השתלה מונחית אולטרסאונד: טכניקה להשתלת תאי אדנוקרצינומה של צינור הלבלב בעכבר בוגר

כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הביקורת הווטרינרית של Jove.

1. הכנה טרום ניתוחית של עכברים

NOTE: שלב זה מומלץ לבצע 24 שעות לפני ההליך.

1. מניחים כלובים המכילים עכברי ניסוי על סט חם יותר ל-37 מעלות צלזיוס.
2. יש להצטייד בכלובים חדשים ונקיים ולהניח על מצע חימום שני המכוון ל-37 מעלות צלזיוס.
3. נקו היטב את ארון הבטיחות הביולוגי, את תא האינדוקציה ואת שלב האולטרסאונד (US) בעזרת חומר חיטוי (ראו טבלת חומרים).
4. הפכו את פונקציית ההתחממות של השלב האמריקאי ל-37 מעלות צלזיוס.
5. הפעל את מכשיר ההרדמה: כוונן את החוגות במפצל הצינור כך שזרימת האוויר תוגבל לתא האינדוקציה בלבד. הפעל את מיכל החמצן והגדר לקצב זרימה של 1 ליטר/דקה. הפעל את וופורייזר isoflurane ל 2-3%.
6. הכנס עכבר יחיד לתא האינדוקציה. עקוב אחר העכבר עד שאינו נייד עוד והנשימה הואטה.
7. כוונן את החוגות על המפצל כך שתתאפשר זרימת אוויר הן לתא ההשראה והן לחרוט האף. הזז במהירות עכבר מתא האינדוקציה והנח אותו בשכיבה גחונית על הבמה האמריקאית החמה עם הלוע שלו בחרוט האף.
8. בדוק את רמת האינדוקציה על ידי התבוננות בכל תגובה רפלקסיבית לצביטת בוהן. אם אין, העכבר מוכן להסרת שיער.
9. יש להניח כמות קטנה של חומר סיכה לעיניים (ראו טבלת חומרים) על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות רקמות. סובב את העכבר כך שהוא שוכב בשכיבה גבית על הבמה. הדביקו בעדינות את הגפיים העליונות והתחתונות לבמה בעזרת נייר דבק על מנת למקסם את חשיפת הבטן ולהצמיד את העכבר לבמה.
10. השתמשו באפליקטור סטרילי עם קצה כותנה כדי למרוח קרם מסיר שכבות נדיב על הרביע השמאלי העליון של הבטן. את depilatory צריך להיות מיושם באזור הכללי של הטחול ולהרחיב לכיוון קו האמצע. אפשר לשבת כדקה.
11. בדוק את מידת הסרת השיער על ידי שימוש עדין בקצה הנגדי של המוליך בקצה הכותנה כדי לנגב את קרם depilatory, ברגע שהוא מסיר בקלות, לנגב את הבטן לנקות עם כרית גזה יבשה. ואז להרטיב שכבה נקייה של גזה עם כמות קטנה של מלוחים חמים לנגב את האזור שוב כדי להסיר לחלוטין את סוכן depilatory. אין לחרוג מ-2 דקות מלאות של מגע ישיר עם עור העכבר על מנת להפחית את הסיכוי לכוויות כימיות.
12. לאחר שהשיער הוסר מספיק מהבטן, החזירו את העכבר לכלוב נקי חדש על חם.
13. בעוד בעל החיים הראשון עובר הסרת שיער על הבמה בארה"ב, ניתן להוסיף את החיה הבאה לתא הזירוז.
14. לפני הרדמת הכלוב הבא של עכברים, לכבות את isoflurane ולשטוף את תא ההשראה עם חמצן. נקו את תא האינדוקציה ואת חרוט הבמה/אף האמריקאי עם סטרילנט. חזור על שלבים 1.5-1.14 עד שכל הכלובים והעכברים יעברו הסרת שיער.
    הערה: ניתן לשקול צום בעלי חיים על ידי נסיגה זמנית של מזון לתקופה שלפני ההשתלה כדי למזער חסימה חזותית של איברי בטן עקב מזון לא מעוכל בקיבה ובמעיים (12-24 שעות). הגבלת מים אינה מומלצת. אם בעלי חיים נמצאים בצום, מומלץ לטפל בהם בזריקה של 1 מ"ל חם (37 מעלות צלזיוס), מי מלח סטריליים לאחר הזרקת הגידול על מנת למנוע התייבשות.

2. השתלה מונחית אולטרסאונד של תאי PDA

הערה: כל הליכי האולטרסאונד מבוצעים באמצעות מכשיר ותוכנה להדמיית אולטרסאונד (ראה טבלת חומרים). למתמר יש תדר מרכזי של 40 MHz ורוחב פס של 22-55 MHz.

1. התאימו את משטח האולטרסאונד כך שמשטח הפלטפורמה יהיה מקביל לרצפה והחוקר יפנה לצד שמאל של החיה, כאשר ראשו של בעל החיים ימינה. התאימו את מיקום המתמר כך שתתקבל תמונת בטן רוחבית (איור 1A).
2. מרדים את העכבר להזרקה כמתואר בשלבים 1.1-1.8. ייצב את העכבר בפלטפורמה האמריקאית כמתואר בשלב 1.9.
3. יש למרוח כמות נדיבה של ג'ל אולטרסאונד חם (37°C) על החלק חסר השיער של הבטן.
4. הנמיכו בעדינות את המתמר כדי ליצור מגע עם בטן העכבר. כוונן את המתמר לפי הצורך עד שהלבלב נראה בבירור. אתר את הכליה והטחול השמאליים על מנת לספק כיוון מדויק של חלל הבטן.
   הערה: מכיוון שמיקום המתמר השתנה כדי לאפשר גישה לצד השמאלי של הבטן, ציר X ו- Y בפקדי הבמה הפוך כעת.
5. טען מזרק אינסולין בגודל 29G x 1/2" (ראה טבלת חומרים) עם 25μL של תרחיף תאי גידול. נגבו את קצה המחט בפד להכנת אלכוהול סטרילי לפני ההזרקה על מנת למזער את זריעת תאי הגידול בדופן הבטן.
6. בעזרת מלקחיים קהים, אחזו בעור ובדופן הצפק כדי להגביר את המתח במקום ההזרקה הרצוי. החזקת המזרק בזווית של 25°-45° למשטח משטח משטח האולטרסאונד, מקדמת באיטיות את המחט דרך העור ודופן הצפק. ודא שהמחט ניקבה דרך דופן הצפק לפני שתמשיך לשלב הבא. יש להרגיש פופ קטן כאשר המחט חודרת את דופן הצפק.
7. בהדמיית אולטרסאונד, כוונו את המחט ישירות לתוך הלבלב (איור 1B-C). ודא שהמחט נמצאת בתוך רקמת הלבלב על ידי הזזת קנה המזרק בעדינות למעלה ולמטה. אם המיקום נכון, קצה המחט יישאר בתוך רקמת הלבלב בזמן שקנה המזרק זז.
8. הזריקו לאט את תאי הגידול וודאו שהתאים מושתלים במיקום הרצוי על-ידי היווצרות בולוס נוזלי בתוך הלבלב (ניתן לראות במסך האולטרסאונד, איור 1D).
   הערה: התנגדות מסוימת צריכה להיות מורגשת בעת לחיצה על הבוכנה. היזהר לא לנקב את הלבלב מספר פעמים כמו זה מגדיל את הסבירות של דליפה לתוך חלל הבטן.
9. לאחר הזרקת מלוא נפח המתלה וניתן לראות בולוס נוזלי בלבלב, יש לשמור על מחט דוממת למשך מספר שניות. לאט למשוך מחט מבטן העכבר, תוך הקפדה רבה לא להפריע לתאים המוזרקים.
10. הניחו את העכבר בכלוב נקי וחם וודאו שהעכבר מחלים לחלוטין מההרדמה. חזור על תהליך זה עבור כל בעלי החיים.
11. לפני הרדמת העכבר הבא, נקו את תא האינדוקציה ואת חרוט הבמה/אף עם סטרילנט.
12. חזור על שלבים 2.2-2.11 עד שכל העכברים הוזרקו.

איור 1: השתלה מונחית אולטרסאונד של תאי PDA בלבלב המורין. (A) כיוון של עכבר, שלב אולטרסאונד ובדיקת אולטרסאונד המשמשים לקבלת תמונה ברזולוציה גבוהה של איברי הבטן. שימו לב שהבמה והפלטפורמה הופנו ב-90° מהכיוון הסטנדרטי כדי לאפשר גישה נוחה לרביע השמאלי העליון של בטן העכבר. (B) תמונה אולטרה-סונוגרפית המתארת זיהוי כליות, טחול ולבלב. כאן מחט ההזרקה ממוקמת כנגד בטן העכבר. (C) תמונה אולטרה-סונוגרפית המתארת את המחט בתוך לבלב העכבר. (D) תמונה אולטרה-סונוגרפית המתארת את הבועה במקום ההזרקה (מסומן בכחול) לאחר הזרקה מבוקרת של תאי הגידול ללבלב. (E) לפרוטומיה המגלה את הבולוס הנוזלי המכיל תאי PDA בלבלב לאחר הזרקה מונחית אולטרסאונד. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.