A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Abstract

מקור: Merenda, A. et al., A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids using a CRISPR-concatemer. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מתאר טכניקת נוקאאוט גנטי המשתמשת בשרשור קריספר כדי להעלים בו זמנית גנים מרובים בתאי אורגנואיד של עכבר בתרבית. שיטה זו משמשת כדי לדפוק גן חולה ולהבהיר את תפקודו של גן ואת הפרלוגים שלו.

Protocol

1. תכנון gRNA עבור וקטור CRISPR-concatemer

הערה: מטרת חלק זה היא להסביר כיצד לבחור באסטרטגיית המיקוד הטובה ביותר וכיצד לתכנן gRNA המכיל שלוחות ספציפיות עבור וקטור CRISPR-concatemer.

1. עצבו gRNA כנגד הגנים המעניינים באמצעות כלי תכנון gRNA CRISPR לבחירה. ראה את טבלת החומרים לדוגמה.
   הערה: כאשר מתמקדים בזוג גנים פרלוגיים, אף על פי שאפשר לתכנן gRNA אחד לכל גן, מומלץ לתכנן שני gRNA לכל גן כדי להגדיל את הסיכויים להשיג נוקאאוט כפול (איור 1).
2. ודא שה- gRNA אינו מכיל את אתר הזיהוי BbsI באמצעות כלי מיפוי הגבלות (עיין בטבלת החומרים לדוגמה).
3. הוסף שלוחות וקטוריות ספציפיות של CRISPR-concatemer לכל אוליגו, כפי שמוצג בטבלה 1.

2. שיבוט של gRNA לווקטור CRISPR-concatemer

1. זרחן וחישול של אוליגוס
   הערה: שלב זה מדגים כיצד לשלול גדילים עליונים ותחתונים עבור כל אוליגו gRNA וכיצד לזרחן את קצותיהם בתגובה אחת.
   1. הכינו את תערובת התגובה לאוליגוס זרחני וחישול גדילים עליונים ותחתונים על קרח, בהתאם להוראות הבאות.
      הערה: ניתן לאגד את כל האוליגוס לתגובה אחת; לדוגמה, במקרה של וקטור 4 gRNA-concatemer, איחד יחד 8 אוליגוס.
   2. עבור 3 שרשרורים, השתמש בגדיל העליון של 3.0 μL gRNA (1.0 μL מכל gRNA; 10 μM, 1 μL/gRNA), 3.0 μL gRNA גדיל תחתון (1.0 μL מכל gRNA; 10 μM, 1 μL/gRNA), 2.0 μL T4 DNA ligase buffer (10x), 1.0 μL T4 PNK, והוסף H₂O עד לנפח כולל של 20.0 μL.
   3. יש לערבב היטב על ידי פיפטינג ולהפעיל זאת בתרמוסייקל באמצעות ההגדרות הבאות: 37°C למשך 30°C, 95°C למשך 5 דקות, רמפה עד 25°C ב-0.3°C/min, החזיקו ב-4°C.
2. Bbsאני מדשדש תגובה
   הערה: בחלק זה, אוליגוס gRNA טרום חישול משולבים במיקום המתאים של וקטור השרשור בשלב אחד על ידי מחזורי עיכול וקשירה לסירוגין.
   1. לדלל את תערובת התגובה 1:100 במים נטולי DNase/RNase כדי ליצור 3 ו-4 וקטורים של שרשור gRNA.
      הערה: בעת שיבוט 2 שרשרוני gRNA, שלב זה אינו נחוץ.
   2. הרכיבו את תגובת הדשדוש של BbsI על קרח, לפי ההוראות שלהלן. כלול פקד שלילי המכיל רק את הווקטור.
   3. יש להשתמש בווקטור 100 ng CRISPR-concatemer, תערובת אוליגו 10.0 μL, 1.0 μL מאגר אנזים הגבלה המכיל BSA (10x), 1.0 μL DTT (10 mM), 1.0 μL ATP (10 mM), 1.0 μL BbsI, 1.0 μL T7 ligase ו-H₂O עד לנפח כולל של 20.0 μL.
   4. ערבבו היטב על ידי פיפטינג והפעילו זאת בתרמוסייקל באמצעות ההגדרות הבאות: הפעל 50 מחזורים לשיבוט שרשור 3 ו-4 גר-רנ”א ו-25 מחזורים ל-2 שרשורי gRNA, שניהם בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות, 21°C למשך 5 דקות, החזיקו בטמפרטורה של 37°C למשך 15 דקות, ואז 4°C לנצח.
3. טיפול Exonuclease
   הערה: שלב זה מומלץ מאוד מכיוון שהוא מגביר את יעילות השיבוט על ידי הסרת עקבות של DNA ליניארי.
   1. התייחס לתגובת הדשדוש של BbsI עם אקסונוקלאז DNA (ראה טבלת חומרים) באופן הבא.
   2. קח תערובת קשירה של 11.0 μL מהשלב הקודם (2.2.3), הוסף 1.5 μL exonuclease buffer (10x), 1.5 μL ATP (10 mM), 1.0 μL DNA exonuclease, והעלה את הנפח הכולל ל 15.0 μL עם מים. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות ולאחר מכן 70°C למשך 30 דקות.
      הערה: שלב זה מסיר כל שארית DNA ליניארי בתערובת ובכך מגביר את יעילות השיבוט.
   3. השתמש 2 μL של תערובת התגובה לטרנספורמציה לחיידקי E. coli מוכשרים כימית על ידי הלם חום.
      הערה: לחלופין, ניתן לאחסן את התגובה עד שבוע ב -20 ° C.

3. טרנספקציה של אורגנואידים במעיים על ידי אלקטרופורציה

הערה: שים לב כי הליך זה מבוסס על הפרוטוקול שפורסם על ידי Fujii et al. בשנת 2015, עם התאמה לתרביות אורגנואידים במעי דק של עכבר.

1. טרום אלקטרופורציה
   הערה: חלק זה מתאר כיצד להכין את אורגנואידי המעי של העכבר לפני אלקטרופורציה על ידי הסרת כל האנטיביוטיקות והמדיה המותנית ממדיום התרבית שלהם. זה ימנע השפעות רעילות אפשריות במהלך electroporation.
   1. ביום 0 של הליך הטרנספקציה, לפצל אורגנואידים ביחס של 1:2.
      הערה: ניתן להשיג תרביות אורגנואידים במעיים על ידי ביצוע בידוד קריפטה על פי פרוטוקולים שנקבעו בעבר. עיין בטבלה 2 עבור כל הרכבי המדיה.
      1. בעת פיצול אורגנואידים להתחשמלות, זרעו לפחות 6 בארות של צלחת 48 בארות לכל טרנספקציה.
      2. זרעו את האורגנואידים בטיפות מטריצה של 20 μL מרתף וגדלו אותם במדיום WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + R-spondin + Nicotinamide) ב 37 °C, 5% CO₂ באינקובטור לח (כפי שתואר קודם לכן).
   2. ביום השני, יש להחליף את המדיום על-ידי החלפת WENR+Nic ב-250 μL של EN (EGF + Noggin) + CHIR99021 (מעכב גליקוגן סינתאז קינאז-3) + Y-27632 (מעכב ROCK), ללא אנטיביוטיקה (ראה טבלה 2).
      הערה: בכל השלבים, כמות המדיום המתווספת לכל באר של צלחת 48 בארות היא 250 μL.
   3. ביום השלישי, שנה את מדיום האורגנואיד ל- EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1.25% v/v Dimethyl sulfoxide (DMSO), ללא אנטיביוטיקה.
2. הכנת התאים
   הערה: כאן אנו מתארים כיצד לפרק אורגנואידים לצברי תאים קטנים על ידי דיסוציאציה מכנית וכימית. צעדים אלה הם קריטיים להצלחת ההליך.
   1. ביום 4, לשבש את כיפות מטריצת המרתף באמצעות קצה פיפטה 1 מ”ל ולהעביר אורגנואידים לצינור 1.5 מ”ל. תכולת בריכה של ארבע בארות של צלחת 48 בארות לתוך צינור.
   2. פירוק מכני של אורגנואידים לשברים קטנים על ידי פיפטציה מעלה ומטה עם פיפטה P200 בערך 200 פעמים. צנטריפוגה בטמפרטורת החדר, 5 דקות ב 600 x גרם.
   3. הסר את התווך והשהה מחדש את הגלולה ב -1 מ”ל של פרוטאז רקומביננטי בדרגת תרבית תאים (ראה טבלת חומרים). יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות לכל היותר ולאחר מכן לבדוק טיפה של 50-μL של דגימה תחת מיקרוסקופ אור הפוך עם מטרה 4x.
      הערה: צבירים של 10-15 תאים רצויים, שכן זה מגביר את הישרדות התאים לאחר אלקטרופורציה.
   4. העבירו את תרחיף התא לצינור 15 מ”ל בעל קשירה נמוכה ועצרו את הדיסוציאציה על ידי הוספת 9 מ”ל של תווך בסיסי ללא אנטיביוטיקה (ראה טבלה 2). צנטריפוגה בטמפרטורת החדר, 5 דקות ב 600 x גרם, ולאחר מכן להשליך את supernatant ולהשהות מחדש את הגלולה ב 1 מ”ל של מדיום סרום מופחת (ראה טבלה של חומרים).
   5. ספור את מספר התאים עם תא Bürker והשתמש במינימום של 1 x 10⁵ תאים לכל תגובת אלקטרופורציה. הוסף 9 מ”ל מדיום סרום מופחת לצינור 15 מ”ל וצנטריפוגה בטמפרטורת החדר, 3 דקות ב 400 x גרם.
3. Electroporation
   הערה: הסעיפים הבאים מספקים הוראות כיצד לבצע אלקטרופורציה ולגרום לאורגנואידים להתאושש לאחר מכן.
   1. הסר את כל הסופרנאטנט והשהה מחדש את הגלולה בתמיסת אלקטרופורציה (ראה טבלת חומרים). הוסף כמות כוללת של 10 מיקרוגרם DNA לתרחיף התא והוסף תמיסת אלקטרופורציה לנפח סופי של 100 μL ושמור את תערובת התא-דנ”א על קרח. השתמש בווקטורים של CRISPR-concatamer בשילוב עם פלסמיד ביטוי Cas9 (לדוגמה, Addgene #41815) ביחס של 1:1.
      הערה: הנפח הכולל של הדנ”א שנוסף צריך להיות קטן או שווה ל-10% מנפח התגובה הכולל.
   2. כלול תערובת טרנספקציה נפרדת המכילה פלסמיד GFP כדי להעריך את יעילות הטרנספקציה (לדוגמה, pCMV-GFP, Addgene #11153, או כל פלסמיד גנרי המבטא GFP).
   3. הוסיפו את תערובת הדנ”א התאית לקובט האלקטרופורציה והניחו אותה בתא האלקטרופורטור. מדוד את העכבה על ידי לחיצה על הכפתור המתאים באלקטרופורטור וודא שהוא 0.030-0.055 kΩ. בצע אלקטרופורציה בהתאם להגדרות המוצגות בטבלה 3.
      הערה: אם ערך העכבה חורג מהטווח המותר, התאם את נפח התמיסה בקובט.
   4. הוסף 400 μL של חיץ אלקטרופורציה + Y-27632 לקובט ולאחר מכן להעביר הכל לצינור 1.5 מ”ל. לדגור בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות כדי לאפשר לתאים להתאושש ולאחר מכן לסובב אותם בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות ב 400 x גרם.
   5. הסר את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 20 μL / באר של מטריצת מרתף. זרעו כ 1 x 104 עד 1 x 105 תאים לכל באר בצלחת 48 באר ולהוסיף EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1.25% v/v DMSO בינוני. לדגור ב 37 °C (77 °F).
   6. ביום 5, שנו את התווך ל-EN + CHIR99021 + Y-27632, ובדקו את יעילות הטרנספקציה על-ידי התבוננות בביטוי GFP (איור 2). שמור על אורגנואידים בטמפרטורה של 37°C ורענן את EN + CHIR99021 + Y-27632 בינוני לאחר יומיים.
   7. ביום 9, שנה את המדיום ל- WENR + Nic + Y-27632 ודגור ב- 37 ° C.
      הערה: Y-27632 ניתן להסיר לאחר 7-10 ימים (בימים 16-19).

	קלטת 1	קלטת 2	קלטת 3	קלטת 4
רצף (5′-3′)	CACCGG[gRNA1]GT	ACCGG[gRNA2]G	CCGG[gRNA3]	ACACCGG[gRNA4]GTT
רצף (5′-3′)	TAAAAC[RC-gRNA1]CC	AAAAC[RC-gRNA2]C	AAAC[RC-gRNA3]	CTAAAAC[RC-gRNA4]CCG

טבלה 1: תליה עבור כל קלטת של וקטור שרשור CRISPR.

‘

מדיום בסיסי		הערות
יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך 4 שבועות
מדיום תרבית תאים	500 מ”ל	ראה טבלת חומרים
ל-גלוטמין	100x 5 מ”ל
סוכן חציצה 1 מ	5 מ”ל	ראה טבלת חומרים
פניצילין סטרפטומיצין	100x 5 מ”ל
WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + Rspondin + Nicotinamide)
יש לאחסן ב-4°C למשך שבועיים
מדיום בסיסי	עד 50 מ”ל
תוסף תזונה ללא סרום תאי עצב (50x)	1 מ”ל	ראה טבלת חומרים
תוסף תזונה ללא סרום תאי עצב (100x)	500 μL	ראה טבלת חומרים
n-אצטיל-ציסטאין (500 מילימול)	125 מיקרוליטר
עכבר EGF (100 מיקרוגרם/מ”ל)	25 מיקרוליטר
Noggin עכבר (100 מיקרוגרם/מ”ל)	50 מיקרוליטר
מדיום מותנה R-ספונדין	5 מ”ל
מדיום מותנה Wnt3a	25 מ”ל
ניקוטינאמיד (1 מטר)	250 מיקרוליטר
EN + CHIR + Y-27632 (EGF + Noggin + CHIR + Y-27632)
יש לאחסן ב-4°C למשך שבועיים
בינוני בסיסי עם סטרפטומיצין פניצילין	עד 20 מ”ל
תוסף תזונה ללא סרום תאי עצב (50x)	400 מיקרוליטר	ראה טבלת חומרים
תוסף תזונה ללא סרום תאי עצב (100x)	200 מיקרוליטר	ראה טבלת חומרים
n-אצטיל-ציסטאין (500 מילימול)	50 מיקרוליטר
עכבר EGF (100 מיקרוגרם/מ”ל)	10 מיקרוליטר
Noggin עכבר (100 מיקרוגרם/מ”ל)	20 מיקרוליטר
Y-27632 (10 מיקרומטר)	20 מיקרוליטר
CHIR99021 (8 מיקרומטר)	10 מיקרוליטר
EN (EGF + Noggin)
יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך 4 שבועות
מדיום בסיסי	עד 50 מ”ל
תוסף תזונה ללא סרום תאי עצב (50x)	1 מ”ל	ראה טבלת חומרים
תוסף תזונה ללא סרום תאי עצב (100x)	500 μL	ראה טבלת חומרים
n-אצטיל-ציסטאין (500 מילימול)	125 מיקרוליטר
עכבר EGF (100 מיקרוגרם/מ”ל)	25 מיקרוליטר
Noggin עכבר (100 מיקרוגרם/מ”ל)	50 מיקרוליטר

טבלה 2: הרכב מדיה אורגנואידית.

	דופק נקבוב	דופק העברה
מתח	175V	20V
אורך פולס	5 מטר/שניה	50msec
מרווח דופק	50msec	50msec
מספר פעימות	2	5
קצב ריקבון	10%	40%
קוטביות	+	+/-

טבלה 3: הגדרות אלקטרופורציה.

Representative Results

Materials

Optimized CRISPR Design Tool 	Feng Zhang group 		CRISPR gRNA design tool; http://crispr.mit.edu/
Webcutter 2.0 			restriction mapping tool; http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/
T4 PNK (Polynucleotide Kinase) 	New England Biolabs 	M0201L
T4 DNA ligase buffer 	New England Biolabs 	M0202S
T7 DNA Ligase 	New England Biolabs	 M0318L
DTT (dithiothreitol) 	Promega 	P1171
ATP (adenosine triphosphate) 	New England Biolabs 	P0756S
FastDigest BbsI (BpiI) 	Thermo Fisher 	FD1014
Tango buffer (BSA-containing restriction enzyme buffer)	Thermo Fisher 	BY5
BglII 	New England Biolabs 	R0144
EcoRI 	New England Biolabs 	R0101
Plasmid-safe exonuclease 	Cambio 	E3101K
Thermal cycler 	Applied biosystems 	4359659
10G competent E. coli bacteria 	Cambridge Bioscience 	60108-1
Advanced DMEM/F12(cell culture medium)	Invitrogen 	12634-034
Glutamax (L-Glutamine) 	100x Invitrogen 	35050-068
HEPES 1 M (buffering agent) 	Invitrogen 	15630-056
Penicillin-streptomycin 100x 	Invitrogen 	15140-122
B27 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 50x	Invitrogen 	17504-044
N2 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 100x	Invitrogen 	17502-048
n-Acetylcysteine 500 mM 	Sigma-Aldrich 	A9165-5G
Mouse EGF 500 μg/mL 	Invitrogen Biosource 	PMG8043
Mouse Noggin 100 μg/mL 	Peprotech	 250-38
Nicotinamide 1 M 	Sigma 	N0636
R-Spondin conditioned medium 	n.a. 	n.a. 	Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013
Wnt conditioned medium	n.a. 	n.a. 	Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2014
Y-27632 10 μM 	Sigma-Aldrich 	Y0503-1MG
Standard BD Matrigel matrix 	BD Biosciences	356231
48-well Plate 	Greiner Bio One 	677980
CHIR99021 	Sigma-Aldrich 	A3734-1MG
IWP-2 	Cell Guidance Systems 	SM39-10
TrypLE (recombinant protease)	 Invitrogen 	12605-010
Opti-MEM (reduced serum medium)	Life technologies	 51985-034
Electroporation Cuvettes 2 mm gap 	NepaGene 	EC-002S
Low binding 15 mL tubes 	Sigma-Aldrich 	CLS430791
Bürker’s chamber 	Sigma-Aldrich	 BR719520-1EA
NEPA21 Super Electroporator 	NepaGene 	contact supplier
Protein LoBind tubes low binding	Thermo Fisher 	10708704
BTXpress electroporation buffer 	Harvard Apparatus 	45-0805
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	 AppliChem	 A3672