A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Abstract

מקור: Zhang, G. L., et al. הזרקה אורתוטופית של תאי סרטן השד לתוך פד שומן חלב עכברים.J. Vis. Exp. (2019).

במאמר זה נדון כיצד לבסס מודל סרטן שד בעכברות נקבות על ידי הזרקת תאי סרטן השד לתוך כרית שומן החלב. הפרוטוקול לדוגמה מדגים את ההזרקה האורתוטופית.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להוראה ולהמלצה הכללית של חקיקת מינהל הניסויים בבעלי חיים הסינית ואושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית קפיטל (Ref no. AEEI-2014-052). נקבות עכברי Balb/c בגילאי 6 עד 8 שבועות היו בשימוש.

1. הכנת התאים ובעלי החיים

1. יום לפני הניתוח יש לגלח את השיער סביב הפטמות הרביעיות כדי לחשוף את אזור הניתוח.
   1. השתמש ביד אחת כדי להחזיק את העכבר בחוזקה מאחור כדי לוודא שהעכבר לא ינוע בחופשיות, סובב את העכבר כדי לחשוף את בטנו בפני המפעיל, ולאחר מכן השתמש ביד אחרת כדי לגלח את הפרווה סביב הפטמות הרביעית עם מכונת גילוח אלקטרונית.
   2. שים שכבה דקה של קרם הסרת שיער סביב הפטמות במשך 30 – 60 שניות, לנקות את הקרם עם מים מזוקקים, ולאחר מכן לייבש את העכבר עם נייר רך.
2. ביום הניתוח, יש לאסוף תאי סרטן שד מורין (4T1-luc2), לספור את מספר התא, ולהתאים את צפיפות התאים ל 2 x 10⁵ תאים / מ”ל במי מלח חוצצים פוספט (PBS) בצינורות מיקרוצנטריפוגות סטריליות ולשמור אותם על קרח. עבור כל עכבר, 1 x 10⁴ תאים / 50 μL מזרק 1-מ”ל מוכן.

2. הזרקה אורתוטופית

1. הרדמה של עכברים
   1. יש להשרות הרדמה. הכניסו את העכברים למיכל סגור ושקוף והפעילו גז איזופלורן 2% כדי להרדים את העכברים למשך כ-5 דקות, עד שכולם שוכבים ונרדמים.
   2. יש לשמור על הרדמה. מעבירים את העכברים מהמיכל למסכות הרדמה אישיות, מורחים משחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש, שומרים על העכברים צמודים כשהפטמות חשופות למפעיל, ונותנים להם להמשיך לשאוף גז איזופלורן במשך מספר דקות עד לביצוע ההזרקה.
   3. לאשר את ההצלחה של הרדמה על ידי היעדר רפלקס נסיגה צביטת בוהן.
   4. יש למרוח משחה אופתלמית על עיני העכברים למניעת יובש בעיניים.
      NOTE על פי גודל המיכל ומספר מסכות ההרדמה האישיות הזמינות, ניתן להרדים קבוצת עכברים יחד ולהזריק אחד אחד בהרדמה אישית.
2. ביצוע ההזרקה
   1. השתמשו ביד אחת כדי להרים את העור סביב הפטמה הרביעית עם פינצטה, כדי להקים “מנהרה” מוגבהת עבור המזרק שיבוא בעקבותיה. השתמש ביד השנייה כדי להחזיק את המזרק עם המחט פונה כלפי מעלה כדי להיכנס לעור תת עורית ב 5 – 10 מ”מ מן הפטמה; לאחר מכן, עקבו אחר “המנהרה” עד שקצה המחט מתקרב לפטמה, העבירו בזהירות את קצה המחט למעלה לתוך כרית שומן החלב עד שעין המחט נכנסת מתחת לקצה הפטמה, השליכו את הפינצטה והזריקו את התאים לאט.
   2. סובב מעט את המחט ומשוך את המזרק באיטיות; השתמש בצמר גפן כדי ללחוץ על פצע המחט במשך 10 – 20 שניות כדי לוודא שאין חלחול נוזלים.
   3. התבוננו בפטמה הרביעית כדי לאשר הזרקה מוצלחת: כדור שטוח לבן ושקוף אחד עם הפטמה כפי שניתן לראות את המרכז (איור 1).
3. השאירו את העכברים מורדמים למשך דקה נוספת כדי לא לתת לעכברים להתאושש ולנוע מהר מדי, מה שיגרום לפצע ההזרקה להיפתח ולתאי הגידול לדלוף החוצה.

איור 1: תמונות לפני ואחרי הזרקה אורתוטופית בכרית שומן החלב של נקבות עכברי Balb/c. הניתוח בוצע, והתמונות צולמו בזמן שהעכברים היו תחת הרדמה איזופלורנית. A, לפני ההזרקה, B, אחרי ההזרקה.

Materials

anesthesia machine	Midmark Corporation, Dayton, OH, USA	Matrx VMS	anesthesia
 isoflurane	Hebei yipin chemical reagents  company	O21400	anesthesia
1 mL syringe	Becton, Dickinson and  Company	A257	cell injection
hair removal cream	Veet	–	hair removal cream
Carbomer Eye Gel	Dr.GerhardMannChem-Pharm.FabrikGmbH	–	ophthalmic ointment