בדיקת כתם מערבי Chemiluminescent לעיבוד חלבונים

Published: May 31, 2023
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Abstract

מקור: Hillert-Richter, L. K. et al., מדידת הרכב של CD95 Death-Inducing Signaling Complex ועיבוד של Procaspase-8 במתחם זה. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מתאר את הכתמים המערביים מבוססי הכימילומינסנציה של ליזטים מדוכאי חיסון. הטכניקה מסייעת לקבוע עיבוד והפעלה של חלבונים. האות הכימילומינסנטי שזוהה פרופורציונלי לרמת עיבוד החלבון במהלך הפעלתו.

Protocol

ניסויי תאי T בוצעו על פי ההסכם האתי 42502-2-1273 Uni MD.

1. הכנת תאים לניסוי

הערה: מספר התאים הממוצע עבור משקעים חיסוניים אלה הוא 1 × 107. יש לזרוע תאים דבקים יום אחד לפני הניסוי, כך שיהיו 1 × 107 תאים ביום הניסוי.

  1. הכנת תאים דבקים לניסוי
    1. זרעים 5-8 × 106 תאים דבקים ב 20 מ”ל של מדיום (ראה טבלת החומרים להרכב) לכל מצב בכלים של 14.5 ס”מ יום לפני תחילת הניסוי.
    2. ביום הניסוי, ודא כי התאים הם 80-90% קולחים ודבקים במנה. השליכו את המדיום והוסיפו מדיום טרי לתאים הדבקים.
  2. הכנת תאי השעיה לניסוי
    1. מניחים בזהירות 1 × 107 תאי תרחיף ב 10 מ”ל של מדיום תרבית (ראה טבלת החומרים להרכב) לכל מצב בכלים של 14.5 ס”מ מיד לפני תחילת הניסוי.
    2. אם אתה משתמש בתאים ראשוניים, בודד תאי T ראשוניים בהתאם להליך שתואר לעיל. יש לטפל בתאי T ראשוניים עם פיטוהמגלוטינין של 1 מיקרוגרם/מ”ל למשך 24 שעות, ולאחר מכן טיפול של 25 U/mL IL2 למשך 6 ימים.
    3. הניחו בזהירות 1 × 108 תאי T ראשוניים ב-10 מ”ל של מדיום תרבית (ראו טבלת חומרים להרכב) לכל מצב בצלחות של 14.5 ס”מ מיד לפני תחילת הניסוי.
      הערה: מספר גבוה יותר זה של תאי T ראשוניים מומלץ, מכיוון שתאים אלה קטנים יותר.

2. גירוי CD95L

  1. לעורר את התאים עם CD95L (מיוצר כמתואר קודם או זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים).
    הערה: ריכוז CD95L וזמן הגירוי תלויים בסוג התא. הכינו תנאי גירוי אחד פעמיים כדי ליצור דגימת ‘בקרת חרוזים’ במקביל.
    1. לעורר תאים דבקים עם הריכוז הנבחר של CD95L. החזיקו את הצלחת בזווית והכניסו את הליגנד לתווך מבלי לגעת בתאים הדבקים.
    2. לעורר תאי השעיה עם CD95L על ידי צנרת תמיסת הליגנד לתוך תרחיף התא.

3. קציר תאים וליזיס

  1. מניחים את צלחות התא על קרח.
    הערה: אין להשליך את המדיום. תאים גוססים צפים בתווך וחשובים לניתוח.
  2. הוסף 10 מ”ל של מלח חוצץ פוספט קר (PBS) לתרחיף התא וגרדו את התאים המחוברים מהצלחת. לאסוף את השעיית התא בצינור 50 מ”ל.
  3. שטפו את צלחת התא עם 10 מ”ל של PBS קר פעמיים והניחו את תמיסת השטיפה באותו צינור 50 מ”ל. צנטריפוגה את תרחיף התא ב 500 × גרם במשך 5 דקות, 4 ° C.
  4. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את גלולת התא עם 1 מ”ל של PBS קר. העבר את תרחיף התא לתוך צינור 1.5 מ”ל.
  5. צנטריפוגה את תרחיף התא ב 500 × גרם במשך 5 דקות, 4 ° C. להשליך את supernatant ו resuspend את כדור התא עם 1 מ”ל של PBS קר.
  6. צנטריפוגה את תרחיף התא ב 500 × גרם למשך 5 דקות, 4 ° C. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את גלולת התא עם 1 מ”ל של חיץ ליזיס (המכיל קוקטייל מעכב פרוטאז 4%). דוגרים עליו במשך 30 דקות על קרח.
  7. צנטריפוגה את הליזט במהירות מרבית (~ 17,000 × גרם) למשך 15 דקות, 4 ° C.
  8. מעבירים את הסופרנאטנט (ליזט) לצינור נקי. השליכו את הכדור. קח 50 μL של lysate בצינור אחר. לנתח את ריכוז החלבון על ידי בדיקת ברדפורד ולקחת את כמות הליזט המתאים ל 25 מיקרוגרם של חלבון בבקבוקון. הוסף מאגר העמסה (ראה טבלת חומרים להרכב) לבקבוקון. אחסנו אותו בטמפרטורה של -20°C כבקרת ליזט.

4. משקעים חיסוניים (IP)

  1. הוסף 2 μL של נוגדנים anti-APO-1 ו 10 μL של חלבון A חרוזי sepharose (מוכן לפי המלצת היצרן) לליזט. הוסף רק 10 μL של החרוזים לצינור נפרד המכיל ליזט (דגימה מגורה) כדי ליצור ‘בקרת חרוזים’
    הערה: השתמש קצוות פיפט עם פתחים רחבים או על ידי חיתוך הקצוות או קניית טיפים מיוחדים עבור IP בעת טיפול חלבון A חרוז חרוז.
  2. לדגור על תערובת הליזט עם נוגדנים/חלבון חרוזי ספארוז עם ערבוב עדין למשך הלילה ב-4°C. צנטריפוגו את הליזטים עם נוגדנים/חלבון חרוזי ספרוז ב-500 × גרם למשך 4 דקות, 4°C. השליכו את הסופרנטנט, הוסיפו 1 מ”ל PBS קר לחרוזים, וחזרו על שלב זה לפחות שלוש פעמים.
  3. השליכו את הסופרנטנט. שואפים את החרוזים רצוי עם מזרק המילטון 50 μL.

5. כתם מערבי

  1. הוסף 20 μL של חיץ העמסה 4x (ראה טבלת החומרים להרכב) לחרוזים וחמם ב 95 ° C למשך 10 דקות. חממו את פקדי הליזט ב 95 °C למשך 5 דקות.
  2. טען את הליזאטים, ה- IPs ותקן חלבון על ג’ל 12.5% נתרן דודציל סולפט (SDS) (ראה טבלת החומרים להכנת הג’ל) והפעל במתח קבוע של 80 V.
  3. העבר את החלבונים מג’ל SDS לקרום ניטרוצלולוז.
    הערה: כאן, הטכניקה היבשה למחצה, המותאמת לחלבונים המעניינים, שימשה להעברה במשך 12 דקות (25 V; 2.5 A = קבוע). משרים את קרום הניטרוצלולוז ושתי ערימות העברה בגודל זעיר בחיץ אלקטרופורזה (ראו את טבלת החומרים להרכב, מכינים לפי הוראות היצרן) למשך מספר דקות לפני ההדבקה המערבית.
  4. מניחים את הממברנה הכתם בקופסה וחוסמים אותה למשך שעה בתמיסת חסימה (0.1% טווין-20 ב-PBS (PBST) + 5% חלב). לדגור על הממברנה עם הפתרון החוסם תחת תסיסה עדינה.
  5. שטפו את הממברנה שלוש פעמים עם PBST במשך 5 דקות כל כביסה.

6. זיהוי כתמים מערביים

  1. הוסף את הנוגדן הראשוני הראשון בדילול המצוין (ראה טבלת חומרים) לממברנה ודגר עליו למשך הלילה ב -4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה.
  2. שטפו את הממברנה שלוש פעמים עם PBST במשך 5 דקות כל כביסה.
  3. לדגור על הממברנה עם 20 מ”ל של נוגדן משני (מדולל 1:10,000 PBST + 5% חלב) עם ניעור עדין במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.
  4. שטפו את הממברנה שלוש פעמים עם PBST במשך 5 דקות כל כביסה.
  5. יש להשליך PBST ולהוסיף כ-1 מ”ל של מצע חזרת פרוקסידאז לממברנה.
  6. זהה את האות הכימילומינסנטי (ראה טבלת חומרים).
    הערה: זמן החשיפה ומספר התמונות שצולמו תלויים בכמות החלבון בתא ובספציפיות של הנוגדנים המשמשים. זה חייב להיות מוגדר אמפירית עבור כל נוגדן המשמש לאיתור.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

12.5% SDS gelSelf-madeFor two separating gels: 3.28 mL distilled H<sub>2</sub>O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 &micro;L 10% SDS 100 &micro;L 10% APS 7.5 &micro;L TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H<sub>2</sub>O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 &micro;L 10% SDS 25 &micro;L 10% APS 7.5 &micro;L TEMED
14.5 cm cell dishesGreiner639160
AcrylamideCarl RothA124.1
Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orificeVWR46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe)Used for pipetting beads to the lysate
Used for pipetting beads to the lysateSigma AldrichA2103Dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-APO-1 AbProvided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZOALX-805-038-C100Used only for immunoprecipitation
anti-caspase-10 AbBiozolMBL-M059-3Dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-caspase-3 AbCell signaling9662 SDilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-caspase-8 Ab C15Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZOALX-804-242-C100Dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-CD95 AbSanta Cruzsc-715Dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-c-FLIP NF6 AbProvided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZOALX-804-961-0100Dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-FADD 1C4 AbProvided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZOADI-AAM-212-EDilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-PARP AbCell signaling9542Dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
APSCarl Roth9592.3
&beta;-mercaptoethanolCarl Roth4227.2
Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450mlBio Rad500-0006Used according to manufacturer's instructions
CD95LProvided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZOALX-522-020-C005
Chemiluminescence detector Chem Doc XRS+Bio Rad
Complete Protease Inhibitor Cocktail (PIC)Sigma AldrichALX-522-020-C005Prepared according to manufacturer's instructions
DPBS (10x) w/o Ca, MgPAN BiotechP04-53500Dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge
Electrophoresis bufferSelf-made10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H<sub>2</sub>O 1:10 dilution before usage
GlycineCarl Roth3908.3
Goat Anti-Mouse IgG1 HRPSouthernBiotech&nbsp;1070-05Dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Mouse IgG2b HRPSouthernBiotech1090-05Dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Rabbit IgG-HRPSouthernBiotech4030-05Dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Interleukin-2 Human (hIL-2)Merckgroup/ Roche11011456001For activation of T cells
KClCarl Roth6781.2
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>Carl Roth3904.1
Loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer, 10 mLBio Rad161-0747Prepared according to manufacturer's instructions
Luminata Forte Western HRP substrateMilliporeWBLUFO500
Lysis bufferSelf-made13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O
Medium for adherent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/LPAN BiotechP04-41154Adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium
Medium for primary T cellsgibco by Life Technologie21875034Adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium
Milk powderCarl RothT145.4
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>Carl RothP030.3
NaClCarl Roth3957.2
PBSTSelf-made20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 8 g KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> Copyright &copy; 2021 JoVE Journal of Visualized Experiments jove.com Page 3 of 3 20 mL Tween-20 ad 2 L H<sub>2</sub>O dilution 1:20 before usage
PBST + 5% milkSelf-made50 g milk powder + 1 L PBST
PHAThermo Fisher ScientificR30852801For activation of T Cells
Power Pac HCBio Rad
Precision Plus Protein Standard All BlueBio Rad161-0373Use between 3-5 &micro;L
Protein A Sepharose CL-4B beadsNovodirect/ Th.GeyerGE 17-0780-01Affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions
ScraperVWR734-2602
SDSCarl Roth4360.2
ShakerHeidolph
Sodium azideCarl RothK305.1
TEMEDCarl Roth2367.3
Trans Blot Turbo mini-size transfer stacksBio Rad170-4270Used according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo 5x Transfer BufferBio Rad10026938Prepared according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membraneBio Rad170-4270Used according to manufacturer's instructions
Trans-Blot-TurboBio Rad
TrisChem Solute8,08,51,000
Triton X-100Carl Roth3051.4
Tween-20Pan Reac Appli ChemA4974,1000

Tags

Chemiluminescent Western Blot Assay for Protein Processing

Play Video

Cite This Article
Chemiluminescent Western Blot Assay for Protein Processing. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e21369, doi: (2025).

View Video