מדידות שטף חמצן להערכת נשימה מיטוכונדריאלית בתאים חיים וחדירים

1. הוספת תאי HEK 293T לתא הרספריומטריה ברזולוציה גבוהה

1. הוסף את מדיום הנשימה המיטוכונדריאלי MiR05 לתוך תא האורובורוס הנקי. סגור את החדר על ידי הכנסת הפקק ושואב את המדיום העודף משקע הפקק באמצעות מערכת היניקה.
2. כדי להוסיף תאי HEK 293T לתא על ידי החלפת נפח חלקית, חשב את נפח תרחיף מלאי התאים הנדרש כדי להגיע לריכוז תאים ניסיוני של 1 מיליון/מ"ל.
3. הסר את הפקק מהתא.
4. הסר נפח של MiR05 מהתא המתאים לנפח המחושב של מתלה מלאי התאים באמצעות פיפטה.
5. השעו מחדש את מתלה מלאי התאים ביסודיות בעזרת פיפטה.
6. הוסף את הנפח המחושב של מתלה מלאי התאים לתא.
   הערה: תא הרספיריומטריה צריך להיות נקי ומלא ב-MiR05, חיישן החמצן הפולרוגרפי צריך להיות מכויל בטמפרטורה יציבה, ויש לטעון פרוטוקול טיטרציה של מצע-מנתק-מעכב (SUIT) בתוכנה DatLab לפני כן. ריכוז הדגימה/תא הניסיוני עשוי להשתנות בהתאם לדגימה הספציפית או לסוג התא. איור 1 מציג דוגמה לרספיריומטריה ברזולוציה גבוהה של תאי HEK 293T.
7. סגור את החדר על ידי הכנסת הפקק והקפדה על כך שלא נלכדו בועות בתוך החדר.
   1. שואבים את כל הנוזלים העודפים מכלי הפקק.
8. המתן לייצוב שטף החמצן, שלוקח בדרך כלל כרבע שעה.

2. טיפול במיקרו-מזרק

1. הכן את המיקרו-מזרקים.
   1. בחר ונקה את המיקרו-מזרק המתאים על סמך סוג הכימיקל והנפח שיש לטיטר. הנח את המיקרו-מזרק על מתלה המזרק.
   2. מלאו את המזרק, הקפד להימנע מהכללת בועות גז.
      הערה: אם נוצרות בועות גז, הסר אותן על ידי הזזת הבוכנה לאט כלפי מעלה ובמהירות כלפי מטה מספר פעמים.
2. בדוק בפרוטוקול SUIT את הנפח הנדרש של הכימיקל שיש לטיטר.
   1. מלאו את המזרק בלפחות 1 מיקרוליטר יותר מהנפח הנדרש.
   2. לחץ על הבוכנה עד להגעה לסימון הרצוי על חבית הזכוכית, וודא שתופיע טיפה קטנה בקצה המחט (תחול).
   3. נגב את הטיפה על דופן הבקבוקון הכימי לפני שתמשיך בטיטרציה.

3. טיטרציה של כימיקלים בהתאם לפרוטוקול SUIT

1. טיטרט את הכימיקלים המצוינים בפרוטוקול SUIT.
   הערה: פתח את חלון האירוע של DatLab על ידי לחיצה על האירוע בסרגל הצד של הפרוטוקול לפני הטיטרציה.
   1. הכנס את המחט לחלוטין דרך נימי הפקק עד שסיום חבית הזכוכית יהיה במגע עם הפקק.
   2. הזריק את הכימיקל לתא במהירות. ​
      הערה: לאחר הזרקה, חפץ טיטרציה מהיר וחולף עשוי להופיע כספייק בשטף O₂ (איור 2A).
   3. הוסף דיגיטונין לריכוז סופי של 5 מיקרוגרם/מ"ל.
      זהירות: דיגיטונין רעיל בבליעה.
   4. לחץ על אישור בחלון האירוע כדי להגדיר את האירוע המתאים.
   5. שואבים עודפי נוזלים מכלי הפקק.
   6. המתן לייצוב שטף החמצן ורשום לפחות 2 דקות.
   7. הוסף פירובט לתא כדי להגיע לריכוז סופי של 5 מ"מ. לחץ על אישור בחלון האירוע כדי להגדיר את האירוע המתאים.
      הערה: בצע את הטיטרציה הבאה ללא דיחוי.
   8. הוסף מלאט מיד לאחר פירובט כדי להגיע לריכוז סופי של 2 מ"מ. לחץ על אישור בחלון האירוע כדי להגדיר את האירוע המתאים.
   9. שואבים עודפי נוזלים מכלי הפקק, ממתינים לייצוב שטף ומקליטים כ -2 דקות.
   10. הוסף אדנוזין דיפוספט (ADP) לריכוז סופי של 2.5 מ"מ. לחץ על אישור בחלון האירוע כדי להגדיר את האירוע המתאים.
   11. שואבים עודפי נוזלים מכלי הפקק, ממתינים לייצוב שטף ומקליטים כ -2 דקות.
       הערה: לאחר הוספת ADP, השטף עשוי להמשיך לעלות באיטיות, ולוקח עד 20 דקות להתייצב.
   12. הוסף קרבוניל ציאניד m-chlorophenylhydrazone (CCCP) במרווחים של 0.5 מיקרומטר כדי להגיע לשטף מקסימלי. לחץ על אישור בחלון האירוע כדי להגדיר את האירוע המתאים לאחר כל טיטרציה.
       זהירות: CCCP רעיל אם הוא נבלע.
       הערה: בצע טיטרציות CCCP בסדרה מהירה (מרווחים של כ-1.5 דקות). הפסק טיטרציה כאשר התוספת שלאחר מכן אינה מגבירה עוד יותר את השטף. שנה את השם של כל טיטרציה של CCCP בחלון האירוע על ידי החלפת * בריכוז CCCP המצטבר.
   13. שואבים עודפי נוזלים מכלי הפקק ומקליטים כ-2 דקות.
   14. הוסף אנטימיצין A כדי להגיע לריכוז סופי של 2.5 מיקרומטר.
       זהירות: אנטימיצין A קטלני בבליעה.
       הערה: זמן התגובה עשוי להשתנות בהתאם לדגימה.
   15. שואבים עודפי נוזלים מכלי הפקק ומקליטים כ-2 דקות.
   16. לחץ על הכפתור שכותרתו עצור מדידה.

4. ניתוח נתונים

1. נתח את הנתונים.
   1. הגדר סימנים על קטעים יציבים ומייצגים של עלילת השטף.
      הערה: הימנע מהכללת חפצי טיטרציה בניתוח העקבות (איור 2B).
2. בחר/י ״סימנים״ בתפריט העליון ולאחר מכן בחר/י ״סמן סטטיסטיקה״. בחר את מצב הסטטיסטיקה הרצוי ולחץ על העתק ללוח כדי להעביר את הנתונים להמשך ניתוח.

איור 1: רספירומטריה ברזולוציה גבוהה של תאי HEK 293T. עקבות של ריכוז O2 [μM] (קווים כחולים) ושטף O2 ספציפי לנפח [pmol∙s-1∙mL-1] (קווים אדומים; תוקן לשטף O2 ברקע אינסטרומנטלי; קוצים שנגרמו על ידי טיטרציות בוטלו). SUIT-002_O2_ce-pce_D007 הוא פרוטוקול נרחב וכולל תוספת של תאים ce1, נשימה שגרתית R של תאים חיים. +חפירה, דיגיטונין 10 מיקרוגרם·מ"ל-1; חדירות של ממברנות פלזמה (CE עד PCE), שאריות נשימה אנדוגניות ren. +D, ADP 2.5 מ"מ מגרה צריכת מצע אנדוגני שיורית. +M.1, מלאט 0.1 מ"מ ו-1Oct, אוקטנואילקרניטין 0.5 מ"מ; קיבולת OXPHOS במסלול F, 1c, ציטוכרום c 10 מיקרומטר; בדיקת שלמות הממברנה החיצונית המיטוכונדריאלית, 2M2, מלאט 2 מ"מ התומך במסלול ה-N האנפלרוטי; פ(נ)פ. 3P ו-4G, פירובט 5 מ"מ וגלוטמט 10 מ"מ, הפעלה פרוגרסיבית ל-FNP. 5S, סוקסינט 10 מ"מ, FNSP. 6Gp, גליצרופוספט 10 מ"מ, FNSGpP. 7U4.5, טיטרציות ניתוק לריכוז CCCP אופטימלי 4.5 מיקרומטר; FNSGpE. 8Rot, רוטנון 0.5 מיקרומטר SGpE. 9אמה, אנטימיצין A 2.5 מיקרומטר, רוקס. 10AsTm, אסקורבט 2 מ"מ ו-TMPD 0.5 מ"מ, O2 שטף מחוץ לקנה מידה 121 pmol·sL-1·mLL-1. 11Azd, אזיד 200 מ"מ, רקע כימי chb. ריכוז תאים 1 מיליון למ"ל, MiR05 בינוני, טמפרטורה 37 מעלות צלזיוס. ריכוז החמצן נשמר מעל 60 מיקרומטר על ידי חמצון מחדש לסירוגין (אוויר, תא פתוח, גוון כחול).

איור 2: פרוטוקול פשוט של מצע-מנתק-מעכב-טיטרציה (SUIT) עם תאי HEK 293T כדי להדגיש את התזמון המתאים של טיטרציות כימיות. (A) מציג את העליות שנגרמו על-ידי טיטרציות, שנמחקות ב-(B). עקבות מונחים של שטף O2 לנפח [pmol∙s-1∙mL-1] עבור תא A (קו מגנטה) ותא B (קו ירוק). הוספת תאים (ce1) ומדידת נשימה שגרתית R. +חפירה, טיטרציה של דיגיטונין 5 מיקרוגרם·מ"ל-1 כדי לחדור את קרום הפלזמה (ce ל-pce) ולמדוד שאריות נשימה אנדוגניות . 13:00, תוספת ברצף הקרוב של פירובט (5 מ"מ) ומלאט (2 מ"מ) כדי לעורר את נשימת LEAK בנתיב NL. 2D, תוספת ADP 2.5 מ"מ; קיבולת OXPHOS במסלול NN 3U5, טיטרציות ניתוק מהירות בצעדים של 0.5 מיקרומטר לריכוז האופטימלי של CCCP; קיבולת ET הקשורה ל-NADH NE. 4Ama, טיטרציה של אנטימיצין A 2.5 מיקרומטר כדי להעריך את צריכת החמצן השיורית rox. ריכוז תאים 1 מיליון/מ"ל, MiR05 בינוני, טמפרטורה 37 מעלות צלזיוס