Surveillance de l’accumulation de nanomédicaments dans les métastases du cancer du sein murin

Notre recherche se concentre sur le traitement des métastases du cancer du sein à l’aide de thérapies guidées par l’image sur une plateforme de nanoparticules d’oxyde de fer. L’objectif est de développer des thérapies efficaces ciblant spécifiquement les tissus métastatiques, qui sont les principales causes de décès liés au cancer. Il peut être difficile de déterminer si les traitements systémiques ont atteint le tissu souhaité sans sacrifier les animaux.

Notre nanoparticule peut être imagée à l’aide de l’IRM et de l’imagerie optique, ce qui nous permet de surveiller l’administration et l’accumulation de médicaments chez les animaux vivants. Les traitements actuels du cancer du sein métastatique ne sont pas spécifiques aux métastases, ont une efficacité variable et provoquent des effets secondaires indésirables. Notre plateforme de nanoparticules cible spécifiquement le créneau métastatique et permet une surveillance non invasive de son administration sans preuve d’effets indésirables.

Auparavant, nous avons utilisé notre plateforme de nanoparticules pour cibler un moteur de métastases, miR-10b, et avons pu arrêter les métastases et la croissance des métastases. Dans un œil sur l’application clinique, nous étudions la pharmacodynamique de cette formulation afin d’optimiser le schéma thérapeutique et de maximiser l’efficacité. Pour commencer, placez le Matrigel congelé à 4 degrés Celsius pendant 24 heures pour permettre à l’extrait de matrice de se liquéfier.

Après avoir déterminé le nombre total de cellules nécessaires à l’étude, trypsinisez les cellules et lavez-les avec du PBS. Centrifugez les cellules à 200 G pendant 5 minutes. Ensuite, mettez à nouveau le granulé en suspension dans 500 microlitres de PBS réfrigéré pour créer le stock cellulaire.

Maintenant, diluez le nombre total de cellules à 40 fois 10 à la puissance 6 cellules par millilitre. Ajoutez ensuite un volume égal d’extrait de matrice réfrigéré pour obtenir une concentration finale de 1 fois 10 à la puissance 6 cellules par 50 microlitres. Conservez le mélange sur de la glace pour éviter que l’extrait ne se solidifie avant l’implantation.

Transférez la souris anesthésiée dans un cône nasal sur un coussin chauffant. Après avoir confirmé le plan chirurgical de l’anesthésie, appliquez une pommade ophtalmique pour protéger les yeux du dessèchement de la cornée. Nettoyez ensuite la peau près du site d’injection avec une lingette imbibée d’alcool et laissez-la sécher pendant quelques secondes.

Induire au niveau de la glande mammaire numéro quatre pour minimiser le chevauchement du signal entre la tumeur primaire et les sites de métastases courants. Maintenant, pipetez le stock de cellules de haut en bas pour remettre les cellules en suspension. Prélevez 50 microlitres de suspension de cellules glacées dans une seringue à insuline avec une aiguille de calibre 29.

Insérez le biseau de l’aiguille directement sous le mamelon de la glande mammaire souhaitée, parallèlement au corps de la souris, et injectez les cellules à un rythme régulier et lent. Laissez l’aiguille dans la peau pendant au moins 5 secondes après la fin de l’injection pour permettre au Matrigel de se solidifier et d’éviter les fuites. Ensuite, déplacez la souris dans une cage propre sur un coussin chauffant pour la récupération et supervisez-la jusqu’à ce qu’elle soit complètement ambulatoire et puisse maintenir le décubitus sternal.

Pour surveiller la croissance tumorale et le développement des métastases, injectez 150 milligrammes par kilogramme de poids corporel de luciférine intra-péritonéale dans le modèle murin de cancer du sein métastatique anesthésié. Remettez les souris dans leur cage sur un coussin chauffant pour leur permettre de se réveiller et de métaboliser la luciférine. Ensuite, imagez les souris à l’aide du scanner du système d’imagerie, en commençant environ 10 minutes après l’injection de luciférine.

Imagez jusqu’à 5 souris ensemble en position couchée, en vous assurant que tout leur corps est inclus dans les marques de guidage du champ de vision et orienté aussi droit que possible. Utilisez du ruban adhésif transparent pour sécuriser leurs bras afin de mieux visualiser les ganglions lymphatiques axillaires. Maintenant, dans le logiciel du système d’imagerie, réglez l’exposition sur Auto, le Binning sur Moyen, le FStop sur 1, l’Excitation sur Blocage, l’Émission sur Ouvert, le FOV sur D et la Hauteur sur 1,50 pour l’imagerie par bioluminescence.

Lors de l’imagerie de la tumeur primaire, qui produit généralement un signal fort en raison de son emplacement superficiel, réglez l’exposition sur Auto. Si vous surveillez la présence de métastases, couvrez soigneusement la tumeur primaire avec du ruban électrique noir et réglez manuellement l’exposition sur 300 secondes pour capturer tout signal faible. Pour commencer, pesez les souris cancéreuses du sein métastatiques, car le dosage du Nanodrug est basé sur le poids corporel.

Préparez une seringue à insuline avec une aiguille de calibre 29 remplie de 10 milligrammes de fer Nanodrug par kilogramme de poids corporel de souris. Ensuite, plongez la queue de l’animal anesthésié dans de l’eau tiède à 30 à 35 degrés Celsius pendant 30 secondes pour dilater les veines de la queue. Après cela, essuyez l’excès d’eau de la queue et nettoyez le site d’injection avec une lingette à 70 % d’alcool.

Maintenant, insérez le biseau de l’aiguille dans la veine latérale de la queue à peu près à mi-chemin de la queue. Tirez légèrement le piston vers l’arrière pour confirmer le placement avec le retour de sang dans l’aiguille. Une fois l’insertion réussie, injectez le nanomédicament régulièrement à un rythme lent d’environ 5 à 10 secondes pour une injection de 40 microlitres.

Confirmer le succès de l’injection par l’absence de solution qui s’accumule sous la peau de la queue près du site d’injection, et par l’assombrissement de la veine de la solution de nanoparticules sombres. Maintenez la pression sur le site d’injection avec de la gaze et retirez l’aiguille. Maintenez la pression pendant environ 30 secondes jusqu’à ce que le saignement cesse.

Pour recueillir des échantillons de métastases, commencez par imager les souris à l’aide de l’imagerie par bioluminescence. Après avoir recueilli les métastases, placez les tissus collectés dans une boîte de Pétri. Dans le logiciel du système d’imagerie, réglez l’exposition sur Auto, le binning sur Moyen, le FStop sur 1, l’excitation sur Bloc, l’émission sur Ouvert, le FOV sur D et la hauteur sur 1,50 pour l’imagerie par bioluminescence.

Pour l’imagerie de fluorescence, réglez l’exposition sur Auto, le binning sur Moyen, le FStop sur 1, l’excitation sur 675, l’émission sur 720, le niveau de la lampe sur élevé, le champ de vision sur D, la hauteur sur 1,50. Ensuite, imagez la carcasse de la souris avec BLI pour déterminer s’il reste du tissu cancéreux qui vaut la peine d’être collecté. Ensuite, rincez les tissus cancéreux collectés dans du PBS.

Pour prélever des tissus pour la microscopie ou la réaction en chaîne par polymérase quantitative à transcription inverse, intégrez-les dans un composé à température de coupe optimale et stockez-les à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être traités. Pour prélever des tissus pour la spectroscopie d’émission optique à plasma à couplage inductif, tarez une balance à l’aide d’un tube vide de 1,7 millilitre. Placez le tissu dans le tube et notez son poids.

Après avoir congelé le tissu, conservez-le à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à être transformé. La cryosection, la température de coupe optimale, intègre des échantillons fraîchement congelés sur des lames de microscopie à 10 micromètres d’épaisseur. Ajustez la température de la chambre et du porte-échantillon entre moins 20 degrés Celsius et moins 15 degrés Celsius, selon le type de tissu.

Fixez les sections de tissu sur les lames en les immergeant dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 minutes. Rincez soigneusement les lames avec du PBS. Montez ensuite les capots sur les lames à l’aide d’un support contenant du DAPI pour visualiser l’architecture des tissus.

Utilisez un microscope à fluorescence pour examiner les sections de tissu à la recherche d’une fluorescence Cy5.5, qui indique l’administration de nanomédicaments. Confirmez que le signal de fluorescence n’est pas un bruit de fond en le comparant à un échantillon de contrôle négatif provenant d’un animal non injecté. Les souris traitées au Nanodrug ont montré des signaux bioluminescents significatifs dans les métastases pulmonaires une semaine après l’administration, confirmant la présence de métastases dans les tissus pulmonaires.

L’imagerie par fluorescence a confirmé l’accumulation de Cy5.5 du nanomédicament uniquement dans les tissus pulmonaires métastatiques des souris traitées.