עריכת גנים בתיווך PiggyBac transposon בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים: הליך לשילוב גן מעניין בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים באמצעות מערכת PiggyBac Transposon

Published: April 30, 2023
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Abstract

מקור: Garone, M. G. et al. המרה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (iPSCs) לנוירונים מוטוריים תפקודיים בעמוד השדרה ובגולגולת באמצעות וקטורים של PiggyBac. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את ההליך ליצירת נוירונים מוטוריים על ידי טרנספקציה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים עם מערכת טרנספוזון PiggyBac על ידי ביטוי חוץ רחמי של גורמי שעתוק ספציפיים לשושלת.

Protocol

1. יצירת קווי iPSC אינדוקטיביים NIL ו- NIP

  1. טרנספקציה של תאים
    1. שטפו את התאים עם PBS (ללא Ca2+/Mg2+).
    2. הוסף מגיב דיסוציאציה של תאים (ראה טבלת חומרים) (0.35 מ”ל עבור צלחת 35 מ”מ) ודגור ב 37 ° C עד תאים בודדים
    3. מופרדים (5-10 דקות).
    4. השלם בעדינות את הפרדת התאים על ידי פיפטציה למעלה ולמטה עם פיפטור P1000 3-4 פעמים.
    5. יש לאסוף בצינור של 15 מ”ל ולהוסיף PBS (Ca2+/Mg2+ חינם) ל-10 מ”ל. ספור את התאים.
    6. גלולה 106 תאים והשעיה מחדש ב 100 μl של חיץ R (כלול בערכת אלקטרופורציה התא, ראה טבלת חומרים).
    7. הוסף DNA פלסמיד עבור transfection: 4.5 מיקרוגרם של וקטור transposable (epB-Bsd-TT-NIL או epB-Bsd-TT-NIP) ו 0.5 מיקרוגרם של פלסמיד transposase piggyBac.
    8. הדבקה במערכת אלקטרופורציה של התא (ראה טבלת חומרים) על פי הוראות היצרן עם הפרמטרים הבאים: מתח 1,200 וולט, רוחב 30 אלפיות השנייה, פעימה אחת. זרעו את התאים בתווך iPSC אנושי בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632 (מעכב רוק, ראו טבלת חומרים) בצלחת מצופה מטריצה בקוטר 6 מ”מ.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

B27Miltenyi Biotec 130-093-566Serum free supplement for neuronal cell maintenance
BambankerNippon GeneticsNGE-BB02Cell freezing medium for motor neuron progenitors
CaCl<sub>2</sub>Sigma-AldrichC3881Chemicals for electrophysiological solutions
Corning Matrigel hESC-qualified MatrixCorning354277Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports
CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIABiological Industries05-710-1EFreezing medium for human iPSCs
DispaseGibco17105-041Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
DMEM/F12Sigma-AldrichD6421-500MLBasal medium for cell culture
DoxycyclineSigma-AldrichD9891-1GUsed to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors
DS2UWiCellUWWC1-DS2UCommercial human iPSC line
GDNFPreproTech450-10Glial-Derived Neurotrophic Factor
Gibco Episomal hiPSC LineThermo Fisher ScientificA18945Commercial human iPSC line
HepesSigma-AldrichH4034Chemicals for electrophysiological solutions
LamininSigma-Aldrich11243217001Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
NEAAThermo Fisher Scientific11140035Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability.
Neon 100 &mu;L KitThermo Fisher ScientificMPK10096Cell electroporation kit
Neon Transfection SystemThermo Fisher ScientificMPK5000Cell electroporation system
Neurobasal MediumThermo Fisher Scientific21103049Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the&nbsp; need for an astrocyte feeder layer
NutriStem-XF/FFBiological Industries05-100-1AHuman iPSC culture medium
PBS Ca<sup>2+</sup>/Mg<sup>2+</sup> freeSigma-AldrichD8537-500MLDulbecco's Phosphate Buffer Saline, w/o Calcium, w/o Magnesium
Penicillin/StreptomycinSigma-AldrichP4333-100MLPenicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria.
Y-27632 (ROCK inhibitor)Enzo Life SciencesALX-270-333-M005Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival

Tags

PiggyBac Transposon-Mediated Gene Editing in Human iPSCs: A Procedure to Integrate Gene of Interest in Human iPSCs Using PiggyBac Transposon System

Play Video

Cite This Article
PiggyBac Transposon-Mediated Gene Editing in Human iPSCs: A Procedure to Integrate Gene of Interest in Human iPSCs Using PiggyBac Transposon System. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20983, doi: (2025).

View Video