Infection in vivo et in vitro des racines de pomme de terre par des nématodes parasites des plantes pour l’évaluation des changements structurels induits

Le protocole décrit l’infection des racines de Solanum tuberosum par des nématodes parasites des plantes dans des conditions de serre in vivo et des racines transgéniques de la pomme de terre in vitro pour l’analyse histochimique de la structure racinaire par microscopie optique.

La recherche sur les infections par les nématodes parasites dans les cultures est influencée par la variabilité des conditions environnementales, ce qui peut avoir une incidence importante sur les résultats expérimentaux et la reproductibilité des données.

Nous avons développé des cultures in vitro de racines transgéniques de pommes de terre avec des nématodes parasites des plantes comme une alternative fiable qui occupe moins d’espace, nécessite moins de temps à obtenir et est exempte de contamination ou de variabilité génétique de l’hôte.

Le suivi de la progression temporelle de l’infection par les nématodes dans les racines des cultures demeure difficile. Les techniques de coloration différentielle constituent une méthode fiable pour identifier les sites d’infection et distinguer avec précision les stades de vie des nématodes.

Par rapport aux essais en serre, les racines lourdes de la pomme de terre soutiennent un système continu et de contrôle pour fournir tous les stades de développement du nématode, indépendamment des variations saisonnières ou climatiques.

Le protocole décrit offre donc plusieurs applications futures prometteuses. Par exemple, il permet d’étudier en détail les mécanismes moléculaires et cellulaires de la façon dont les nématodes parasites des plantes infectent et manipulent les hôtes.

[Narrateur] Pour commencer, lavez une carotte sous l’eau courante du robinet, puis avec une solution détergente courante pour éliminer les débris. Une fois séchée avec une serviette en papier, insérez une brochette en métal stérilisé dans le haut de la carotte, à environ un à deux centimètres vers l’intérieur. À l’aide d’une bouteille de lavage munie d’une buse, mouillez la carotte avec de l’éthanol à 96 %. Épongez la pointe inférieure de la carotte sur un papier filtre stérilisé. Ensuite, passez-le soigneusement à travers une flamme. À l’aide d’un éplucheur stérile, épluchez la carotte de haut en bas et répétez la flambée. Après avoir jeté les parties supérieure et inférieure, placez la section centrale dans une boîte de Pétri stérile. À l’aide d’une lame stérile et d’une pince à épiler, coupez des sections d’un centimètre d’épaisseur. Transférez les sections dans des boîtes de Pétri stériles. Après avoir scellé la plaque, conservez-la sous lumière UV pendant 60 minutes de chaque côté pour stériliser les disques de carottes. Incuber les disques de carottes à 25 degrés Celsius dans l’obscurité pendant une à deux semaines. Ensuite, avec une lame stérile, faites une incision en forme de X au centre du disque de carotte, en ne coupant qu’à mi-chemin. Pipette 50 microlitres de suspension de nématodes des lésions racinaires contenant au moins 50 stades de vie mixtes dans l’incision. Après avoir scellé la boîte de Pétri, incubez-la à 25 degrés Celsius dans l’obscurité pendant trois mois maximum. Pour extraire les nématodes des racines, transférez les disques de carotte avec nécrose visible dans un tamis à mailles de 75 micromètres et de huit centimètres de diamètre placé dans un bol en verre stérile. Ensuite, versez la solution antibiotique sur le tamis jusqu’à ce que les disques soient couverts. Après une nuit d’incubation dans l’obscurité, utilisez une pipette stérilisée pour transférer les nématodes du fond du bol vers un bloc de coloration en verre stérilisé. Pipetez un millilitre de solution antibiotique dans le bloc de coloration et laissez les nématodes se déposer pendant 30 à 40 minutes. Appliquez la solution antibiotique utilisée à la pipette et répétez le processus de lavage quatre à cinq fois. Utilisez immédiatement la suspension de nématode des racines ou conservez-la à 11 degrés Celsius. Choisissez des tubercules de pomme de terre de la même taille et jetez ceux qui présentent des trous, des meurtrissures ou des sections molles. Remplissez des pots de cinq litres avec un mélange individuel de terre d’autoclave et de sable et mélangez 22,5 grammes d’engrais NPK à libération lente. Ensuite, semez les pommes de terre à une profondeur de neuf centimètres sous la surface du sol. Placez les pots dans une serre sous 50 à 70 % d’humidité. Arrosez fréquemment pour maintenir l’humidité du sol à 70 % de sa capacité maximale de rétention d’eau, évitant ainsi les températures extrêmes. Une fois que les plants de pommes de terre ont levé, créez quatre à six trous uniformément répartis autour de chaque plante pour voir la profondeur. Pipetez huit millilitres de suspension contenant 30 000 nématodes des racines vivants à des stades de vie mixtes dans les trous. Ensuite, couvrez les trous avec un mélange de terre. Pour les pots de contrôle et les pots contenant des nématodes des racines, cessez d’arroser le jour de l’inoculation. Après deux mois de culture, déracinez les plants de pommes de terre et séparez les pousses et les racines pour la pesée. Lavez soigneusement le système racinaire. Examinez les racines des sites d’attaque RLN à l’aide de techniques de coloration appropriées. Placez les tubercules de pommes de terre lavés et stérilisés dans un récipient. Couvrez les tubercules d’une solution d’eau de Javel commerciale à 25 %. Fermez le récipient et mélangez pendant 15 minutes. Une fois l’eau de Javel éliminée, rincez les tubercules trois fois avec de l’eau du robinet stérilisée. Ensuite, dans une hotte à flux, plongez les tubercules dans une solution d’éthanol à 80 % pendant 15 minutes en agitant vigoureusement. Après avoir pipeté l’éthanol, rincez trois fois à l’eau du robinet stérilisée. À l’aide d’un scalpel stérile, retirez les parties périphériques des tubercules. Divisez la pièce centrale intérieure en segments de 0,5 centimètre d’épaisseur. Pour inoculer les sections, mélangez d’abord un millilitre de suspension de Rhizobium rhizogenes avec neuf millilitres de milieu SH. Trempez la pointe d’un scalpel stérile dans la suspension diluée et enroulez cinq fois la surface des segments de pommes de terre. Une fois les segments séchés, placez-les sur un milieu SH semi-solide et incubez à 25 degrés Celsius pendant trois jours dans l’obscurité pour faciliter la transfection plasmidique. À la fin du troisième jour, transférez les segments infectés dans des plaques contenant un milieu SH semi-solide complété par des antibiotiques. Après trois mois, utilisez une pince à épiler stérile pour recueillir un grappe d’un gramme de racines transgéniques. Transférez les racines au centre de l’assiette avec un milieu SH frais semi-solide sans antibiotiques. Pour recueillir les masses d’œufs de nématodes, obtenez les galles racinaires. À l’aide d’une pince à épiler stérile à pointe ultra-fine, extrayez soigneusement les masses d’œufs à l’aide d’un stéréomicroscope binoculaire réglé sur un grossissement de 20 x. Placez les masses d’œufs dans une boîte de Pétri couverte contenant cinq millilitres d’eau du robinet stérile et laissez-les éclore pendant 48 heures. Ensuite, dans une hotte à flux, pipetez cinq millilitres de la suspension J2 contenant 100 nématodes par millilitre sur un tamis à mailles de 20 micromètres. Après le lavage à l’eau du robinet stérile, plongez la moitié inférieure du tamis contenant les nématodes J2 dans une solution de peroxyde d’hydrogène à 20 % et mélangez en mouvements circulaires pendant 15 minutes. Versez de l’eau du robinet stérile à travers le tamis sur les nématodes et répétez le processus de lavage deux fois. Inclinez le tamis de manière à ce que les nématodes s’accumulent à la bordure lors du lavage final. Ensuite, pipetez un millilitre d’eau stérile ultrapure à partir du bord du tamis pour récupérer les nématodes. Dans une hotte à flux, sous-cultivez une touffe d’un gramme de racines transgéniques de pomme de terre sur des plaques SH avec 100 nématodes stériles. Surveiller régulièrement la co-culture sous un microscope inversé à un grossissement de 100 x. Lorsque les masses d’œufs deviennent visibles, sous-cultivez les racines dans une nouvelle plaque de milieu SH. L’utilisation de disques de carottes a entraîné une augmentation moyenne de 100 fois des populations de nématodes en trois mois. Les plants de pommes de terre n’ont montré aucun symptôme visible sous une faible population de nématodes des racines. Plusieurs stades de vie de Pratylenchus penetrans ont été observés dans le cortex racinaire après coloration à la fuchsine acide, indiquant que la pénétration du tissu et les lésions nécrotiques associées étaient clairement visibles dans les zones infectées. Le développement de racines transgéniques de pomme de terre a montré une croissance initiale de la masse cellulaire le long des blessures induites par le scalpel dans la section du tubercule de pomme de terre, suivie de l’émergence de racines transgéniques. Une croissance soutenue des racines a été observée dans le milieu de culture et les touffes de racines ont été transférées avec succès dans un milieu de culture frais pour une croissance continue. Des cultures de racines transgéniques de pommes de terre ont été infectées avec succès avec des juvéniles de deuxième stade de Meloidogyne chitwoodi pour établir des co-cultures de nématodes végétaux. Des galles racinaires contenant des femelles adultes et des masses d’œufs ont été observées dans les cultures infectées. Les tissus biliaires formés par Meloidogyne chitwoodi étaient visibles après l’infection des racines de pommes de terre transgéniques avec des stades distincts de développement et de reproduction des nématodes identifiables, y compris la formation de masses d’œufs et d’œufs.