A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Abstract

מקור: Garone, M. G. et al. המרה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (iPSCs) לנוירונים מוטוריים תפקודיים בעמוד השדרה ובגולגולת באמצעות וקטורים של PiggyBac. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את ההליך ליצירת נוירונים מוטוריים על ידי טרנספקציה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים עם מערכת טרנספוזון PiggyBac על ידי ביטוי חוץ רחמי של גורמי שעתוק ספציפיים לשושלת.

Protocol

1. יצירת קווי iPSC אינדוקטיביים NIL ו- NIP

1. טרנספקציה של תאים
   1. שטפו את התאים עם PBS (ללא Ca²⁺/Mg²⁺).
   2. הוסף מגיב דיסוציאציה של תאים (ראה טבלת חומרים) (0.35 מ”ל עבור צלחת 35 מ”מ) ודגור ב 37 ° C עד תאים בודדים
   3. מופרדים (5-10 דקות).
   4. השלם בעדינות את הפרדת התאים על ידי פיפטציה למעלה ולמטה עם פיפטור P1000 3-4 פעמים.
   5. יש לאסוף בצינור של 15 מ”ל ולהוסיף PBS (Ca^2+/Mg²⁺ חינם) ל-10 מ”ל. ספור את התאים.
   6. גלולה 10⁶ תאים והשעיה מחדש ב 100 μl של חיץ R (כלול בערכת אלקטרופורציה התא, ראה טבלת חומרים).
   7. הוסף DNA פלסמיד עבור transfection: 4.5 מיקרוגרם של וקטור transposable (epB-Bsd-TT-NIL או epB-Bsd-TT-NIP) ו 0.5 מיקרוגרם של פלסמיד transposase piggyBac.
   8. הדבקה במערכת אלקטרופורציה של התא (ראה טבלת חומרים) על פי הוראות היצרן עם הפרמטרים הבאים: מתח 1,200 וולט, רוחב 30 אלפיות השנייה, פעימה אחת. זרעו את התאים בתווך iPSC אנושי בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632 (מעכב רוק, ראו טבלת חומרים) בצלחת מצופה מטריצה בקוטר 6 מ”מ.

Materials

B27	Miltenyi Biotec	 130-093-566	Serum free supplement for neuronal cell maintenance
Bambanker	Nippon Genetics	NGE-BB02	Cell freezing medium for motor neuron progenitors
CaCl<sub>2</sub>	Sigma-Aldrich	C3881	Chemicals for electrophysiological solutions
Corning Matrigel hESC-qualified Matrix	Corning	354277	Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports
CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA	Biological Industries	05-710-1E	Freezing medium for human iPSCs
Dispase	Gibco	17105-041	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D6421-500ML	Basal medium for cell culture
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D9891-1G	Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors
DS2U	WiCell	UWWC1-DS2U	Commercial human iPSC line
GDNF	PreproTech	450-10	Glial-Derived Neurotrophic Factor
Gibco Episomal hiPSC Line	Thermo Fisher Scientific	A18945	Commercial human iPSC line
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	Chemicals for electrophysiological solutions
Laminin	Sigma-Aldrich	11243217001	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
NEAA	Thermo Fisher Scientific	11140035	Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability.
Neon 100 &mu;L Kit	Thermo Fisher Scientific	MPK10096	Cell electroporation kit
Neon Transfection System	Thermo Fisher Scientific	MPK5000	Cell electroporation system
Neurobasal Medium	Thermo Fisher Scientific	21103049	Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the&nbsp; need for an astrocyte feeder layer
NutriStem-XF/FF	Biological Industries	05-100-1A	Human iPSC culture medium
PBS Ca<sup>2+</sup>/Mg<sup>2+</sup> free	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Dulbecco's Phosphate Buffer Saline, w/o Calcium, w/o Magnesium
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100ML	Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria.
Y-27632 (ROCK inhibitor)	Enzo Life Sciences	ALX-270-333-M005	Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival