כתם צפוני לזיהוי וכימות מיקרו-רנ"א ספציפי בתמצית RNA כוללת של רקמת צמח

Published: May 31, 2023
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Abstract

מקור: Tirumalai, V., et al. RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs. J. Vis. Exp. (2020)

בסרטון זה אנו מדגימים את הכתם הצפוני, טכניקת הכלאה לזיהוי וכימות מיקרו-רנ”א (miRNAs) מסך הרנ”א המופק מרקמת הצמח.

Protocol

1. אלקטרופורזה בג’ל

  1. עצור את הריצה מראש ושטוף את הבארות לפני העמסת הדגימה.
  2. מחממים את הדגימות בטמפרטורה של 98 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת ומעמיסים את הדגימות חמות לתוך הבאר באמצעות קצוות נימיים. הכניסו את החוד לתחתית הבאר כך שהמדגם יתפוס שכבה דקה אחת בבאר.
  3. טעינה מלאה של כל הדגימות. כלול העמסת סמן עשור RNA.
  4. הפעל את הג’ל ב 80 V עד צבע כחול ברומופנול פועל כמעט לחלוטין. Bromophenol blue פועל ב 10 bp בג’ל אקרילאמיד 15% דנטורציה.

2. הכנה לאלקטרו-בלוטינג

  1. חתכו את קרום N+ניילון לממדים של צלחת זכוכית ותייגו את הממברנה בפינה הימנית העליונה שלה בעיפרון HB.
  2. מניחים בעדינות את הממברנה על פני המים הסטריליים, עם הפנים לצד המסומן לכיוון פני המים. משרים מראש את הממברנה למשך 15 דקות.
  3. חותכים 4 חתיכות נייר ניקוי I למידות של כרית סיבים.
  4. הכינו את כריך הג’ל על ידי הנחת הצד האפור של הקלטת במגש נקי.
  5. הרטיבו מראש את כרית הסיבים והניחו אותה מעל הקלטת. הסירו בועות אוויר.
  6. הרטיבו מראש פיסת נייר ניקוי אחת ב-1x TBE והניחו אותה על פד הסיבים. הסר בועות אוויר על ידי גלגול פיפטה פלסטיק על הנייר. הניחו פיסת נייר ניקוי רטובה מראש והסירו בועות אוויר.
  7. מוציאים בזהירות את הג’ל מקסטת הריצה ומניחים אותו מעל מערך הכריך, כך שדגימת הרנ”א הטעונה הראשונה תהיה לכיוון ימין.
  8. טבלו בעדינות את הממברנה שהושרה מראש ב-1x TBE והניחו אותה מעל הג’ל, עם הפנים כלפי מטה לצד המסומן. יש לגלגל החוצה כדי להסיר את בועות האוויר.
  9. טובלים פיסת נייר ניקוי, מניחים אותה על הממברנה ומסירים את בועות האוויר. טובלים פיסת נייר ניקוי נוספת, מניחים אותה מעל מערך הסנדוויץ’ ומסירים בועות אוויר.
  10. השלימו את הכריך על ידי הנחת פד סיבים רטוב מראש מעל ההתקנה וסגירה חזקה של הקלטת.
  11. מקם את קלטת הטרנסבלוט במודול ומלא 1x TBE, pH 8.2, עד לסימן הניקוי.
  12. העברה ב 10 V, לילה ב 4 °C (75 °F).
  13. לאחר ההעברה, הניחו את הממברנה הלחה על דף נייר ומיד הצליבו את הרנ”א לממברנה על ידי הקרנה עם אור UV של 254 ננומטר (120,000 מיקרוג’אול לסמ”ר). ניתן לאחסן את הכתם הצולב בטמפרטורה של 4°C לצורך הכלאה נוספת.

3. הכנת בדיקה עם תווית רדיו

  1. תכננו בדיקה משלימה לחלוטין לרנ”א הקטן שאמור להתגלות.
  2. סיימו לתייג את הגשושית באמצעות ƳP32ATP (המתקבל מ-BRIT) בקצה ה-5 אינץ’ שלה על ידי שילוב הרכיבים בהתאם למתכון המופיע בטבלה 1.
  3. יש לדגור על תערובת התגובה הנ”ל בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
  4. הפרד את ƳP32ATP ללא תווית מהגשושית באמצעות עמודת Sephadex G-25 בהתאם לפרוטוקול היצרן.

4.הכלאה של הכתם

  1. מניחים את הכתם המוצלב, צד הרנ”א הפונה למעלה, בתוך בקבוק הכלאה.
  2. ערבבו במרץ את חיץ ההכלאה הרגיש במיוחד, הוסיפו 10 מ”ל ממנו ודגרו על הכתם בתוך תנור הכלאה הנשמר בטמפרטורה של 35°C, עם סיבוב.
  3. בצעו טרום הכלאה במשך 20 דקות.
  4. מוציאים את הבקבוק מהתנור ומוסיפים בעדינות את הבדיקה המסומנת למאגר ההכלאה.
  5. הכלאה של הכתם ב 35 ° C, עם סיבוב במשך 12 שעות.
  6. לאחר ההכלאה, העבירו בזהירות את פתרון ההכלאה לצינור 15 מ”ל. ניתן לאחסן תמיסה זו בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש חוזר.
  7. בצע שטיפה מהירה של הכתם במשך 2 דקות כדי להסיר פתרון היברידיזציה עודף על ידי הוספת 2x מאגר SSC בתוספת 0.5% SDS. בטל את הפתרון.
  8. דגור על הכתם עם 2x מאגר SSC בתוספת 0.5% SDS עבור 35°C, עם סיבוב במשך 30 דקות.
  9. שטפו שוב את הכתם עם מאגר SSC של 0.5x בתוספת 0.5% SDS עבור 35°C, עם סיבוב למשך 30 דקות.
  10. הניחו את הכתם בתוך מכסה הכלאה, הסירו את החיץ העודף ואטמו אותו.
  11. חשוף אותו למסך הדמיה ללא קרינה של זרחן למשך הלילה בתוך קלטת.
  12. זהה את אות ההכלאה באמצעות הדמיה ביומולקולרית ונתח את התוצאות באמצעות תוכנה מתאימה.

טבלה 1: טבלת מתכונים

חיץ ופתרון מתכון הערות
10 X TBE 0.89 מ’ חיץ טריס pH צריך להיות מוגדר ל 8.2 באמצעות חומצה אצטית
0.89 מ’ חומצה בורית
30mM EDTA
ג’ל לערבב 15% אקרילאמיד-ביסקרילאמיד סול, 19:1 תערובת ג’ל לא צריכה להכיל גבישי אוריאה
8 מ’ אוריאה
1X TBE
צבע לטעינת ג’ל 0.05% (עם רב) ברומופנול כחול יש להקפיד בעת הטיפול בפורמיד נטול יונים;
0.05 %(w/v) קסילן קסיאנול
100% דה-יוניזציה – פורממיד
תיוג של בדיקה מאגר PNK (10X, 2 מיקרוליטר) תערובת זו מכילה מולקולות רדיואקטיביות, שלב זה חייב להתבצע על ידי צוות מיומן בתוך מעבדה רדיואקטיבית
אנזים PNK (1 מיקרוליטר)
אוליגו (100 מיקרומטר, 0.1 מיקרוליטר)
ƳP32 ATP (4 μL)
Wash Buffer – I 2X SSC
0.5% (עם v/v) SDS
Wash Buffer – II 0.5X SSC
0.5% (עם v/v) SDS
Stripping Buffer – I 0.5X SSC
0.1% (עם v/v) SDS
Stripping Buffer – II 0.1X SSC
0.1% (עם v/v) SDS

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

40% Acrylamide-bisacrylamide solution Sigma A9926Chemical
Ammonium persulphate (APS)BioRad1610700Chemical
Blotting paperWhatman blotting paper I1001-125Assay
Bromophenol blueSigmaB5525-5GChemical
Capillary loading tipsBioRad2239915Plastic ware
Deionized formamideAmbionAM9342Chemical
Heating block Eppendorf5350Device
Hybond N+nylon membraneGERPN203BAssay
Hybridization bottleSigmaZ374792-1EAPlastic ware
Hybridization OvenThermo Scientific1211V79Device
N,N,N',N'- Tetramethylethylenediamine (TEMED)SigmaT7024-25mlChemical
PhosphorImagerGE- Typhoon scanner29187194Device
PhosphorImager screen and cassetteGE healthcareGE28-9564-75Device
PipettesGilson, models: P20 and P10FA10002M, FA10003MPlastic ware
Plastic pipetteFalcon357550Plastic ware
Polyacrylamide gel apparatusBioRad1658003EDUDevice
Sephadex G-25 columnGE healthcare27532501Device
Speed Vac ConcentratorThermo Scientific20-548-130Device
SpinwinTarsons1010Device
T4 Polynucleotide Kinase (PNK)NEBM0201SAssay
Transblot apparatusBioRad1703946Device
ULTRAHyb hybridization bufferAmbionAM8670Assay
UreaFischer Scientific15985Chemical
UV-crosslinkerUVPCL-1000LDevice
VortexTarsons3020Device
Water bathNEOLABD-8810Device
Xylene cyanolSigmaX4126-10GAssay

Tags

Northern Blot to Detect and Quantify Specific MicroRNA in Total RNA Extract of Plant Tissue

Play Video

Cite This Article
Northern Blot to Detect and Quantify Specific MicroRNA in Total RNA Extract of Plant Tissue. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e21371, doi: (2025).

View Video