מקור: Tirumalai, V., et al. RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs. J. Vis. Exp. (2020)
בסרטון זה אנו מדגימים את הכתם הצפוני, טכניקת הכלאה לזיהוי וכימות מיקרו-רנ”א (miRNAs) מסך הרנ”א המופק מרקמת הצמח.
1. אלקטרופורזה בג’ל
2. הכנה לאלקטרו-בלוטינג
3. הכנת בדיקה עם תווית רדיו
4.הכלאה של הכתם
טבלה 1: טבלת מתכונים
חיץ ופתרון | מתכון | הערות |
10 X TBE | 0.89 מ’ חיץ טריס | pH צריך להיות מוגדר ל 8.2 באמצעות חומצה אצטית |
0.89 מ’ חומצה בורית | ||
30mM EDTA | ||
ג’ל לערבב | 15% אקרילאמיד-ביסקרילאמיד סול, 19:1 | תערובת ג’ל לא צריכה להכיל גבישי אוריאה |
8 מ’ אוריאה | ||
1X TBE | ||
צבע לטעינת ג’ל | 0.05% (עם רב) ברומופנול כחול | יש להקפיד בעת הטיפול בפורמיד נטול יונים; |
0.05 %(w/v) קסילן קסיאנול | ||
100% דה-יוניזציה – פורממיד | ||
תיוג של בדיקה | מאגר PNK (10X, 2 מיקרוליטר) | תערובת זו מכילה מולקולות רדיואקטיביות, שלב זה חייב להתבצע על ידי צוות מיומן בתוך מעבדה רדיואקטיבית |
אנזים PNK (1 מיקרוליטר) | ||
אוליגו (100 מיקרומטר, 0.1 מיקרוליטר) | ||
ƳP32 ATP (4 μL) | ||
Wash Buffer – I | 2X SSC | |
0.5% (עם v/v) SDS | ||
Wash Buffer – II | 0.5X SSC | |
0.5% (עם v/v) SDS | ||
Stripping Buffer – I | 0.5X SSC | |
0.1% (עם v/v) SDS | ||
Stripping Buffer – II | 0.1X SSC | |
0.1% (עם v/v) SDS |
The authors have nothing to disclose.
40% Acrylamide-bisacrylamide solution | Sigma | A9926 | Chemical |
Ammonium persulphate (APS) | BioRad | 1610700 | Chemical |
Blotting paper | Whatman blotting paper I | 1001-125 | Assay |
Bromophenol blue | Sigma | B5525-5G | Chemical |
Capillary loading tips | BioRad | 2239915 | Plastic ware |
Deionized formamide | Ambion | AM9342 | Chemical |
Heating block | Eppendorf | 5350 | Device |
Hybond N+nylon membrane | GE | RPN203B | Assay |
Hybridization bottle | Sigma | Z374792-1EA | Plastic ware |
Hybridization Oven | Thermo Scientific | 1211V79 | Device |
N,N,N',N'- Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024-25ml | Chemical |
PhosphorImager | GE- Typhoon scanner | 29187194 | Device |
PhosphorImager screen and cassette | GE healthcare | GE28-9564-75 | Device |
Pipettes | Gilson, models: P20 and P10 | FA10002M, FA10003M | Plastic ware |
Plastic pipette | Falcon | 357550 | Plastic ware |
Polyacrylamide gel apparatus | BioRad | 1658003EDU | Device |
Sephadex G-25 column | GE healthcare | 27532501 | Device |
Speed Vac Concentrator | Thermo Scientific | 20-548-130 | Device |
Spinwin | Tarsons | 1010 | Device |
T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201S | Assay |
Transblot apparatus | BioRad | 1703946 | Device |
ULTRAHyb hybridization buffer | Ambion | AM8670 | Assay |
Urea | Fischer Scientific | 15985 | Chemical |
UV-crosslinker | UVP | CL-1000L | Device |
Vortex | Tarsons | 3020 | Device |
Water bath | NEOLAB | D-8810 | Device |
Xylene cyanol | Sigma | X4126-10G | Assay |