מקור: Merenda, A. et al., A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids using a CRISPR-concatemer. J. Vis. Exp. (2017).
סרטון זה מתאר טכניקת נוקאאוט גנטי המשתמשת בשרשור קריספר כדי להעלים בו זמנית גנים מרובים בתאי אורגנואיד של עכבר בתרבית. שיטה זו משמשת כדי לדפוק גן חולה ולהבהיר את תפקודו של גן ואת הפרלוגים שלו.
1. תכנון gRNA עבור וקטור CRISPR-concatemer
הערה: מטרת חלק זה היא להסביר כיצד לבחור באסטרטגיית המיקוד הטובה ביותר וכיצד לתכנן gRNA המכיל שלוחות ספציפיות עבור וקטור CRISPR-concatemer.
2. שיבוט של gRNA לווקטור CRISPR-concatemer
3. טרנספקציה של אורגנואידים במעיים על ידי אלקטרופורציה
הערה: שים לב כי הליך זה מבוסס על הפרוטוקול שפורסם על ידי Fujii et al. בשנת 2015, עם התאמה לתרביות אורגנואידים במעי דק של עכבר.
קלטת 1 | קלטת 2 | קלטת 3 | קלטת 4 | |
רצף (5′-3′) | CACCGG[gRNA1]GT | ACCGG[gRNA2]G | CCGG[gRNA3] | ACACCGG[gRNA4]GTT |
רצף (5′-3′) | TAAAAC[RC-gRNA1]CC | AAAAC[RC-gRNA2]C | AAAC[RC-gRNA3] | CTAAAAC[RC-gRNA4]CCG |
טבלה 1: תליה עבור כל קלטת של וקטור שרשור CRISPR.
מדיום בסיסי | הערות | |
יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך 4 שבועות | ||
מדיום תרבית תאים | 500 מ”ל | ראה טבלת חומרים |
ל-גלוטמין | 100x 5 מ”ל | |
סוכן חציצה 1 מ | ‘5 מ”ל | ראה טבלת חומרים |
פניצילין סטרפטומיצין | 100x 5 מ”ל | |
WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + Rspondin + Nicotinamide) | ||
יש לאחסן ב-4°C למשך שבועיים | ||
מדיום בסיסי | עד 50 מ”ל | |
תוסף תזונה ללא סרום תאי עצב (50x) | 1 מ”ל | ראה טבלת חומרים |
תוסף תזונה ללא סרום תאי עצב (100x) | 500 μL | ראה טבלת חומרים |
n-אצטיל-ציסטאין (500 מילימול) | 125 מיקרוליטר | |
עכבר EGF (100 מיקרוגרם/מ”ל) | 25 מיקרוליטר | |
Noggin עכבר (100 מיקרוגרם/מ”ל) | 50 מיקרוליטר | |
מדיום מותנה R-ספונדין | 5 מ”ל | |
מדיום מותנה Wnt3a | 25 מ”ל | |
ניקוטינאמיד (1 מטר) | 250 מיקרוליטר | |
EN + CHIR + Y-27632 (EGF + Noggin + CHIR + Y-27632) | ||
יש לאחסן ב-4°C למשך שבועיים | ||
בינוני בסיסי עם סטרפטומיצין פניצילין | עד 20 מ”ל | |
תוסף תזונה ללא סרום תאי עצב (50x) | 400 מיקרוליטר | ראה טבלת חומרים |
תוסף תזונה ללא סרום תאי עצב (100x) | 200 מיקרוליטר | ראה טבלת חומרים |
n-אצטיל-ציסטאין (500 מילימול) | 50 מיקרוליטר | |
עכבר EGF (100 מיקרוגרם/מ”ל) | 10 מיקרוליטר | |
Noggin עכבר (100 מיקרוגרם/מ”ל) | 20 מיקרוליטר | |
Y-27632 (10 מיקרומטר) | 20 מיקרוליטר | |
CHIR99021 (8 מיקרומטר) | 10 מיקרוליטר | |
EN (EGF + Noggin) | ||
יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך 4 שבועות | ||
מדיום בסיסי | עד 50 מ”ל | |
תוסף תזונה ללא סרום תאי עצב (50x) | 1 מ”ל | ראה טבלת חומרים |
תוסף תזונה ללא סרום תאי עצב (100x) | 500 μL | ראה טבלת חומרים |
n-אצטיל-ציסטאין (500 מילימול) | 125 מיקרוליטר | |
עכבר EGF (100 מיקרוגרם/מ”ל) | 25 מיקרוליטר | |
Noggin עכבר (100 מיקרוגרם/מ”ל) | 50 מיקרוליטר |
טבלה 2: הרכב מדיה אורגנואידית.
דופק נקבוב | דופק העברה | |
מתח | 175V | 20V |
אורך פולס | 5 מטר/שניה | 50msec |
מרווח דופק | 50msec | 50msec |
מספר פעימות | 2 | 5 |
קצב ריקבון | 10% | 40% |
קוטביות | + | +/- |
טבלה 3: הגדרות אלקטרופורציה.
The authors have nothing to disclose.
Optimized CRISPR Design Tool | Feng Zhang group | CRISPR gRNA design tool; http://crispr.mit.edu/ | |
Webcutter 2.0 | restriction mapping tool; http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/ | ||
T4 PNK (Polynucleotide Kinase) | New England Biolabs | M0201L | |
T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | M0202S | |
T7 DNA Ligase | New England Biolabs | M0318L | |
DTT (dithiothreitol) | Promega | P1171 | |
ATP (adenosine triphosphate) | New England Biolabs | P0756S | |
FastDigest BbsI (BpiI) | Thermo Fisher | FD1014 | |
Tango buffer (BSA-containing restriction enzyme buffer) | Thermo Fisher | BY5 | |
BglII | New England Biolabs | R0144 | |
EcoRI | New England Biolabs | R0101 | |
Plasmid-safe exonuclease | Cambio | E3101K | |
Thermal cycler | Applied biosystems | 4359659 | |
10G competent E. coli bacteria | Cambridge Bioscience | 60108-1 | |
Advanced DMEM/F12(cell culture medium) | Invitrogen | 12634-034 | |
Glutamax (L-Glutamine) | 100x Invitrogen | 35050-068 | |
HEPES 1 M (buffering agent) | Invitrogen | 15630-056 | |
Penicillin-streptomycin 100x | Invitrogen | 15140-122 | |
B27 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
N2 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
n-Acetylcysteine 500 mM | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
Mouse EGF 500 μg/mL | Invitrogen Biosource | PMG8043 | |
Mouse Noggin 100 μg/mL | Peprotech | 250-38 | |
Nicotinamide 1 M | Sigma | N0636 | |
R-Spondin conditioned medium | n.a. | n.a. | Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013 |
Wnt conditioned medium | n.a. | n.a. | Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2014 |
Y-27632 10 μM | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
Standard BD Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | |
48-well Plate | Greiner Bio One | 677980 | |
CHIR99021 | Sigma-Aldrich | A3734-1MG | |
IWP-2 | Cell Guidance Systems | SM39-10 | |
TrypLE (recombinant protease) | Invitrogen | 12605-010 | |
Opti-MEM (reduced serum medium) | Life technologies | 51985-034 | |
Electroporation Cuvettes 2 mm gap | NepaGene | EC-002S | |
Low binding 15 mL tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
Bürker’s chamber | Sigma-Aldrich | BR719520-1EA | |
NEPA21 Super Electroporator | NepaGene | contact supplier | |
Protein LoBind tubes low binding | Thermo Fisher | 10708704 | |
BTXpress electroporation buffer | Harvard Apparatus | 45-0805 | |
DMSO (Dimethyl sulfoxide) | AppliChem | A3672 |