השתלת גידול הומוגרפט אורתוטופית: טכניקה ליצירת מודלים של עכברי גידול בלבלב

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנה להשתלת גידול

1. מגורי בעלי חיים
   1. השג עכברי C57BL/6 גנריים מספק רבייה מסחרי.
   2. עכברי בית (5) בכלובים מאווררים נפרדים בתנאים הבאים: טמפרטורה: 20-26 מעלות צלזיוס; לחות 30-70%; מחזור תאורה: 12 שעות אור ו-12 שעות כהות.
   3. השתמשו במצעי קלחי תירס המוחלפים מדי שבוע.
   4. עבור דיאטה, לספק הקרנה מעוקר מזון גרגירים יבש במהלך כל תקופת המחקר.
   5. עבור מים, לספק לבעלי חיים גישה חופשית למי שתייה סטריליים.
2. הכנת מקטע גידול תורם
   1. התחל על ידי ניטור משקל הגוף (BW), באמצעות שקילה באמצעות איזון, ונפח הגידול (TV), על ידי מדידת קליפר, של עכברים תורמים נושאי גידול.
   2. כאשר הטלוויזיה מגיעה ל-500-1,200 מ"מ³, יש להרדים את בעל החיים במכסה מנוע מסוכן ביולוגית בהתאם לפרוטוקול.
   3. לעקר את העור סביב הגידול באמצעות מקלוני יודופור.
   4. להסיר את הגידול בניתוח בהתאם לפרוטוקול.
   5. בדוק חזותית ועל ידי מישוש נוכחות של גידולים מוחשיים לפני הסיום.
   6. להפסקת הריון יש להרדים תחילה עכברים לפי פרוטוקול מאושר, לפתוח את הבטן ולבדוק ויזואלית את הלבלב לאיתור גידולים.
   7. לחתוך את הגידול על ידי ניתוח לאחר המוות ולהוסיף אותו PBS קר. הניחו את כל בעלי החיים בתא המתת חסד נקי, לא טעון, שקוף עם מכסה מיוחד עם יציאה למשלוח של פחמן דו חמצני לשימוש.
   8. פריקת גז לתוך התא בקצב זרימה המייצר חוסר הכרה מהיר עם מצוקה מינימלית לחיה. קצב הזרימה האופטימלי עבור_CO2 צריך להיות סביב 2-2.5 ליטר/דקה.
   9. צפו ויזואלית בכל בעל חיים במהלך הליך המתת החסד כדי להבטיח שכל בעלי החיים מקבלים ריכוזי גזים נאותים ואינם חוזרים להכרה במהלך הליך המתת החסד.
   10. יש לשמור על זרימת הגזים למשך דקה אחת לפחות לאחר מוות קליני לכאורה כדי למזער את האפשרות שבעל חיים יתאושש (אם הוא סובל מדום נשימה אך לא מת).
   11. הסר רקמות סמוכות שאינן סרטניות. ניתן לצלם גידול מנוקה במהירות.
       הכניסו את רקמות הגידול ל-RPMI-1640 ושמרו על קרח לפני הדיסוציאציה.
       הערה: פגרי בעלי חיים נארזים בשקיות ומאוחסנים במקפיא המתאים כדי להמתין להסרתם.
   12. הניחו את הגידול בצלוחית פטרי המכילה 20 מ"ל PBS (צננו מראש את המדיה או חיץ ל-4 מעלות צלזיוס לפני המתת חסד של בעלי חיים).
   13. אם יש דם מזהם, להעביר את הגידול לתוך צלחת פטרי אחרת ולשטוף את הגידול עם PBS.
   14. חתכו את הגידול לשניים, הסירו עודפי עור, כלי דם, הסתיידות ו/או נמק.
   15. בחר רק חתיכות שלמות של גידול והכנס אותן לצינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מ"ל והוסף 20 מ"ל של PBS ואז העבר את הצינור לחדר חיות נפרד ללימודי פרמקולוגיה.

2. השתלה אורתוטופית של הלבלב

1. הרדמה ושיכוך כאבים
   1. יש להשתמש בהזרקת קטמין של 2 מ"ל ובהזרקת קסילזין של 0.42 מ"ל (20 מ"ג/מ"ל) מעורבבת במי הזרקה סטריליים או במי מלח במינון של 0.06-0.1 מ"ל/20-25 גרם משקל גוף.
      הערה: על פי רווחת בעלי חיים, שיכוך כאבים נחוץ הן לפני ואחרי הניתוח. 0.05-0.1 מ"ג בופרנורפין /ק"ג, SC. המנה הראשונה היא לפני הניתוח ולאחר מכן מינון 3 פעמים כל 4 שעות לאחר הניתוח ברציפות.
2. ניתוח להשתלה אורתוטופית
   1. מרדימים עכברים באמצעות הזרקה תוך שרירית (IM). מרדימים את בעל החיים המקבל עם 5% isoflurane, אשר נשמר על ידי חרוט האף ב 1%. החיה תתחיל להירגע, תאבד את הרפלקס הימני שלה ובסופו של דבר תהיה חסרת תנועה. בעומק זה של הרדמה הם יכולים בקלות להתעורר על ידי גירויים כואבים; לאפשר להרדמה להעמיק עד שתגובות כאלה לכאב נעדרות.
   2. לאחר שבעלי החיים מורדמים באופן מלא, מקבעים את העכברים על לוח ניסוי במיקום צדדי ימני.
   3. שמור את העכברים במצב צדדי ימני. לחטא את העור סביב הטחול עם יוד ולאחר מכן de-iodinate עם 75% אלכוהול אתיל.
   4. מצא את הנקודה הבינונית של הטחול ובצע חתך אנכי של 1 ס"מ בבטן כדי לחשוף את הטחול.
   5. לשלוף חלק מרקמת הלבלב מתחת לטחול בעדינות עם פינצטה שטוחה, ולתפור חתיכת גידול הומוגרפט עכבר זרע על הלבלב של העכבר המקבל על ידי 9-0 תפר כירורגי נספג.
   6. סגור את הבטן בתפר משי 6-0 בתפר כפול. להשיג הומאוסטזיס על ידי דחיסה.
   7. לאחר סיום השתלת הגידול, אם לא מתרחש דימום או דליפת רקמת גידול, יש לשמור את בעלי החיים בכלוב חם.
   8. יש לעקוב אחר בעל החיים עד שהוא חוזר להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה; להחזיר את בעל החיים לחדר החיות לאחר התאוששות מלאה מההרדמה. עקוב אחר העכברים נושאי הגידול על ידי מישוש הבטן ליד הטחול ובחר את העכברים הנושאים גידולים אורתוטופיים.

3. ניטור בריאות עכברים נושאי גידולים

1. בדוק את צריכת המים והמזון מדי יום.
2. בדוק את מראה העכבר עבור פרוות שיער לא מטופחת, גושים, רזון, נשימה חריגה או מיימת.
3. למשש את הבטן כדי לבדוק אם יש גידולים ספונטניים על הכבד או הטחול.
4. שקלו עכברים מדי שבוע באמצעות איזון.
5. אם אחד מהסימנים הקליניים הבאים נצפים, העכברים מוקרבים לאיסוף דגימות ונקרופסיה: אובדן BW >20%; ניידות לקויה (לא מסוגל לאכול או לשתות); לא מסוגל לזוז בדרך כלל בגלל מיימת משמעותית ובטן מוגדלת; מאמץ בנשימה.