Génération d’organoïdes de vaisseaux sanguins humains à partir de cellules souches pluripotentes

Ce protocole décrit notre génération d’organoïdes de vaisseaux sanguins humains à partir de cellules souches pluripotentes. Cette technologie peut être utilisée pour étudier les aspects de la vasculogenèse, de l’angiogenèse, des maladies vasculaires, ainsi que des pathologies vasculaires. La reproductibilité et la nature à haut débit, ainsi que sa cohérence dans de nombreuses lignées de cellules souches différentes, sont de grands avantages de cette technique.

En termes d’application, certaines de nos recherches antérieures décrivent l’utilisation des organoïdes des vaisseaux sanguins pour étudier les changements morphologiques pour le système vasculaire des patients diabétiques et explorent les voies de traitement médicamenteux pour la vascularopathie diabétique. Maintenir correctement la population initiale de cellules souches, empêcher les agrégats de s’agglutiner et assurer un diamètre d’agrégat presque homogène, ce sont des facteurs essentiels pour générer de bons organoïdes de vaisseaux sanguins. Commencer la génération d’agrégats en utilisant des cellules souches pluripotentes humaines en culture, ou CSPh, ayant une confluence de 70%.

À l’aide d’une pipette ou d’un système sous vide, aspirez le milieu de culture et remplacez-le par un millilitre de réactif de dissociation cellulaire avant d’incuber les cellules pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Pendant ce temps, préparer le volume nécessaire de milieu d’agrégation dans un tube conique de 15 millilitres, en suivant la formulation mentionnée dans le manuscrit du texte. Après avoir incubé les cellules, aspirer le réactif de dissociation cellulaire avant de suspendre les cellules dans un millilitre de milieu d’agrégation.

Pipeter doucement le contenu de haut en bas pour créer une suspension unicellulaire. Compter les cellules à l’aide d’un dispositif automatisé de comptage de cellules ou au microscope, et calculer le nombre total de cellules nécessaires à la formation d’agrégats. La lecture de la viabilité cellulaire montre une suspension unicellulaire avec des grappes faibles ou nulles.

Aspirer le surnageant du tube et ajouter le volume approprié de la suspension cellulaire au milieu d’agrégation dans le tube conique en polypropylène haute clarté de 15 millilitres et pipeter doucement la suspension cellulaire diluée de haut en bas pour assurer une distribution homogène des cellules. Pipeter trois millilitres de la suspension cellulaire diluée dans chaque puits désiré de la plaque de culture à ultra-faible fixation à six puits. Placez la plaque dans l’incubateur et minimisez toute perturbation pour maintenir la taille et la forme des agrégats.

Préparer le milieu du mésoderme tel que décrit dans le manuscrit textuel. 24 heures après l’ensemencement des cellules, sortez la plaque de culture de l’incubateur. Faites tourbillonner la plaque dans un mouvement circulaire pour accumuler les agrégats au centre de chaque puits.

À l’aide d’une pipette d’un millilitre, transférer doucement les agrégats avec le milieu de chaque puits dans le tube conique correspondant. Laisser les agrégats sédimenter dans les tubes coniques à température ambiante pendant une heure. Une fois sédimenté, aspirer le surnageant avec une pipette ou une pompe d’aspiration à haute sensibilité avec précaution, sans perturber les agrégats décantés.

Remettez en suspension les agrégats dans chaque tube en ajoutant deux millilitres de milieu d’induction mésodermique. Ensuite, transférez la suspension de chaque tube dans le puits respectif de la plaque de culture à six puits à fixation ultra-basse. Placez l’assiette dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et laissez-la jusqu’au quatrième jour.

Le quatrième jour, sortez la plaque de culture de l’incubateur, puis secouez la plaque dans un mouvement circulaire pour recueillir les agrégats au centre de chaque puits. À l’aide d’une pipette d’un millilitre, transférer doucement les agrégats avec le milieu environnant de chaque puits dans le tube conique correspondant. Réglez une minuterie pendant 30 minutes pour permettre aux agrégats de sédimenter dans les tubes.

Une fois les agrégats sédimentés, préparez les plaques de culture comme démontré précédemment et placez-les dans l’incubateur à 37 degrés Celsius jusqu’au sixième jour. Pour l’enrobage des agrégats et l’induction de germes vasculaires, préparer le volume final souhaité de la solution de matrice extracellulaire tout en travaillant sur la glace. Pipeter 500 microlitres de l’ECM dans un puits d’une plaque de 12 puits pour former la première couche du sandwich ECM.

Pour assurer une polymérisation efficace de la première couche ECM, placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Vers la fin de l’incubation de deux heures, commencez à travailler avec les agrégats dans la plaque de culture. Rassemblez les agrégats au centre de chaque puits avant d’utiliser une pipette d’un millilitre pour transférer doucement les agrégats et le milieu de chaque puits dans un tube conique correspondant de 15 millilitres.

Laisser les agrégats se déposer pendant 10 à 15 minutes avant d’aspirer le surnageant. Après quoi, gardez les tubes coniques contenant les agrégats sur la glace pendant cinq minutes. En travaillant rapidement et soigneusement, remettez les agrégats en suspension dans 500 microlitres d’ECM sans formation de bulles.

À l’aide d’une pipette, déposer la suspension d’agrégats ECM sur la première couche ECM déjà polymérisée à l’intérieur du puits dans la plaque de 12 puits. En attendant, préparez le milieu de germination tel que décrit dans le manuscrit textuel. Après deux heures d’incubation à 37 degrés Celsius, ajouter un millilitre de milieu de germination préchauffé à 37 degrés Celsius dans le puits pour induire la différenciation des vaisseaux sanguins.

Travailler dans des conditions stériles, utiliser l’extrémité arrondie d’une spatule stérile pour desserrer la matrice de germination ECM contenant les réseaux vasculaires. Ensuite, à l’aide d’une pince stérile et de l’extrémité arrondie d’une spatule stérile, transférez soigneusement le disque de gel desserré sur le couvercle d’une boîte de culture de 10 centimètres. Placez le gel sur le couvercle sous un stéréomicroscope ajusté au grossissement et à la mise au point souhaités, et utilisez des aiguilles stériles pour découper des réseaux de vaisseaux sanguins uniques, en essayant de limiter la quantité d’ECM non vascularisée obtenue dans le processus.

Retransférer doucement les organoïdes isolés dans un puits d’une plaque de six puits à fixation ultra-basse contenant trois millilitres de milieu de germination. Ensuite, à l’aide d’une pipette d’un millilitre, transférer les organoïdes individuels au nombre approprié de puits dans une plaque de fixation ultra-basse de 96 puits. Une fois transféré, ajoutez 200 microlitres de milieu de germination préchauffé dans chaque puits de la plaque de 96 puits.

Quatre à six jours après l’isolement dans la plaque de 96 puits, assurez-vous que les organoïdes possèdent une morphologie ronde et saine avant de procéder à leur réparation et à leur coloration. Des images de la progression progressive de la génération organoïde des vaisseaux sanguins humains, ou hBVO, à partir des CSPh ont été capturées en champ clair. Au jour zéro, des agrégats allant de 30 à 100 microns de diamètre ont été générés à partir de la culture hPSC.

Des changements subtils dans la taille et la forme des agrégats ont été observés lors de l’induction du mésoderme le premier jour, qui a encore changé le quatrième jour lorsque les agrégats ont subi un amorçage vasculaire. Une germination précoce des vaisseaux à symétrie quasi radiale peut être observée le septième jour, un jour après l’incorporation des agrégats dans la matrice de germination. Une morphologie organoïde saine et une germination continue des vaisseaux ont été observées le neuvième jour, qui a progressé vers des vaisseaux à un stade avancé au jour 10 lorsque les structures cellulaires denses au centre organoïde ont presque disparu.

La morphologie typique des organoïdes des vaisseaux sanguins humains matures a été clairement observée au jour 15. La coloration complète des hBVO matures au jour 15 a montré un réseau endothélial étendu et connecté qui était CD31-positif et entouré de parasites PDGFR-bêta-positifs et d’actine musculaire alpha-lisse SMA-positive. Les cellules murales PDGFR-bêta-positives et SMA-positives encapsulant les réseaux de vaisseaux endothéliaux sont bien observées.

Une membrane basale positive au collagène IV continue enveloppant les réseaux de vaisseaux a également été observée. Assurer une polymérisation correcte de la matrice extracellulaire pendant l’étape d’incorporation est essentiel à une germination efficace des vaisseaux sanguins. Les chercheurs ont utilisé notre technologie organoïde des vaisseaux sanguins pour générer des compartiments vasculaires précoces dans des modèles organoïdes déjà établis, tels que le cerveau et les reins, qui étaient auparavant avasculaires.