A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Abstract

מקור: Li, J., et al. זיהוי אירועי רקומבינציה הומולוגית בתאי גזע עובריים של עכברים באמצעות כתם דרומי ותגובת שרשרת פולימראז. J. Vis. Exp. (2018).

בסרטון זה, אנו מתארים את טכניקת הכתם הדרומי לזיהוי אירועי רקומבינציה הומולוגיים בגנום של תאי גזע עובריים של עכברים באמצעות בדיקות רדיואקטיביות. אזורי דנ”א המכילים אירועי רקומבינציה הומולוגיים מופיעים כפסים נפרדים כאשר הממברנה המכילה את הדנ”א הקשור לגשושית נחשפת לקרני רנטגן.

Protocol

1. הכנת DNA גנומי והעיכול עם אנזימי הגבלה

1. הכינו gDNA מתאי גזע עובריים (תאי ES) באמצעות ערכה מסחרית (ערכת טיהור DNA גנומי) עם שינויים קלים.
   1. הסר מדיה מתרבית תאי ES והוסף 500 μL של תמיסת גרעינים ליזיס, כולל RNaseA, ישירות לבארות כדי ליזה את התאים.
      הערה: התא lysate ניתן לאחסן ב -80 °C או לטפל מיד.
   2. פיפט למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לשכב את התאים במלואם ולהעביר אותם לצינור נקי של 1.5 מ”ל.
   3. הוסף שליש מנפח תמיסת המשקעים החלבוניים לצינור 1.5 מ”ל, מערבל במרץ במשך 20 שניות, מצנן את הדגימות על קרח במשך 5 דקות, ולאחר מכן, צנטריפוגה בכוח של 2,000 x גרם במשך 5 דקות. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור נקי אחר של 1.5 מ”ל המכיל נפח שווה של איזופרופנול; מערבבים בעדינות את התמיסה. (שימו לב שניתן לראות גדילים לבנים דמויי חוט ברגע זה.) צנטריפוגה בעוצמה של 2,000 x גרם למשך דקה אחת; לאחר מכן, השליכו את הסופר-נטנט.
   4. שטפו את כדורית ה-gDNA עם 1 מ”ל של 70% אתנול בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה בעוצמה של 2,000 x גרם למשך דקה אחת, שאפו את הסופרנאטנט בזהירות, ולאחר מכן, יבשו באוויר את גלולת ה-gDNA למשך 3 דקות.
   5. להמיס את gDNAs עם 100 μL של תמיסת התייבשות DNA, ולאחר מכן, לדגור ב 65 ° C במשך 1 שעה או ב 4 ° C בלילה.
   6. אחסנו את gDNA בטמפרטורה של 2-8°C.
2. עיכול gDNAs עם RE Dra I מתוכנן מראש. הגדר תגובת עיכול של 30-μL על ידי ערבוב 3 μL של חיץ 10x עבור Dra I, 3 μL של Dra I, 10 מיקרוגרם של gDNAs / דגימה, ו- H₂O עד 30 μL, ודגור ב 37 ° C במשך הלילה.
3. בדוק את שלמות העיכול על ידי ג’ל DNA, ניתוח 5 μL של התגובה מעוכל, ולאחר מכן, להוסיף את 3 μL של 10x DNA טוען מאגר לשלב הבא.

2. כתם דרומי

1. הקרנת כתם דרומי
   1. להפריד gDNA מעוכל על ידי אלקטרופורזה ולהעביר אותם לממברנה.
      1. הכינו ג’ל אלקטרופורזה אגרוז 1% עם אתידיום ברומיד (EB), טענו את דגימות ה-gDNA המעוכלות וסולם של 1 קילובייט, והפעילו את הג’ל במתח נמוך (30-40 וולט) למשך הלילה.
      2. הוציאו את הג’ל וצלמו עם מערכת דימות ג’ל DNA לאחר אלקטרופורזה. בדוק אם gDNA מעוכל ומופרד להציג תמונה דמוית מריחה.
      3. השרו את הג’ל במגש עם תמיסת 0.2N HCl ונערו אותו בעדינות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
      4. מעבירים את הג’ל לתמיסת דנ”א ומנערים אותו בעדינות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
      5. החליפו את הג’ל לתמיסה מנטרלת DNA ונערו אותו בעדינות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
         הערה: הג’ל נוטה להישבר לאחר שלב זה, ולכן יש לטפל בו בזהירות.
      6. השתמש במערכת העברה מהירה כלפי מטה כדי להעביר את הדנ”א מהג’ל אל הממברנה. הרכיבו את TurboBlotter ואת מחסנית הכתמים בהתאם להוראות שסופקו על ידי היצרן.
         הערה: תמיסת 10x או 20x מלוחים-נתרן ציטראט (SSC) משמשת כמאגר העברה. באופן כללי, 3 שעות של העברה מספיקה כדי להעביר 95% של gDNAs מג’ל לממברנה; עם זאת, זמן העברה ארוך יותר אינו מזיק.
      7. הוציאו את הממברנה ושטפו אותה עם 2x SSC למשך דקה אחת, ספגו את הנוזל עם רקמות, ולאחר מכן הצליבו את הדנ”א עם הממברנה באמצעות crosslinker UV.
         הערה: הממברנה ניתן לאחסן ב 4 °C (75 °F) במשך שבוע אחד.
2. תייגו את גשושיות הדנ”א ברדיואקטיביות.
   1. לטהר את פלסמידים הבדיקה באמצעות ערכת miniprep על פי הפרוטוקול שסופק על ידי היצרן.
   2. שחררו את מקטעי הדנ”א של הגשושיות מווקטור הפלסמיד על ידי עיכול EcoR I בתמיסת תגובה הכוללת 5 μL של חיץ עבור EcoR I, 2 μL של אנזים EcoR I, 20 מיקרוגרם של DNA פלסמיד, ו- H₂O עד 50 μL, למשך שעתיים.
   3. הפעל ג’ל DNA 1% להפרדת מקטעי ה- DNA של הבדיקה מהווקטור וטיהר את מקטעי ה- DNA של הגשושיות באמצעות ערכת מיצוי ג’ל DNA בהתאם לפרוטוקול שסופק על ידי היצרן.
   4. באמצעות 1 μL של תמיסת ה- DNA, למדוד את ריכוז ה- DNA של מקטעי DNA בדיקה עם ספקטרופוטומטר באורך גל של 260/280 ננומטר.
   5. הכינו 40-ng של DNA בדיקה בצינור 1.5 מ”ל עם 45 μL של חיץ TE, להרתיח במשך 3 דקות, להסתובב לזמן קצר, ולאחר מכן, להניח את הצינור(ים) על קרח במשך 2 דקות.
   6. הוסף את הדנ”א של הבדיקה שעברו דנטורציה בחום לצינור המכיל חרוזי תיוג DNA מוכנים לשימוש (-dCTP), צינור למעלה ולמטה כדי לערבב, הוסף 5 μL של [α³²P]dCTP, ולאחר מכן, לדגור ב 37 ° C במשך 15 דקות.
   7. לטהר את הגשושיות המסומנות באמצעות מיקרו-עמודות G-50 בהתאם להוראות שסופקו על ידי היצרן, ולאחר מכן, למדוד את הרדיואקטיביות עם מונה scintillation (אופציונלי).
3. הכלאה של הממברנה(ות) עם הגשושיות המסומנות.
   1. טרום הכלאה של הממברנה.
      1. חממו מראש את תמיסת ההכלאה ב-42°C למשך 30 דקות. ערבבו 20 מ”ל של תמיסת הכלאה שחוממה מראש עם 200 מיקרוגרם DNA של זרע סלמון מבושל בצינור של 50 מ”ל.
      2. מניחים את הממברנה לתוך צינור ההכלאה. הוסף את פתרון טרום ההכלאה המעורב לצינור ההכלאה. הכניסו לתנור ההכלאה (כוונו גלגול והטמפרטורה ל-42°) והניחו לקדם-הכלאה להימשך 30 דקות.
   2. הכלאה של הממברנה עם הגשושית המסומנת.
      1. הוציאו את צינור ההכלאה ושפכו את תמיסת הפרה-הכלאה לתוך צינור של 50 מ”ל; הוסיפו את הגשושית המפורקת (מחוממת ב-100°C למשך 3 דקות) משלב 2.1.2.7 לצינור זה וערבבו בעדינות.
         הערה: הפחיתו את כל הבועות הגורמות לגרימת בועות.
      2. החזירו את התמיסה המעורבת לצינור ההכלאה ובצעו את ההכלאה בטמפרטורה של 42°C למשך הלילה.
4. שטפו את הממברנה(ות) כדי להסיר בדיקות לא היברידיות.
   1. הכניסו את הממברנה למגש עם 1x SSC + 0.1% SDS ונערו בעדינות בטמפרטורה של 55-60°C למשך 10 דקות.
   2. העבירו את הממברנה למגש עם 0.5x SSC + 0.1% SDS ונערו בעדינות בטמפרטורה של 55–60°C למשך 10 דקות.
   3. בדוק את הרדיואקטיביות על הממברנה(ות) באמצעות מונה גייגר נייד כדי להחליט אם יש צורך בשטיפה שלישית.
5. לחשוף את הרדיואקטיביות על הממברנה לסרטי רנטגן.
   1. מוציאים את הנוזל מהקרום השטוף.
   2. מקפלים את הממברנה(ות) בניילון נצמד ומקבעים אותה/אותם בקסטת החשיפה.
   3. חשוף את הממברנה לשני יריעות של סרט רנטגן בחדר חשוך.
   4. הניחו את מגשיות החשיפה על -80°C למשך הלילה או יותר.
6. פתח את הסרטים כדי להמחיש את התוצאות. הערך אם שיבוט ES מתאים הוא הרצוי עם רקומבינציה ממוקדת או לא, על פי הגדלים של רצועות ה- DNA שזוהו על ידי הגשושיות.
7. הכלאה מחדש של אותו קרום עם בדיקה אחרת לאחר הפשטת הבדיקה המשומשת על פי ההליך הבא: להוציא את הקרום המשומש, לשטוף אותו 1x עם נקי H₂O, ולאחר מכן, לדגור אותו בתמיסת פסים (55% פורממיד, 2% SSPE, 1% SDS, H₂O) ב 65 ° C עם ניעור עדין במשך 1-2 שעות.

Materials

QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN	28704
DNA Denaturing Solution	VWR	351-013-131
DNA Neutralizing Solution	VWR	351-014-131
EcoR I	Thermo Scientific	ER0271
Dra I	Thermo Scientific	ER0221
ProbeQuan G-50 Micro Columns	GE Healthcare	28-9034-08
Hybrisol I Hybridization Solution	Millipore	S4040
Ready-To-Go DNA Labeling Beads (-dCTP)	VWR	27-9240-01
UltraPure SSC, 20x	Thermo Fisher	15557036
Salmon Sperm DNA Solution	Thermo Fisher	15632011
Whatman TurboBlotter Transfer System, Large Kits	Fisher Scientific	09-301-188
[α32P] dCTP	PerkinElmer	NEG013H100UC
Kodak X-Ray Film	Z&Z Medical	844 5702
QIAprep Spin Miniprep Kit	QIAGEN	27104
Nuclei Lysis Solution	Promega	A7941
Protein Precipitation Solution	Promega	A7951