objectif de HTS est d’identifier les molécules de frappe qui peuvent moduler les fonctions des récepteurs. HTS implique le développement de tests, la miniaturisation et l’automatisation7. Les RCPG des neuropeptides arthropodes sont impliqués dans la plupart des fonctions physiologiques, telles que le développement, la mue et l’ecdysis, l’excrétion, la mobilisation énergétique et la reproduction4. La plupart des RCPG neuropeptidiques des arthropodes et des métazoaires signalent par la cascade de signalisation calcique 2,6,8,9,10, comme dans le peptide myoinhibiteur et les récepteurs SIFamide de la tique à pattes noires Ixodes scapularis; leurs ligands sont antagonistes dans les essais de motilité de l’intestin postérieur, le SIF provoquant une contraction et la MIP l’inhibant11,12. Un récepteur de type NPY du moustique de la fièvre jaune, Aedes aegypti, régule l’hôte femelle à la recherche13. Comparé à d’autres tests alternatifs de mobilisation du calcium tels que le test de bioluminescence calcique de l’équorine14, le test de fluorescence du calcium est facile à réaliser, ne nécessite pas la transfection d’autres protéines de détection du calcium recombinant et est rentable. Le test de fluorescence calcique produit un signal prolongé par rapport au signal cinétique rapide obtenu dans le test de bioluminescence calcique de l’équorine14,15.
Dans l’exemple ici, le récepteur kinine de la tique de la fièvre bovine, Rhipicephalus microplus, a été exprimé de manière recombinante dans la lignée cellulaire CHO-K1 et utilisé pour le test de fluorescence calcique. Il n’y a qu’un seul gène récepteur de la kinine trouvé dans R. microplus; le récepteur signale par une voie de signalisation dépendante de la protéine Gq et déclenche l’efflux de Ca2+ des réserves de calcium dans l’espace intracellulaire16. Ce processus peut être détecté et quantifié par un fluorophore, qui provoque un signal de fluorescence lors de la liaison des ions calcium (Figure 1).
Le récepteur kinine est un RCPG spécifique aux invertébrés, qui appartient aux récepteurs de type rhodopsine de classe A. La kinine est un ancien neuropeptide de signalisation présent dans Mollusca, Crustacea, Insecta et Acari 4,17,18. Les coléoptères (coléoptères) n’ont pas le système de signalisation des kinines; chez le moustique Aedes aegypti, il n’y a qu’un seul récepteur de kinine qui se lie à trois aedeskinines, tandis que Drosophila melanogaster a un récepteur de kinine avec la drosokinine comme ligandunique 19,20,21. Il n’y a pas de kinines homologues ou de récepteurs de kinines chez les vertébrés. Bien que la fonction exacte de la kinine soit inconnue chez les tiques, les femelles de R. microplus silencieuses de R. microplus soumises au récepteur de la kinine sont réduites de manière significative22. Les kinines sont des peptides pléotropes chez les insectes. Chez Drosophila melanogaster, ils sont impliqués dans les systèmes de régulation nerveux central et périphérique23, la pré-ecdysis 24, l’alimentation25, le métabolisme 26 et les schémas d’activité du sommeil26,27, ainsi que la locomotionlarvaire 28. Les kinines régulent la contraction de l’intestin postérieur, la diurèse et l’alimentation du moustique A. aegypti 29,30,31. Les peptides kinines ont conservé un pentapeptide C-terminal Phe-X1-X2-Trp-Gly-NH2, qui est la séquence minimale requise pour l’activité biologique32. La spécificité des arthropodes, la petite taille du ligand endogène, qui les rend sujets à l’interférence des petites molécules, et les fonctions pléiotropiques chez les insectes font du récepteur kinine une cible prometteuse pour la lutte antiparasitaire4.
Le test de « double addition » (Figure 2) permet l’identification d’agonistes ou d’antagonistes dans le même test HTS15. Il est adapté d’un test de « double addition » couramment utilisé dans l’industrie pharmaceutique pour la découverte de médicaments33. En bref, le premier ajout de médicaments dans la plaque cellulaire permet d’identifier les agonistes potentiels dans la bibliothèque chimique lorsqu’un signal de fluorescence plus élevé est détecté par rapport à l’application du contrôle du solvant. Après 5 min d’incubation avec ces petites molécules, un agoniste connu (peptide kinine) est appliqué sur tous les puits. Les puits qui ont reçu au hasard un antagoniste de la plaque médicamenteuse affichent un signal de fluorescence plus faible lors de l’ajout d’agonistes par rapport aux puits témoins qui ont reçu le solvant lors de la première addition. Ce test permet ensuite d’identifier des agonistes et antagonistes potentiels avec les mêmes cellules. Dans un projet HTS standard, ces molécules frappées seraient validées par des tests dose-réponse et par des tests d’activité biologique supplémentaires, qui ne sont pas présentés ici.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64505/64505fig01.jpg"> Figure 1 : Illustration du mécanisme d’essai de fluorescence calcique. La protéine Gq déclenche la voie de signalisation intracellulaire du calcium. Le récepteur de la kinine (récepteur couplé à la protéine G) a été exprimé de manière recombinante dans les cellules CHO-K1. Lorsque le ligand agoniste se lie au récepteur, la protéine Gq associée au récepteur kinin active l’API, ce qui catalyse la conversion d’une molécule PIP2 en IP3 et DAG. IP 3 se lie ensuite à l’IP3R à la surface du réticulum endoplasmique, conduisant à la libération de Ca 2+ dans le cytoplasme, où les ions Ca2+ se lient aux fluorophores et provoquent un signal de fluorescence. Le signal de fluorescence peut être obtenu par excitation à 490 nm et détecté à 514 nm. Abréviations : RCPG = récepteur couplé aux protéines G; PLC = phospholipase C; PIP2 = phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate; IP3 = inositol trisphosphate; DAG = diacylglycérol; IP3 R = récepteur IP3. Créé avec BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64505/64505fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64505/64505fig02.jpg"> Figure 2 : Flux de travail pour le criblage à haut débit de petites molécules sur un récepteur couplé à une protéine G exprimé dans des cellules CHO-K1. (A) Des cellules CHO-K1 recombinantes exprimant de manière stable le récepteur kinine ont été ajoutées à la plaque de 384 puits (10 000 cellules/puits) à l’aide d’un système de manipulation de liquide (25 μL/puits) et incubées dans un incubateur de CO2 humidifié pendant 12 à 16 h. (B ) Le tampon d’essai contenant le colorant fluorescent (25 μL/puits) a été ajouté dans la plaque cellulaire à l’aide d’un système de manipulation de liquide. La plaque a été incubée pendant 30 min à 37 °C pendant 30 min et équilibrée à TA pendant 30 minutes supplémentaires. (C) Le signal de fluorescence de fond des cellules de chaque puits a été mesuré à l’aide d’un lecteur de plaques. (D) Des solutions médicamenteuses provenant d’une plaque bibliothèque de 384 puits et d’un solvant à blanc (tous à 0,5 μL/puits) ont été ajoutées dans la plaque d’essai cellulaire à l’aide d’un système de manipulation de liquide. (E) Les réponses cellulaires de fluorescence calcique ont été mesurées avec le lecteur de plaque immédiatement après l’ajout des solutions médicamenteuses; Les composés suscitant des signaux de fluorescence supérieurs à la moyenne ont été choisis comme des coups agonistes. Des hits antagonistes qui bloquent le RCPG (icône ci-dessous) ont été révélés après l’ajout de l’agoniste peptidique à l’étape G. (F) Dans la même plaque d’essai, après 5 minutes d’incubation des cellules avec des composés de criblage, un peptide agoniste endogène Rhimi-K-1 (QFSPWGamide) du récepteur des tiques kinines a été ajouté à chaque puits (1 μM). (G) Les réponses de fluorescence cellulaire après l’ajout du peptide agoniste ont été mesurées immédiatement par le lecteur de plaques. Le(s) composé(s) inhibant(s) le signal de fluorescence a été sélectionné comme antagoniste(s). Abréviations : RCPG = récepteur couplé aux protéines G; RT = température ambiante; RFU = unités de fluorescence relative. Créé avec BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64505/64505fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>0,25 % trypsine-EDTA</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>15050-065</td><td>avec rouge de phénol</td></tr><tr><td>0,4 % de bleu trypan</td><td>MilliporeSigma</td><td>T8154</td><td>liquide,</td></tr><tr><td>stérile 1,5 mL microcentrifuge Thermo</td><td>Fisher</td><td>AM12400</td><td>sans RNase</td></tr><tr><td>Pipette sérologique de 5 mL</td><td>Corning</td><td>29443-045</td><td>Corning Costar Stripette emballée individuellement.</td></tr><tr><td>Pipette sérologique de 10 mL</td><td>Corning</td><td>29443-047</td><td>Corning Costar Stripette emballée individuellement.</td></tr><tr><td>Tubes coniques de 15 mL</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td>stériles</td></tr><tr><td>20 & micro ; L filtres embouts</td><td>USA Scientifc Inc.</td>Pipette sérologique <td>stérile P1121</td><td>barrière</td></tr><tr><td>de 25 mL</td><td>Corning</td><td>29443-049</td><td>Corning Costar Stripette emballée individuellement.</td></tr><tr><td>Tubes coniques de 50 mL</td><td>Corning</td><td>430828</td><td>gradué, stérile</td></tr><tr><td>Réserve auto-friendly de 150 mL</td><td>Integra Bioscience</td><td>6317</td><td>stérile, emballé individuellement pour l’ensemencement cellulaire au jour 1</td></tr><tr><td>Réserve auto-friendly de 150 mL</td><td>Integra Bioscience</td><td>6318</td><td>stérile, empilée, pour le chargement du colorant au jour 2</td></tr><tr><td>384/ 12.5 &micro ; L embouts à faible rétention</td><td>Integra Bioscience</td><td>6405</td><td>long, filtre stérile</td></tr><tr><td>384/ 12.5 &micro ; L tips</td><td>Integra Bioscience</td><td>6404</td><td>filtre long et stérile</td></tr> à <tr><td>plaque 384 puits</td><td>Greiner</td><td>781091</td><td>CELLSTAR, polystyrène transparent, & micro ; Transparent, noir/plat</td></tr><tr><td>Plaques d’étanchéité en aluminium</td><td>Axygen Scientific</td><td>PCR-AS-200</td> à <td>base de polyester</td></tr><tr><td>Feuille d’aluminium</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biosafty armoire II</td><td>NuAire</td><td>NU-540-300</td><td></td></tr><tr><td>Compteur de cellules</td><td>Nexcelom</td><td>AutoT4</td><td></td></tr><tr><td>lames de comptage de cellules</td><td>Nexcelom</td><td>SD-100</td><td>20 &micro ; Chambre L</td></tr><tr><td>CO2 incubateur humidifié</td><td>Thermo Fisher</td><td>Forma Series II</td><td></td></tr><tr><td>Lampe de bureau</td><td>SunvaleeyTEK</td><td>RS1000B</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxyde</td><td>MilliporeSigma</td><td>276855</td><td>anhydous, >99.9 %</td></tr><tr><td>Plaque de médicament</td><td>Corning</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco</td><td>Corning</td><td>21-031- CV</td><td>DPBS, 1x sans calcium et magnésium</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Koptec</td><td>2000</td><td></td></tr><tr><td>F-12K Mélange de nutriments&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>45000-354</td> <td>(Kaighn’s Mod.) avec L-glutamine</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Equitech-Bio</td><td>SFBU30</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dosage du calcium fluorescent</td><td>ENZO Lifescience</td><td>ENZ-51017</td><td>10x96 tests</td></tr><tr><td>G418</td><td>sulfate Gibco Invitrogen</td><td>10131-027</td><td>Geneticin antibiotique sélectif 50 mg/mL</td></tr><tr><td>Tampon de Hank</td><td>MilliporeSigma</td><td>55037C</td><td>HBSS modifié, avec calcium, avec magnésium, sans phénol lire</td></tr><tr><td>tampon HEPES</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>15630-080</td><td>1 molaire</td></tr><tr><td>HTS plateforme de stockage de données</td><td>CDD vault&nbsp ;</td><td></td><td>https://www.collaborativedrug.com/</td></tr> <tr><td>Système de manipulation de liquides</td><td>Integra Bioscience</td><td>Viaflo</td><td>384/12.5 &micro ; </td></tr><tr><td>L Centrifugeuse à plaques</td><td>Thermo Fisher</td><td>Sorvall ST8</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de plaques</td><td>Technologie BMG Clariostar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>MilliporeSigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Rhimi-K-1 agonist peptide</td><td>Genscript</td><td>commande personnalisée</td><td>QFSPWGamide</td></tr><tr><td>T-75 flacon</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr></tbody></table>

un test de fluorescence calcique « à double addition » pour le criblage à haut débit de récepteurs couplés à la protéine g recombinante

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) représentent la plus grande superfamille de récepteurs et sont la cible de nombreux médicaments humains. Le criblage à haut débit (HTS) de bibliothèques aléatoires de petites molécules par rapport aux RCPG est utilisé par l’industrie pharmaceutique pour la découverte de médicaments spécifiques à la cible. Dans cette étude, un HTS a été utilisé pour identifier de nouveaux ligands à petites molécules de RCPG neuropeptidiques spécifiques aux invertébrés comme sondes pour des études physiologiques de vecteurs d’agents pathogènes humains et vétérinaires mortels.
Le récepteur kinin spécifique aux invertébrés a été choisi comme cible parce qu’il régule de nombreux processus physiologiques importants chez les invertébrés, y compris la diurèse, l’alimentation et la digestion. De plus, la pharmacologie de nombreux RCPG invertébrés est mal caractérisée ou pas caractérisée du tout; par conséquent, la pharmacologie différentielle de ces groupes de récepteurs par rapport aux RCPG apparentés chez d’autres métazoaires, en particulier chez les humains, ajoute des connaissances aux relations structure-activité des RCPG en tant que superfamille. Un test HTS a été développé pour des cellules dans des plaques de 384 puits pour la découverte de ligands du récepteur kinine de la tique de la fièvre bovine, ou tique du bétail du sud, Rhipicephalus microplus. Le récepteur de la kinine à tiques était exprimé de manière stable dans les cellules CHO-K1.
Le récepteur des kinines, lorsqu’il est activé par des neuropeptides de kinine endogènes ou d’autres agonistes de petites molécules, déclenche la libération de Ca2+ des réserves de calcium dans le cytoplasme. Ce test de fluorescence calcique combiné à une approche de « double addition » peut détecter des molécules « hit » agonistes et antagonistes fonctionnelles dans la même plaque de dosage. Chaque essai a été réalisé à l’aide de plaques médicamenteuses portant un réseau de 320 petites molécules aléatoires. Un facteur Z' fiable de 0,7 a été obtenu, et trois molécules d’agonistes et deux molécules d’antagoniste ont été identifiées lorsque le HTS était à une concentration finale de 2 μM. Le test de fluorescence calcique rapporté ici peut être adapté pour dépister d’autres RCPG qui activent la cascade de signalisation Ca2+ .

Une plaque médicamenteuse interne (SAC2-34-6170) composée de 320 petites molécules aléatoires a été utilisée pour démontrer ce test HTS à titre d’exemple. Le HTS avait une excellente qualité de dosage avec un facteur Z' de 0,7 (tableau 1). Ce facteur Z' reflète la qualité du dosage indépendamment des composés testés34. Un facteur Z de 0,5 ou plus indique une bonne plage dynamique du signal de test entre les UFR des témoins positifs et des témoins négatifs. Le...

Dans ce travail, un test de fluorescence calcique intracellulaire à haut débit pour des plaques à 384 puits afin de cribler de petites banques de molécules sur des récepteurs couplés aux protéines G recombinantes (RCPG) est décrit. La cible, le récepteur kinine de la tique de la fièvre bovine, Rhipicephalus microplus, est exprimée dans les cellules CHO-K1. Ce test identifie les agonistes et les antagonistes utilisant les mêmes cellules dans un test de « double addition ».

Un test de fluorescence calcique « à double addition » pour le criblage à haut débit de récepteurs couplés à la protéine G recombinante

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

Le test de double addition de fluorescence calcique à haut débit permet d’identifier de nouveaux ligands à petites molécules d’un récepteur couplé à la protéine G qui signale à travers la cascade de calcium intracellulaire. Le principal avantage du test à double addition est la détection de l’agoniste et de l’antagoniste HTS dans un seul test avec les mêmes cellules à condition que le signal de fluorescence dure deux minutes. Cette méthode peut être appliquée à n’importe quel RCPG qui signale à travers la cascade de calcium, qui comprend la plupart de la famille des peptides neuronaux arthropodes, un RCPG.Pour la reproductibilité du test, il est important d’optimiser la densité cellulaire, la vitesse d’injection et la concentration de l’agoniste connu pour la deuxième édition. La démonstration de la procédure sera assurée par Bianca Henriques-Santos, associée de recherche postdoctorale dans mon laboratoire. Commencer l’essai de fluorescence calcique en retirant le milieu usé du ballon T-75 contenant de 70 à 90 % de BMLK confluents à trois cellules.Lavez les cellules avec 10 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco ou DPBS. Après avoir retiré le DPBS, détacher les cellules à l’aide de deux millilitres d’acide éthylènediaminetétraacétique à 0,25% de trypsine ou EDTA et incuber pendant trois à cinq minutes à 37 degrés Celsius. Ajouter huit millilitres de milieu sélectif et transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres.Avant de centrifuger la suspension cellulaire à 1000 x g pendant trois minutes. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 10 millilitres de milieu F-12K contenant 1% de sérum bovin fœtal ou FBS et 400 microgrammes par millilitre de sulfate G418. Pour déterminer la densité cellulaire de la suspension pour une dilution ultérieure, mélangez 20 microlitres de suspension cellulaire dans 20 microlitres de bleu de trypan à 0,4%, puis chargez 20 microlitres de mélange dans une chambre de comptage de cellules à lire par un compteur de cellules pour la densité cellulaire.Diluer la suspension cellulaire en utilisant le même milieu F-12K et compléter le volume final à 15 millilitres à une densité de quatre fois 10 à la cinquième cellule par millilitre. Pour ensemencer les cellules dans la plaque de puits 384 codée Poly-D lysine ou PDL. Ajouter 25 microlitres de la suspension cellulaire diluée dans 384 puits de la plaque à l’aide d’un système de manipulation des liquides.Incuber la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone dans l’incubateur humidifié. Le lendemain, inverser rapidement la plaque de puits 384 confluents à 90%. Retirer le milieu usé et éponger doucement sur des serviettes en papier stériles deux à trois fois pour retirer tout le liquide de la plaque.Effectuez les étapes suivantes dans la faible lumière à l’intérieur de l’armoire de biosécurité. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de colorant de chargement dans chaque puits à l’aide d’un système de manipulation de liquide en distribuant 12,5 microlitres dans chaque puits avec une vitesse d’aspiration et de distribution de 3,8 microlitres par seconde. Répétez cette étape de pipetage pour atteindre un volume final de 25 microlitres dans chaque puits.Une fois cela fait, couvrez la plaque avec du papier d’aluminium pour la protéger de la lumière ambiante et incuber à 37 degrés Celsius dans l’incubateur humidifié au dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Après avoir équilibré la plaque couverte pendant 30 minutes supplémentaires, les cellules sont prêtes pour le criblage à haut débit ou HTS. Ensuite, centrifugez la plaque de médicament à 1200 x g dans une centrifugeuse à plaques pendant une minute.Transférer la solution peptidique agoniste 10x de Rhimi-K-1 dans un réservoir auto-friendly de 150 millilitres. Dans le lecteur de plaques, cliquez sur Gérer les protocoles. Ensuite, dans le protocole d’intensité fluorescente du point de terminaison, sélectionnez Flow Forte pre-read, cliquez sur Démarrer la mesure pour mesurer le signal de fond pour l’ensemble du test HTS.Insérez la plaque cellulaire dans le lecteur de plaque. Dans le tableau de bord, cliquez sur un puits aléatoire sur la plaque, puis cliquez sur une nouvelle hauteur de mise au point. Cliquez sur réglage de la mise au point.Cliquez sur Réglage du gain. Attribuez-lui entre 5 % et 10 % de la valeur de fluorescence maximale mesurable. Cliquez sur Démarrer le réglage.Cliquez sur Démarrer la mesure pour lire la plaque entière pour le signal de fluorescence de fond en unités de fluorescence relative ou RFU. Pendant la lecture de la plaque, cliquez sur l’état actuel pour voir la valeur de lecture en temps réel. Pour le test à double addition, pipeter 10 microlitres de la solution médicamenteuse de haut en bas trois fois en utilisant le système de manipulation du liquide et aspirer 1,5 microlitre de chaque puits de la plaque de médicament à une vitesse d’aspiration de 1,0 microlitre par seconde.Distribuer 0,5 microlitre des composés dans le test cellulaire pour atteindre une concentration finale de deux micromolaires dans 0,2% de diméthylsulfoxyde ou DMSO. Après avoir ajouté les composés de criblage, placez immédiatement la plaque de dosage dans le lecteur de plaques. Cliquez sur le programme de lecture prédéfini et lisez la plaque dans les directions de lecture avant et arrière.Éliminez un microlitre de solution médicamenteuse restant dans les embouts en immergeant les embouts dans un réservoir de déchets de 150 millilitres contenant environ 50 millilitres de DPBS. Incuber les composés de criblage avec les cellules pendant un total de cinq minutes, y compris le temps à l’intérieur du lecteur de plaques dans l’armoire de biosécurité avec les lumières éteintes. Ensuite, ajoutez trois microlitres du peptide agoniste Rhimi-K-1 du réservoir dans la plaque de dosage en utilisant le système de manipulation des liquides à l’aide de 384 pointes de 12,5 microlitres.Placez immédiatement la plaque dans le lecteur de plaques. Cliquez sur le programme de lecture prédéfini et lisez la plaque dans les directions de lecture avant et arrière. Une fois terminé, calculez manuellement le facteur Z pour le contrôle de la qualité de chaque essai sur plaque.Sélectionnez manuellement les molécules de hit à partir des cartes thermiques sur la plate-forme de données HTS en ligne et calculez le pourcentage normalisé d’activation ou NPA et activité inhibitrice, ou I0 pour les hits agonistes et les hits antagonistes. Une plaque médicamenteuse interne SAC2-34-6170 composée de 320 petites molécules aléatoires a été utilisée pour démontrer ce test HTS. Le HTS avait une excellente qualité de dosage avec un facteur Z de 0,7 reflétant que la qualité du test était indépendante des composés testés.Il est essentiel de lire la plaque immédiatement après l’ajout de l’agoniste car le signal de fluorescence est de courte durée. Après cette procédure, la molécule de résultat identifiée doit être validée par des dosages dose-réponse et testée dans des cellules qui n’expriment pas le RCPG cible pour exclure les résultats hors cible.

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Un test de dépistage fluorescent pour identifier des modulateurs de canaux Girk

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Un test cellulaire pour l’identification d’agents interagissant avec CXCR4

L'essai de mobilisation du calcium par fluorescence ici décrit est un système de criblage inverse pharmacologie à débit moyen pour l'identification de ligand (s) d'activation fonctionnellement G orphelins de récepteurs couplés aux protéines (RCPG).

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Le test cellulaire décrit est conçu pour l’identification des récepteurs de chimiokines CXC 4 (CXCR4)-interaction des agents qui inhibent ou stimulent, soit compétitif ou façon allostérique,le Ca 2 + intracellulaire initiée par activation CXCR4.

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Le but du présent protocole est de faciliter l’étude des récepteurs NMDA (NMDAR) à grande échelle et de permettre l’examen des effets modulateurs de petites molécules et leurs applications thérapeutiques.

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Les interactions GPCR-MD-arrestin sont un domaine émergent dans la découverte de médicaments par gpCR. Des méthodes précises, précises et faciles à mettre en place sont nécessaires pour surveiller de telles interactions dans les systèmes vivants. Nous montrons un test de complémentarité structurelle pour surveiller les interactions GPCR-MD-arrestin dans les cellules vivantes en temps réel, et il peut être étendu à n'importe quel GPCR.

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Découvrez un test de fluorescence calcique à double addition pour le criblage à haut débit des récepteurs couplés aux protéines G. Cette méthode permet de détecter simultanément agonistes et antagonistes dans les cellules CHO-K1.

Un test de fluorescence calcique à double addition pour le criblage à haut débit de récepteurs couplés à la protéine G recombinante (Vidéo) | JoVE Journal

Un test de fluorescence calcique « à double addition » pour le criblage à haut débit de récepteurs couplés à la protéine G recombinante

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