חיסון אורתוטופי של תאי סרטן השחלות לשחלות מורין: הליך להקמת מודל עכבר סרטן השחלות לחקר הפצת תאים בצפק

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת מתלי תאים

1. קו תאי קרצינומה של תאים שקופים בשחלות אנושיות
   1. שמור על תאי ES-2 במדיום RPMI-1640 עם 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ופניצילין/סטרפטומיצין (פניצילין: 100 יחידות/מ"ל, סטרפטומיצין: 0.1 מ"ג/מ"ל). תאי תרבית ב 37 ° C באינקובטור 5% CO₂ לח.
   2. איסוף תאים בשלב הגידול הלוגריתמי בתמיסת 0.05% טריפסין/0.02% EDTA (טריפסין/EDTA).
      1. ראשית, הסר את המדיה הישנה מכלי תרבית התא, ולאחר מכן שטוף את התאים פעם אחת עם PBS (PBS ללא Ca²⁺/Mg²⁺,3-4 מ"ל לכל 25 ס"מ²).
      2. לאחר מכן, להוסיף 1 מ"ל לכל 25 ס"מ² של טריפסין/EDTA. סובבו את כלי תרבית התאים כדי לכסות את שכבת התא בטריפסין/EDTA. לאחר הסרה והשלכה של טריפסין/EDTA, יש להחזיר את כלי תרבית התאים לאינקובטור למשך 3-5 דקות או עד לניתוק התאים.
      3. בחנו את התאים תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים מנותקים מפני השטח של כלי תרבית התאים וצפים.
      4. הוסף מדיום גידול טרי המכיל סרום כדי להשבית את הטריפסין (5 מ"ל לכל 25 ס"מ²) ולהשהות מחדש את התאים. העבר תאים מרחפים לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
      5. צנטריפוגה בטמפרטורה של 300 x גרם למשך 5 דקות. יש לבצע צנטריפוגה בטמפרטורה של 4°C או בטמפרטורת החדר. בזהירות להסיר supernatant ו resuspend תאים עם מדיום צמיחה (5 מ"ל לכל 25 ס"מ²).
   3. לספור תאים (למשל, על ידי הרחקת טריפאן-כחול), ולאחר מכן להשהות מחדש במדיום הצמיחה בצפיפות של 2 x 10⁸ תאים / מ"ל. שים את התאים המרחפים על קרח.
2. הפשירו אליציטוטים הידרוג'ל קפואים מבוססי מטריצה חוץ-תאית (ECM) באמבט קרח.
3. הוסף את תרחיף התא לאליציטוטים הידרוג'ל מבוססי ECM ביחס של 1:1 (ריכוז התא הסופי: 1 x 10⁵ תאים/μL של הידרוג'ל מבוסס ECM בינוני) וערבב היטב. הניחו את מתלי התאים המוכנים באמבט קרח עד לשימוש.

2. חיסון אורתוטופי עם מתלי תאים

הערה: ניתוח אינו דורש סוויטה ייעודית. ניתן לבצע את הניתוח על ספסל מעבדה באזור נפרד בחדר ובעל פעילות מינימלית. ניתן להשתמש גם במכסה מנוע למינרי. יש להשתמש בכלי ניתוח סטריליים, ואין להשתמש במספריים לביצוע חתכים בעור.

1. השתמש בעכברים עירומים נקבות (BALB/c nu/nu) בגיל 8 שבועות עבור מודל חיסון אורתוטופי זה.
2. ראשית, להרדים את העכבר באמצעות שאיפה עם isoflurane (2-4%). בדוק את עומק ההרדמה על ידי אימות חוסר נסיגה על צביטת הבוהן המוצקה. לאחר הרדמת העכבר, יש למרוח משחת עיניים סטרילית תפלה על העיניים כדי למנוע התייבשות לפי הצורך.
3. הניחו את העכבר המרדים על שלב ניתוח, עם הבטן כלפי מטה. יש לחטא את אזור הניתוח מספר פעמים הן עם אלכוהול והן עם פילינג על בסיס יוד או כלורהקסידין.
4. בצע חתך של 2 ס"מ במאונך ליד עמוד השדרה בין הקשת הקוסטלית הימנית לבין עצם הירך. יש להשתמש בוילון כירורגי סטרילי סביב מקום החתך. תקן את משטחי העור החתוכים עם מלחציים כדי לשמור על הפתח.
   הערה: ניתן להשתמש ב- Retractors במקום מלחציים.
5. לאחר מכן, בצע חתך שני (כ 1 ס"מ) בצפק הקודקוד מתחת לחתך הראשון כדי לפתוח את חלל הבטן. מהדקים את משטחי הבטן החתוכים. קליפ את רקמת השומן המקיפה את השחלה ipsilateral ואת החצוצרה עם מהדק כדי להסיר את השחלה מחלל הבטן. בזהירות מניחים את השחלה ואת החצוצרה על גזה. לאחר מכן, הניחו את בטן העכבר כלפי מטה מתחת למיקרוסקופ המנתחת.
6. מניחים את תרחיף התא במזרק אינסולין (1/2 סמ"ק, 29 גרם) ממש לפני ההזרקה. בזהירות להזריק את השעיית התא מוכן (1-2 μL) לתוך השחלה. במשך מספר שניות, שמור את המחט בתוך השחלה כדי להבטיח ג'לציה של הידרוג'ל מבוסס ECM. לאחר הגלציה, תאי הגידול המוזרקים נשארים בתוך השחלה.
7. בזהירות להחזיר את השחלה לתוך הגוף. תפרו את החתך השני עם משי רפואי סטרילי ולאחר מכן אטמו את העור עם קליפסים לפצע.
8. לאחר הניתוח, העכברים יקבלו שיכוך כאבים (למשל, meloxicam, תוך שרירי או תת עורי, 0.2 מ"ג / ק"ג) לתקופה ראשונית של 24 שעות.