1.מעבר וטיפוח תאי TUM622 ו-CAF בתרביות דו-ממדיות
- העברת תאי TUM622 ותרבית
- תרבית תלת-ממדית חמה וריאגנטים לדיסוציאציה של תאים (ראו טבלת חומרים) עבור תאי TUM622 ב-37°C.
- מעבר תאי TUM622 במפגש של 80% בצלוחיות דו-ממדיות. בדרך כלל, זה קורה 1 שבוע לאחר המעבר.
- יש להשליך מדיום ישן מבקבוק T75 ולשטוף פעם אחת עם 6 מ"ל של חיץ HEPES. הימנעו מפיטינג ישירות על התאים.
- שאפו את חיץ HEPES. יש להוסיף 4 מ"ל טריפסין/EDTA (0.25 מ"ג/מ"ל, ראו טבלת חומרים) לשטיפה מהירה ולהשליך את הטריפסין/EDTA.
- מוסיפים 2 מ"ל טריפסין/EDTA ודגרים ב-37°C למשך 5 דקות. מוציאים צלוחיות מהאינקובטור ומקישים על הצלוחיות כדי לשחרר את התאים מבלי ליצור בועות אוויר ומחזירים צלוחיות לאינקובטור למשך 5 דקות נוספות.
הערה: חשיפה ממושכת לטריפסין תפגע בתאים באופן בלתי הפיך ותשנה את הפנוטיפ שלהם, ולכן מומלץ להגביל את משך החשיפה של התאים לטריפסין.
- תאים מאושרים התנתקו והתנתקו תחת מיקרוסקופ אור (4x או 10x). הוסף 4 מ"ל של מאגר נטרול (מאגר TNS) (ראה מידע על מגיב תת-תרבית בטבלת החומרים) ואחריו 10 מ"ל של מדיום תרבית תלת-ממדית (ראה טבלת חומרים).
- פיפטה למעלה ולמטה בעדינות כדי לנתק עוד יותר את התאים באמצעות פיפטה 10 מ"ל. מעבירים את המתלה דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל.
- ספור מספרי תאים באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי.
- זרעים 0.8 x 106 תאים/בקבוק T75 ב-20 מ"ל של מדיום תרבית תלת-ממדית (ראה טבלת חומרים).
- האכילו את התאים פעם ביומיים על ידי החלפת מחצית מהמדיום המושקע במדיום טרי.
- CAFs עוברים ומטפחים
- CAFs מעבר כאשר תאים מגיעים למפגש. בדרך כלל, זה קורה לאחר 5 ימים של גידול מפיצול של 1:2.
- הכינו CAF בינוני באמצעות RPMI מדיום בסיסי עם 20% סרום בקר עוברי מומת חום, 1% L-גלוטמין ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין. מחממים את המדיום ל 37 מעלות צלזיוס.
- בצלוחית T75, יש לשטוף CAFs במי מלח חוצצי פוספט (PBS) פעם אחת, ואז להוסיף 2 מ"ל של טריפסין/EDTA ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות.
- התבונן תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא שהתאים התנתקו בבקבוק (4x או 10x). אם לא, האריכו את הדגירה לעוד 2-3 דקות.
- לאחר שהתאים התנתקו והתנתקו, הוסיפו 10 מ"ל של מדיום תרבית תלת-ממדית כדי לנטרל את הטריפסין/EDTA והפיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי לנתק עוד יותר את ה-CAFs.
- מעבירים את מתלה התא לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל ומסתובבים כלפי מטה ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה בנפח מתאים של מדיום תרבית תלת-ממדית (ראו טבלת חומרים) ועברו לשתי צלוחיות T75 חדשות.
2. ציפוי תאי TUM622 במטריצה חוץ-תאית לתרבית תלת-ממדית
- יום לפני הניסוי, הפשירו בקבוקונים של מטריצת קרום מרתף במקרר של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. פיפטות פלסטיק קירור (2 מ"ל) וטיפים ב -20 ° C לילה.
הערה: לא לכל מטריצת קרום המרתף יש את אותה היכולת לתמוך בצמיחה תלת-ממדית של תאי TUM622. לכן, יש צורך לרכוש ולבדוק מספר רב של מטריצת קרום מרתף כדי לזהות את אלה התומכים היווצרות acini חזק. בדרך כלל, זה דורש ריכוז חלבון גבוה יותר (16-18 מ"ג / מ"ל) במטריצה.
- ביום הניסוי, מדיום תרבית תלת מימדית חם, חיץ HEPES, טריפסין/EDTA וחיץ נטרול טריפסין (TNS) באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. מיד לפני הקמת התרבות, הוציאו את מטריצת קרום המרתף המופשרת מהמקרר והניחו את הבקבוקון על קרח.
- מצננים את לוחות תרבית הרקמה על מצנן משטח מתכת המונח על קרח. הניחו צינורות צנטריפוגות על מדף קירור מתכתי על קרח.
- באמצעות תאי TUM622 שהתקבלו משלב 1.1.7, חשב את מספר התאים הרצוי הדרוש לציפוי. בדרך כלל, 15,000-30,0000 תאים נדרשים לכל באר של צלחת 24 בארות. צפיפות נמוכה יותר מתאימה יותר לדימות וכימות, בעוד צפיפות גבוהה יותר עדיפה בעת איסוף תאים למיצוי RNA או לכתישה מערבית.
- מעבירים את מתלה התא לתוך צינור צנטריפוגה מקורר (כל צינור מכיל תאים לציפוי משולש) ומסתובבים מטה ב 300 x גרם בצנטריפוגת דלי תלויה ב 4 ° C למשך 5 דקות.
- שאפו את הסופרנאטנט בזהירות עם פיפטה שואפת המחוברת לקצה לא מסונן (20 μL), תוך השארת כ-100 μL של התווך בצינור (השתמשו בסימונים על הצינור כמנחה).
- הקש בעדינות על צד הצינור כדי לעקור ולנתק את הגלולה לפני החזרתה למדף הקירור.
- באמצעות פיפטות 2 מ"ל מקורר מראש, לערבב בעדינות את המטריצה על ידי pipeting למעלה ולמטה כמה פעמים תוך שמירה על בקבוקון במגע עם הקרח. פיפטה במהירות אחידה ומתונה, כך שלא מוכנסות בועות למטריצה במהלך הליך זה.
- מעבירים את הנפח המתאים של המטריצה לכל צינור צנטריפוגה. עבור ציפוי triplicates בצלחת 24 באר, להוסיף 1.1 מ"ל של מטריצת קרום מרתף לכל צינור.
- בעזרת קצוות מקוררים מראש, פיפטה את המטריצה בכל צינור למעלה ולמטה כ -10 פעמים כדי ליצור תרחיף תא אחיד.
- מעבירים 310 μL של תרחיף תא/מטריצה לכל באר של צלחת 24 בארות מקוררת מראש. הפיפטה ממוקמת בזווית של 90 מעלות למשטח הצלחת והמתלה מתווסף למרכז הבאר. המתלה צריך להתפשט ולכסות את כל הבאר ללא צורך להטות את הצלחת.
- כדי להקל על ניתוח אימונופלואורסנציה במורד הזרם, לוחית את מתלה התא / מטריצה במקביל לתוך שקופיות תא 2 באר. מעבירים 100 μL של מתלה תא/מטריצה למרכז באר של שקופית תא 2 בארות (ראה טבלת חומרים). זה מאפשר למטריצה ליצור מבנה דמוי כיפה עם נפח קטן בהרבה.
- מחזירים את הצלחת ואת התא מחליקים חזרה לתוך אינקובטור תרבית רקמה ודגרים במשך 30 דקות כדי לאפשר למטריצה להתמצק. בדוק את הצלחת / החלקה תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא שתאים בודדים מפוזרים באופן שווה בתוך המטריצה (4x או 10x).
- הוסף 1 מ"ל של מדיום שלם של תרבית תלת-ממדית שחוממה מראש לכל באר ו-1.5 מ"ל של מדיום תרבית תלת-ממדית לכל באר של מגלשת התא ואז החזר אותם לאינקובטור.
3. 3D Coculturing של תאי TUM622 ו-CAFs במטריצה חוץ-תאית
- הכינו מתלי תאים של TUM622 ו-CAF בהתאם לסעיף 2.
- ספרו את צפיפות תאי CAF על ידי לקיחת 10 μL של תרחיף התא וערבובו עם 10 μL של טריפאן כחול.
- הוסף 10 μL של התערובת לכל אחד משני התאים על hemacytometer כדי לספור ולחשב צפיפות התא.
הערה: CAFs יש צורות לא סדירות ולא ניתן לספור אותם במדויק על מונה תאים אוטומטי.
- הטבעה משותפת של תאי TUM622 ו-CAF במטריצת קרום מרתף
- בהתבסס על מידע צפיפות התא, חשב את מספר התאים הרצוי המשמש לציפוי. CAFs נזרעים ביחס של 2:1 של תאי TUM622. לדוגמה, עבור 30,000 תאי TUM622 שנזרעו, 60,000 CAFs מוטמעים במשותף.
- העבירו את הנפח המתאים של TUM622 וכן של מתלי תאי CAF לאותו צינור צנטריפוגה ובצעו את השלבים 2.5-2.11 לציפוי ללוחות בעלי 24 קידוחות. עבור immunofluorescence, להעביר 60 μL של TUM622/CAFs תערובת לשקופיות תא כמתואר בשלב 2.12).
- טיפוח TUM622 עם CAF שכבת-על במטריצת קרום מרתף (ראה טבלת חומרים)
- הגדירו את TUM622 מונו-תרבות לפי שלבים 2.5-2.13.
- העבירו מספר כפול של מתלי CAFs (בהשוואה למספר תאי TUM622 שנזרעו) לתוך צינור צנטריפוגה והסתובבו מטה במהירות של 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את ה-CAFs ב-1 מ"ל של מדיום תרבית תלת-ממדית.
- העבר את 1 מ"ל של מתלי CAF לבאר המכילה את תאי TUM622 המוטבעים.
