A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Abstract

מקור: Tirumalai, V., et al. RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs. J. Vis. Exp. (2020)

בסרטון זה אנו מדגימים את הכתם הצפוני, טכניקת הכלאה לזיהוי וכימות מיקרו-רנ”א (miRNAs) מסך הרנ”א המופק מרקמת הצמח.

Protocol

1. אלקטרופורזה בג’ל

1. עצור את הריצה מראש ושטוף את הבארות לפני העמסת הדגימה.
2. מחממים את הדגימות בטמפרטורה של 98 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת ומעמיסים את הדגימות חמות לתוך הבאר באמצעות קצוות נימיים. הכניסו את החוד לתחתית הבאר כך שהמדגם יתפוס שכבה דקה אחת בבאר.
3. טעינה מלאה של כל הדגימות. כלול העמסת סמן עשור RNA.
4. הפעל את הג’ל ב 80 V עד צבע כחול ברומופנול פועל כמעט לחלוטין. Bromophenol blue פועל ב 10 bp בג’ל אקרילאמיד 15% דנטורציה.

2. הכנה לאלקטרו-בלוטינג

1. חתכו את קרום N+ניילון לממדים של צלחת זכוכית ותייגו את הממברנה בפינה הימנית העליונה שלה בעיפרון HB.
2. מניחים בעדינות את הממברנה על פני המים הסטריליים, עם הפנים לצד המסומן לכיוון פני המים. משרים מראש את הממברנה למשך 15 דקות.
3. חותכים 4 חתיכות נייר ניקוי I למידות של כרית סיבים.
4. הכינו את כריך הג’ל על ידי הנחת הצד האפור של הקלטת במגש נקי.
5. הרטיבו מראש את כרית הסיבים והניחו אותה מעל הקלטת. הסירו בועות אוויר.
6. הרטיבו מראש פיסת נייר ניקוי אחת ב-1x TBE והניחו אותה על פד הסיבים. הסר בועות אוויר על ידי גלגול פיפטה פלסטיק על הנייר. הניחו פיסת נייר ניקוי רטובה מראש והסירו בועות אוויר.
7. מוציאים בזהירות את הג’ל מקסטת הריצה ומניחים אותו מעל מערך הכריך, כך שדגימת הרנ”א הטעונה הראשונה תהיה לכיוון ימין.
8. טבלו בעדינות את הממברנה שהושרה מראש ב-1x TBE והניחו אותה מעל הג’ל, עם הפנים כלפי מטה לצד המסומן. יש לגלגל החוצה כדי להסיר את בועות האוויר.
9. טובלים פיסת נייר ניקוי, מניחים אותה על הממברנה ומסירים את בועות האוויר. טובלים פיסת נייר ניקוי נוספת, מניחים אותה מעל מערך הסנדוויץ’ ומסירים בועות אוויר.
10. השלימו את הכריך על ידי הנחת פד סיבים רטוב מראש מעל ההתקנה וסגירה חזקה של הקלטת.
11. מקם את קלטת הטרנסבלוט במודול ומלא 1x TBE, pH 8.2, עד לסימן הניקוי.
12. העברה ב 10 V, לילה ב 4 °C (75 °F).
13. לאחר ההעברה, הניחו את הממברנה הלחה על דף נייר ומיד הצליבו את הרנ”א לממברנה על ידי הקרנה עם אור UV של 254 ננומטר (120,000 מיקרוג’אול לסמ”ר). ניתן לאחסן את הכתם הצולב בטמפרטורה של 4°C לצורך הכלאה נוספת.

3. הכנת בדיקה עם תווית רדיו

1. תכננו בדיקה משלימה לחלוטין לרנ”א הקטן שאמור להתגלות.
2. סיימו לתייג את הגשושית באמצעות ƳP32ATP (המתקבל מ-BRIT) בקצה ה-5 אינץ’ שלה על ידי שילוב הרכיבים בהתאם למתכון המופיע בטבלה 1.
3. יש לדגור על תערובת התגובה הנ”ל בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
4. הפרד את ƳP32ATP ללא תווית מהגשושית באמצעות עמודת Sephadex G-25 בהתאם לפרוטוקול היצרן.

4.הכלאה של הכתם

1. מניחים את הכתם המוצלב, צד הרנ”א הפונה למעלה, בתוך בקבוק הכלאה.
2. ערבבו במרץ את חיץ ההכלאה הרגיש במיוחד, הוסיפו 10 מ”ל ממנו ודגרו על הכתם בתוך תנור הכלאה הנשמר בטמפרטורה של 35°C, עם סיבוב.
3. בצעו טרום הכלאה במשך 20 דקות.
4. מוציאים את הבקבוק מהתנור ומוסיפים בעדינות את הבדיקה המסומנת למאגר ההכלאה.
5. הכלאה של הכתם ב 35 ° C, עם סיבוב במשך 12 שעות.
6. לאחר ההכלאה, העבירו בזהירות את פתרון ההכלאה לצינור 15 מ”ל. ניתן לאחסן תמיסה זו בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש חוזר.
7. בצע שטיפה מהירה של הכתם במשך 2 דקות כדי להסיר פתרון היברידיזציה עודף על ידי הוספת 2x מאגר SSC בתוספת 0.5% SDS. בטל את הפתרון.
8. דגור על הכתם עם 2x מאגר SSC בתוספת 0.5% SDS עבור 35°C, עם סיבוב במשך 30 דקות.
9. שטפו שוב את הכתם עם מאגר SSC של 0.5x בתוספת 0.5% SDS עבור 35°C, עם סיבוב למשך 30 דקות.
10. הניחו את הכתם בתוך מכסה הכלאה, הסירו את החיץ העודף ואטמו אותו.
11. חשוף אותו למסך הדמיה ללא קרינה של זרחן למשך הלילה בתוך קלטת.
12. זהה את אות ההכלאה באמצעות הדמיה ביומולקולרית ונתח את התוצאות באמצעות תוכנה מתאימה.

טבלה 1: טבלת מתכונים

חיץ ופתרון	מתכון	הערות
10 X TBE	0.89 מ’ חיץ טריס	pH צריך להיות מוגדר ל 8.2 באמצעות חומצה אצטית
	0.89 מ’ חומצה בורית
	30mM EDTA
ג’ל לערבב	15% אקרילאמיד-ביסקרילאמיד סול, 19:1	תערובת ג’ל לא צריכה להכיל גבישי אוריאה
	8 מ’ אוריאה
	1X TBE
צבע לטעינת ג’ל	0.05% (עם רב) ברומופנול כחול	יש להקפיד בעת הטיפול בפורמיד נטול יונים;
	0.05 %(w/v) קסילן קסיאנול
	100% דה-יוניזציה – פורממיד
תיוג של בדיקה	מאגר PNK (10X, 2 מיקרוליטר)	תערובת זו מכילה מולקולות רדיואקטיביות, שלב זה חייב להתבצע על ידי צוות מיומן בתוך מעבדה רדיואקטיבית
	אנזים PNK (1 מיקרוליטר)
	אוליגו (100 מיקרומטר, 0.1 מיקרוליטר)
	ƳP32 ATP (4 μL)
Wash Buffer – I	2X SSC
	0.5% (עם v/v) SDS
Wash Buffer – II	0.5X SSC
	0.5% (עם v/v) SDS
Stripping Buffer – I	0.5X SSC
	0.1% (עם v/v) SDS
Stripping Buffer – II	0.1X SSC
	0.1% (עם v/v) SDS

Materials

40% Acrylamide-bisacrylamide solution 	Sigma 	A9926	Chemical
Ammonium persulphate (APS)	BioRad	1610700	Chemical
Blotting paper	Whatman blotting paper I	1001-125	Assay
Bromophenol blue	Sigma	B5525-5G	Chemical
Capillary loading tips	BioRad	2239915	Plastic ware
Deionized formamide	Ambion	AM9342	Chemical
Heating block 	Eppendorf	5350	Device
Hybond N+nylon membrane	GE	RPN203B	Assay
Hybridization bottle	Sigma	Z374792-1EA	Plastic ware
Hybridization Oven	Thermo Scientific	1211V79	Device
N,N,N',N'- Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma	T7024-25ml	Chemical
PhosphorImager	GE- Typhoon scanner	29187194	Device
PhosphorImager screen and cassette	GE healthcare	GE28-9564-75	Device
Pipettes	Gilson, models: P20 and P10	FA10002M, FA10003M	Plastic ware
Plastic pipette	Falcon	357550	Plastic ware
Polyacrylamide gel apparatus	BioRad	1658003EDU	Device
Sephadex G-25 column	GE healthcare	27532501	Device
Speed Vac Concentrator	Thermo Scientific	20-548-130	Device
Spinwin	Tarsons	1010	Device
T4 Polynucleotide Kinase (PNK)	NEB	M0201S	Assay
Transblot apparatus	BioRad	1703946	Device
ULTRAHyb hybridization buffer	Ambion	AM8670	Assay
Urea	Fischer Scientific	15985	Chemical
UV-crosslinker	UVP	CL-1000L	Device
Vortex	Tarsons	3020	Device
Water bath	NEOLAB	D-8810	Device
Xylene cyanol	Sigma	X4126-10G	Assay