Imagerie des signaux Ca²⁺ dans les petites veines pulmonaires à des pressions intraluminales physiologiques

Dans ce protocole, nous présentons une nouvelle technique d’enregistrement et d’analyse des signaux Ca²⁺ dans les veines intrapulmonaires (petites veines pulmonaires ou PV) à des pressions intraluminales physiologiques. La technique consiste à isoler de petits PV, à les incuber avec un indicateur Ca²⁺ , à les canuler et à les pressuriser, à l’imagerie confocale des signaux Ca²⁺ et à l’analyse des données.

Les signaux calciques régulent la fonction des vaisseaux sanguins, dont la source et le rôle varient. Notre objectif est de comprendre leurs fonctions spécifiques dans la paroi vasculaire et d’identifier les anomalies liées à la maladie. La plupart des études des vaisseaux sanguins pulmonaires se concentrent sur les artères ou les capillaires, et non sur les veines pulmonaires.

Aucune étude n’a examiné les signaux calciques dans les veines pulmonaires sous des pressions intraluminales normales malgré leur pertinence physiologique. Les veines pulmonaires subissent un changement de pression au cours des cycles cardio, mais leur impact sur les signaux calciques n’a pas été étudié. Notre protocole permet l’acquisition et l’analyse automatique des signaux calciques dans les petites veines pulmonaires à pression normale.

Notre protocole permet de futures études sur la façon dont la pression intraluminale affecte les signaux calciques dans les petites veines pulmonaires, faisant progresser la compréhension de leur régulation et de leur rôle dans la santé et la maladie. Pour commencer, nettoyez les outils de dissection et la vaisselle à 100 % d’éthanol, puis lavez-les à l’eau déminéralisée. Avec une paire de ciseaux.

Ouvrez la cavité thoracique d’une souris euthanasiée. À l’aide d’une pince, vous pouvez retirer avec précaution le cœur et les poumons de la cavité thoracique en touchant le moins possible les poumons. Ensuite, placez le tissu sur une plaque recouverte d’un protège-joint contenant une solution saline physiologique tamponnée HEPES froide.

Épinglez le cœur et les poumons à l’aide d’épingles de dissection de manière à ce que les grosses veines pulmonaires et les artères pulmonaires soient clairement visibles et que le lobe gauche du poumon soit légèrement étiré. En utilisant les grosses veines pulmonaires comme points de référence, retirez soigneusement le tissu entourant les petites veines interpulmonaires à l’aide de ciseaux fins. Ensuite, isolez doucement les petites veines pulmonaires des tissus environnants.

Ensuite, préparez une concentration de stock de 2,5 millimolaires de Fluo-4 AM avec du DMSO. À l’aide de la solution mère, préparez la solution de chargement. Placez les petites veines pulmonaires dans un tube de 1,5 millilitre avec la solution de chargement.

Couvrez le tube de papier d’aluminium, incubé dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant une heure. Pour canuler les petites veines pulmonaires, retirez une veine de la solution de lavage. Placez-le dans une chambre de myographie à pression préparée.

À l’aide d’une paire de pinces à pointe fine, canulez soigneusement une extrémité de la petite veine pulmonaire sur l’une des canules, puis utilisez un microfilament de fil de nylon pour faire un nœud autour de l’extrémité canulée de la petite veine pulmonaire et de l’extrémité de la canule pour la fixer. Poussez doucement la solution saline physiologique à travers la canule pour éliminer le sang à l’intérieur de la veine pulmonaire. Utilisez du fil de nylon pour attacher l’autre extrémité avec une canule en verre à l’aide de microfilaments.

Pour l’imagerie calcique, fixez d’abord un régulateur de servopression à une tubulure contenant une solution saline physiologique tamponnée HEPES. Utilisez le contrôleur pour pressuriser la petite veine pulmonaire à partir d’une extrémité. Connectez maintenant une pompe péristaltique à une entrée et une sortie et une sortie et superfusionnez la solution.

Après la période d’équilibre, utilisez l’objectif d’immersion dans l’eau 40x et un système d’imagerie confocale à disque rotatif pour acquérir des images de calcium pour 1 000 images. Pour effectuer une analyse d’image, lancez le Spark et le logiciel personnalisés. Utilisez le filtre cinq par cinq et le filtre médian pour lisser les images, suivis d’une image décrivant une région plate de la veine pulmonaire avec plusieurs cellules pour la détection automatique d’événements.

Cliquez sur afficher et Détection automatique d’événement. Réglez le seuil d’événement à une amplitude de 1,3F sur F0, la tolérance à 20 %, la boîte de balayage à sept par sept pixels et la moyenne mobile à sept images. Cliquez sur Démarrer la recherche ou sur l’icône en forme d’œil.

Trouvez la table des événements en cliquant sur la petite table des événements dans le menu Affichage, puis calculez les événements par micromètre carré en divisant le nombre de signaux d’ions calcium détectés par la surface de l’image sélectionnée. Le nombre de signaux calciques se produisant spontanément dans les petites veines pulmonaires à cinq millimètres de pression intraluminale de mercure était de 0,73 plus ou moins 0,2 événements par minute par micromètre carré dans des conditions basales. L’ajout de ryanodine a considérablement réduit l’activité de signalisation du calcium.