A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Abstract

מקור: Jia, Z. et al., A 5-mC Dot Blot Assay המכמת את רמת המתילציה של DNA של התמיינות כונדרוציטים במבחנה.J. Vis. Exp.(2017)

סרטון זה מתאר את הטכניקה של כתם נקודה כדי לקבוע את רמת המתילציה של DNA בכונדרוציטים אנושיים במבחנה באמצעות כתם של דגימות DNA על קרום ניילון וההדמיה שלאחר מכן באמצעות נוגדנים חד שבטיים. זה עוזר לקבוע את הפנוטיפ של כונדרוציטים בשלבים שונים בתרבית.

Protocol

1. איסוף רקמות סחוס מפרקי אנושי ותרבית כונדרוציטים

1. הכנת חומרים
   1. הכינו את מדיום הנשר המעובד (DMEM) של Dulbecco בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין. הכינו 1 מ”ג/מ”ל collagenase II, 0.25% טריפסין-EDTA, מלח חוצץ פוספט (PBS), ומסננת תאים (40 מיקרומטר ניילון).
2. איסוף רקמת סחוס מפרקי אנושי
   1. בידוד הסחוס המפרקי ממפרקי הברך של מטופלים תורמים לאחר טראומה. קבל הסכמה מדעת מכל המשתתפים.
   2. חותכים את הסחוס לקוביות 1-2 מ”מ³ חתיכות באמצעות אזמל סטרילי ומעכלים כונדרוציטים מהסחוס הטחון עם 1 מ”ג/מ”ל collagenase II ב-DMEM ב-37°C למשך 12-16 שעות.
   3. סנן את תרחיף התאים שנוצר דרך מסננת תאים (40 מיקרומטר) ושטוף פעמיים עם PBS.
   4. ספירת תאים עם המוציטומטר וזרעים בצפיפות של 20,000-30,000 תאים לסמ”ק² ב-DMEM בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין.
   5. תרבות באינקובטור ב 37 °C (77 °F).
3. הרחבת כונדרוציטים חד-שכבתיים
   1. קצרו תאים תת-משתלבים באמצעות 0.25% טריפסין-EDTA וצלחו מחדש בצפיפות של 6,600 תאים לסמ”ק². שנה את המדיום פעמיים בשבוע.
   2. תרבית כונדרוציטים בחד-שכבות עד שישה מעברים והערכה במעברים 1, 2, 3, 4 ו-5.

2. מיצוי DNA גנומי (gDNA)

1. לאסוף תאים ולהשהות מחדש במאגר ליזה של 500 מיקרוליטר (15 mM Tris pH 8.0, 10 mM EDTA pH 8.0, 0.5% SDS, 200 מיקרוגרם/מ”ל RNase A) לכל 10 מיליון תאים. להשהות תאים על ידי pipetting והיפוך מהיר, ולאחר מכן לדגור במשך 1 שעה ב 37 ° C.
2. מוסיפים פרוטאינאז K בריכוז של 160 מיקרוגרם/מ”ל של ליזט תאי והופכים את התערובת במרץ. לדגור 6 שעות ב 55 ° C.
3. הוסף נפח אחד של Tris pH 7.9 פנול רווי:כלורופורם:אלכוהול איזואמיל (25:24:1) לדגימה. מערבלים או מנערים את הדגימה ביד ביסודיות במשך כ-20 שניות.
4. צנטריפוגה את הדגימה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות ב 13,000 × גרם. מוציאים את הפאזה המימית העליונה ומעבירים את השכבה לצינור טרי.
5. לחלץ עם נפח שווה של כלורופורם כדי להסיר פנול ולהעביר את השלב המימי העליון לצינור טרי.
6. לזרז DNA על ידי הוספת נפח דגימה 0.1 של 3 M נתרן אצטט pH 8.0 ו 2 כרכים של 100% אתנול.
7. אחסנו את הצינור בטמפרטורה של -20°C למשך הלילה כדי לזרז את ה-gDNA.
8. צנטריפוגה את הדגימה ב 4 ° C במשך 10 דקות ב 16,000 x גרם כדי gDNA גלולה.
9. שטפו את הדגימה שלוש פעמים עם 70% אתנול, וצנטריפוגה ב-4°C למשך 2 דקות ב-13,000 x גרם.
10. מוציאים את הסופרנאטנט בזהירות ואז מייבשים באוויר. להשעות מחדש את הדנ”א ב 10 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM EDTA.

3. פרופיל מתילציה של DNA

1. השתמש בערכת מתילציה של DNA כדי לבצע את תגובת ההמרה של ביסולפיט באמצעות סך של 500 ננוגרם של הדנ”א הגנומי, על פי פרוטוקול היצרן. Elute ב 10 μL של חיץ elution (50 ng / μL).
2. בצע את פרופיל מתילציית ה- DNA באמצעות ערכה מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן.

4. ניתוח כתם נקודה

1. נטרל את הדנ”א המבודד (1 מ”ג לדגימה) ב-0.1 M NaOH למשך 10 דקות ב-95°C. נטרל את הדנ”א עם 1 M NH₄OAc על קרח, ולאחר מכן דלל פעמיים. נקודה 2 μL של DNA גנומי מדולל סדרתי על קרום N⁺.
2. כתם את הממברנה ב 80 ° C למשך 30 דקות.
3. חסום אתרי קישור נוגדנים לא ספציפיים על ידי השריית קרום N⁺ ב- 5% BSA ב- TBS-T למשך שעה אחת. השתמש בצלחת פטרי בקוטר 10 ס”מ כתא תגובה בטמפרטורת החדר.
4. לאחר שטיפה של 5 דקות שלוש פעמים ב-TBST, יש לדגור על הממברנה עם נוגדן חד-שבטי נגד 5-מתיל-ציטוזין (5-mC) של עכבר (1:1,000) ב-TBS-T בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה.
5. שטפו את הממברנה במשך 5 דקות שלוש פעמים ב-TBS-T, ולאחר מכן דגרו עם נוגדן משני, אימונוגלובולין אנטי-עכברי מצומד HRP (IgG) (1:5,000) ב-TBS-T למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
6. שטפו את הממברנה במשך 5 דקות שלוש פעמים ב-TBS-T.
7. מוסיפים את מצע האנזים לממברנה ודגרים במשך 5-10 דקות. דמיינו את אות הנוגדנים המשני באמצעות ערכת כימילומינסנציה בהתאם להוראות היצרן.

Materials

<strong>Reagents</strong>
DMEM&nbsp;&nbsp;	Gibco Inc.	11965&ndash;092	Warm in 37 &deg;C water bath before use
Phosphate-Buffered Saline(PBS)	HyClone Inc.	SH30256.01B	D-PBS, free of&nbsp;Ca2+/Mg2+
FBS	Gibco Inc.	10099-141
0.25%Trypsin/EDTA	Gibco Inc.	25200-056
1%Penicillin-Streptomycin	Gibco Inc.	15140-122
Chloroform	Mallinckrodt	4440
Isoamyl Alcohol	Sigma	I-3643
Phenol	Gibco BRL	15513-039
Proteinase K	Gibco BRL	24568-2
TAE buffer&nbsp;	Bio Whittaker	16-011V
Distilled Water	Gibco BRL	15230-170
1 M Tris-HCl	Biosharp Inc.	BL514A
Tween20	Biotopped Inc.	C58H114O26
BSA	Proliant Inc.	68700
Collagenase, Type II	Sigma-Aldrich	C6885
<strong>Equipment</strong>
Cell Strainer (40&mu;m nylon)	FALCON Inc.	352340
Hemocytometer	ISOLAB Inc.	075.03.001
Falcon 100 mm&nbsp; dish	Corning	353003
Centrifuge Tubes	TPP AG	91050	Gamma-sterilized
High-speed centrifuge	Eppendorf	5804R
ThermoMixer	MIULAB	MTH-100
Carbon dioxide cell incubator	Thermo scientific	3111
Chemi-imaging Analyse System	UVITEC Cambridge	ALLIANCE