A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Abstract

מקור: Hillert-Richter, L. K. et al., מדידת הרכב של CD95 Death-Inducing Signaling Complex ועיבוד של Procaspase-8 במתחם זה. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מתאר את הכתמים המערביים מבוססי הכימילומינסנציה של ליזטים מדוכאי חיסון. הטכניקה מסייעת לקבוע עיבוד והפעלה של חלבונים. האות הכימילומינסנטי שזוהה פרופורציונלי לרמת עיבוד החלבון במהלך הפעלתו.

Protocol

ניסויי תאי T בוצעו על פי ההסכם האתי 42502-2-1273 Uni MD.

1. הכנת תאים לניסוי

הערה: מספר התאים הממוצע עבור משקעים חיסוניים אלה הוא 1 × 10⁷. יש לזרוע תאים דבקים יום אחד לפני הניסוי, כך שיהיו 1 × 10⁷ תאים ביום הניסוי.

1. הכנת תאים דבקים לניסוי
   1. זרעים 5-8 × 10⁶ תאים דבקים ב 20 מ”ל של מדיום (ראה טבלת החומרים להרכב) לכל מצב בכלים של 14.5 ס”מ יום לפני תחילת הניסוי.
   2. ביום הניסוי, ודא כי התאים הם 80-90% קולחים ודבקים במנה. השליכו את המדיום והוסיפו מדיום טרי לתאים הדבקים.
2. הכנת תאי השעיה לניסוי
   1. מניחים בזהירות 1 × 10⁷ תאי תרחיף ב 10 מ”ל של מדיום תרבית (ראה טבלת החומרים להרכב) לכל מצב בכלים של 14.5 ס”מ מיד לפני תחילת הניסוי.
   2. אם אתה משתמש בתאים ראשוניים, בודד תאי T ראשוניים בהתאם להליך שתואר לעיל. יש לטפל בתאי T ראשוניים עם פיטוהמגלוטינין של 1 מיקרוגרם/מ”ל למשך 24 שעות, ולאחר מכן טיפול של 25 U/mL IL2 למשך 6 ימים.
   3. הניחו בזהירות 1 × 10⁸ תאי T ראשוניים ב-10 מ”ל של מדיום תרבית (ראו טבלת חומרים להרכב) לכל מצב בצלחות של 14.5 ס”מ מיד לפני תחילת הניסוי.
      הערה: מספר גבוה יותר זה של תאי T ראשוניים מומלץ, מכיוון שתאים אלה קטנים יותר.

2. גירוי CD95L

1. לעורר את התאים עם CD95L (מיוצר כמתואר קודם או זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים).
   הערה: ריכוז CD95L וזמן הגירוי תלויים בסוג התא. הכינו תנאי גירוי אחד פעמיים כדי ליצור דגימת ‘בקרת חרוזים’ במקביל.
   1. לעורר תאים דבקים עם הריכוז הנבחר של CD95L. החזיקו את הצלחת בזווית והכניסו את הליגנד לתווך מבלי לגעת בתאים הדבקים.
   2. לעורר תאי השעיה עם CD95L על ידי צנרת תמיסת הליגנד לתוך תרחיף התא.

3. קציר תאים וליזיס

1. מניחים את צלחות התא על קרח.
   הערה: אין להשליך את המדיום. תאים גוססים צפים בתווך וחשובים לניתוח.
2. הוסף 10 מ”ל של מלח חוצץ פוספט קר (PBS) לתרחיף התא וגרדו את התאים המחוברים מהצלחת. לאסוף את השעיית התא בצינור 50 מ”ל.
3. שטפו את צלחת התא עם 10 מ”ל של PBS קר פעמיים והניחו את תמיסת השטיפה באותו צינור 50 מ”ל. צנטריפוגה את תרחיף התא ב 500 × גרם במשך 5 דקות, 4 ° C.
4. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את גלולת התא עם 1 מ”ל של PBS קר. העבר את תרחיף התא לתוך צינור 1.5 מ”ל.
5. צנטריפוגה את תרחיף התא ב 500 × גרם במשך 5 דקות, 4 ° C. להשליך את supernatant ו resuspend את כדור התא עם 1 מ”ל של PBS קר.
6. צנטריפוגה את תרחיף התא ב 500 × גרם למשך 5 דקות, 4 ° C. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את גלולת התא עם 1 מ”ל של חיץ ליזיס (המכיל קוקטייל מעכב פרוטאז 4%). דוגרים עליו במשך 30 דקות על קרח.
7. צנטריפוגה את הליזט במהירות מרבית (~ 17,000 × גרם) למשך 15 דקות, 4 ° C.
8. מעבירים את הסופרנאטנט (ליזט) לצינור נקי. השליכו את הכדור. קח 50 μL של lysate בצינור אחר. לנתח את ריכוז החלבון על ידי בדיקת ברדפורד ולקחת את כמות הליזט המתאים ל 25 מיקרוגרם של חלבון בבקבוקון. הוסף מאגר העמסה (ראה טבלת חומרים להרכב) לבקבוקון. אחסנו אותו בטמפרטורה של -20°C כבקרת ליזט.

4. משקעים חיסוניים (IP)

1. הוסף 2 μL של נוגדנים anti-APO-1 ו 10 μL של חלבון A חרוזי sepharose (מוכן לפי המלצת היצרן) לליזט. הוסף רק 10 μL של החרוזים לצינור נפרד המכיל ליזט (דגימה מגורה) כדי ליצור ‘בקרת חרוזים’
   הערה: השתמש קצוות פיפט עם פתחים רחבים או על ידי חיתוך הקצוות או קניית טיפים מיוחדים עבור IP בעת טיפול חלבון A חרוז חרוז.
2. לדגור על תערובת הליזט עם נוגדנים/חלבון חרוזי ספארוז עם ערבוב עדין למשך הלילה ב-4°C. צנטריפוגו את הליזטים עם נוגדנים/חלבון חרוזי ספרוז ב-500 × גרם למשך 4 דקות, 4°C. השליכו את הסופרנטנט, הוסיפו 1 מ”ל PBS קר לחרוזים, וחזרו על שלב זה לפחות שלוש פעמים.
3. השליכו את הסופרנטנט. שואפים את החרוזים רצוי עם מזרק המילטון 50 μL.

5. כתם מערבי

1. הוסף 20 μL של חיץ העמסה 4x (ראה טבלת החומרים להרכב) לחרוזים וחמם ב 95 ° C למשך 10 דקות. חממו את פקדי הליזט ב 95 °C למשך 5 דקות.
2. טען את הליזאטים, ה- IPs ותקן חלבון על ג’ל 12.5% נתרן דודציל סולפט (SDS) (ראה טבלת החומרים להכנת הג’ל) והפעל במתח קבוע של 80 V.
3. העבר את החלבונים מג’ל SDS לקרום ניטרוצלולוז.
   הערה: כאן, הטכניקה היבשה למחצה, המותאמת לחלבונים המעניינים, שימשה להעברה במשך 12 דקות (25 V; 2.5 A = קבוע). משרים את קרום הניטרוצלולוז ושתי ערימות העברה בגודל זעיר בחיץ אלקטרופורזה (ראו את טבלת החומרים להרכב, מכינים לפי הוראות היצרן) למשך מספר דקות לפני ההדבקה המערבית.
4. מניחים את הממברנה הכתם בקופסה וחוסמים אותה למשך שעה בתמיסת חסימה (0.1% טווין-20 ב-PBS (PBST) + 5% חלב). לדגור על הממברנה עם הפתרון החוסם תחת תסיסה עדינה.
5. שטפו את הממברנה שלוש פעמים עם PBST במשך 5 דקות כל כביסה.

6. זיהוי כתמים מערביים

1. הוסף את הנוגדן הראשוני הראשון בדילול המצוין (ראה טבלת חומרים) לממברנה ודגר עליו למשך הלילה ב -4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה.
2. שטפו את הממברנה שלוש פעמים עם PBST במשך 5 דקות כל כביסה.
3. לדגור על הממברנה עם 20 מ”ל של נוגדן משני (מדולל 1:10,000 PBST + 5% חלב) עם ניעור עדין במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.
4. שטפו את הממברנה שלוש פעמים עם PBST במשך 5 דקות כל כביסה.
5. יש להשליך PBST ולהוסיף כ-1 מ”ל של מצע חזרת פרוקסידאז לממברנה.
6. זהה את האות הכימילומינסנטי (ראה טבלת חומרים).
   הערה: זמן החשיפה ומספר התמונות שצולמו תלויים בכמות החלבון בתא ובספציפיות של הנוגדנים המשמשים. זה חייב להיות מוגדר אמפירית עבור כל נוגדן המשמש לאיתור.

Materials

12.5% SDS gel	Self-made		For two separating gels: 3.28 mL distilled H<sub>2</sub>O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 &micro;L 10% SDS 100 &micro;L 10% APS 7.5 &micro;L TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H<sub>2</sub>O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 &micro;L 10% SDS 25 &micro;L 10% APS 7.5 &micro;L TEMED
14.5 cm cell dishes	Greiner	639160
Acrylamide	Carl Roth	A124.1
Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orifice	VWR	46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe)	Used for pipetting beads to the lysate
Used for pipetting beads to the lysate	Sigma Aldrich	A2103	Dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-APO-1 Ab	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-805-038-C100	Used only for immunoprecipitation
anti-caspase-10 Ab	Biozol	MBL-M059-3	Dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-caspase-3 Ab	Cell signaling	9662 S	Dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-caspase-8 Ab C15	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-804-242-C100	Dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-CD95 Ab	Santa Cruz	sc-715	Dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-c-FLIP NF6 Ab	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-804-961-0100	Dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-FADD 1C4 Ab	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ADI-AAM-212-E	Dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-PARP Ab	Cell signaling	9542	Dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
APS	Carl Roth	9592.3
&beta;-mercaptoethanol	Carl Roth	4227.2
Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml	Bio Rad	500-0006	Used according to manufacturer's instructions
CD95L	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-522-020-C005
Chemiluminescence detector Chem Doc XRS+	Bio Rad
Complete Protease Inhibitor Cocktail (PIC)	Sigma Aldrich	ALX-522-020-C005	Prepared according to manufacturer's instructions
DPBS (10x) w/o Ca, Mg	PAN Biotech	P04-53500	Dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge
Electrophoresis buffer	Self-made		10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H<sub>2</sub>O 1:10 dilution before usage
Glycine	Carl Roth	3908.3
Goat Anti-Mouse IgG1 HRP	SouthernBiotech&nbsp;	1070-05	Dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Mouse IgG2b HRP	SouthernBiotech	1090-05	Dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Rabbit IgG-HRP	SouthernBiotech	4030-05	Dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Interleukin-2 Human (hIL-2)	Merckgroup/ Roche	11011456001	For activation of T cells
KCl	Carl Roth	6781.2
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	Carl Roth	3904.1
Loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer, 10 mL	Bio Rad	161-0747	Prepared according to manufacturer's instructions
Luminata Forte Western HRP substrate	Millipore	WBLUFO500
Lysis buffer	Self-made		13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O
Medium for adherent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L	PAN Biotech	P04-41154	Adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium
Medium for primary T cells	gibco by Life Technologie	21875034	Adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium
Milk powder	Carl Roth	T145.4
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	Carl Roth	P030.3
NaCl	Carl Roth	3957.2
PBST	Self-made		20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 8 g KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> Copyright &copy; 2021 JoVE Journal of Visualized Experiments jove.com Page 3 of 3 20 mL Tween-20 ad 2 L H<sub>2</sub>O dilution 1:20 before usage
PBST + 5% milk	Self-made		50 g milk powder + 1 L PBST
PHA	Thermo Fisher Scientific	R30852801	For activation of T Cells
Power Pac HC	Bio Rad
Precision Plus Protein Standard All Blue	Bio Rad	161-0373	Use between 3-5 &micro;L
Protein A Sepharose CL-4B beads	Novodirect/ Th.Geyer	GE 17-0780-01	Affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions
Scraper	VWR	734-2602
SDS	Carl Roth	4360.2
Shaker	Heidolph
Sodium azide	Carl Roth	K305.1
TEMED	Carl Roth	2367.3
Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks	Bio Rad	170-4270	Used according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer	Bio Rad	10026938	Prepared according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane	Bio Rad	170-4270	Used according to manufacturer's instructions
Trans-Blot-Turbo	Bio Rad
Tris	Chem Solute	8,08,51,000
Triton X-100	Carl Roth	3051.4
Tween-20	Pan Reac Appli Chem	A4974,1000