הזרקה תוך ורידית של תאים סרטניים לתוך כלי הדם של קרום כוריואלנטואי עוף: הליך להקמת מודל סרטן קרום כוריואלנטואי לחקר פלישה לסרטן וגרורות

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת התאים הסרטניים להזרקה

הערה: בחירת מושבה גרורתית מבוססת על פנוטיפ שנקבע על-ידי תאים סרטניים פלואורסצנטיים, הנגזר מספריית ביטויים או וקטור המתויג בחלבון פלואורסצנטי כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק או אדום (ראו את זרימת המסך כולה באיור 1A). לא מומלץ להשתמש בתאים הנגועים באופן זמני בחלבונים פלואורסצנטיים או מסומנים בצבעים פלואורסצנטיים חדירים לתאים עקב דעיכה מהירה של אות הנגרמת על ידי התפשטות תאים סרטניים וכתמים לא אחידים.

1. תרבית תאים סרטניים למפגש של 60-70% בזמן ההזרקה. שימוש בתאים סרטניים ברמות גבוהות יותר של מפגש יפחית את הכדאיות שלהם, וכתוצאה מכך יעילות נמוכה של היווצרות מושבות גרורתיות. ודא כי התאים הסרטניים המשמשים הם ללא מיקופלסמה מאז זיהום מיקופלסמה עלול להוביל לירידה בכדאיות עובר תרנגולת.
2. יש לשטוף תאים פעמיים עם 1x PBS, pH 7.4. הסר את PBS הנותר, ולאחר מכן הוסף 0.5% טריפסין-EDTA ודגור ב 37 ° C במשך 2-5 דקות עד שכל התאים מורמים משטח צלחת התרבית.
3. מעבירים את תרחיף התא לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל ותאי צנטריפוגות בטמפרטורת החדר ב 200 x גרם למשך 5 דקות.
4. להשהות תאים ב 10 מ"ל של PBS לצנטריפוגה את התאים שוב כמו בשלב 1.3, כדי להסיר טריפסין ורכיבי מדיה אחרים בתרבית כגון אנטיביוטיקה.
   הערה: נוכחותם של רכיבי טריפסין או תרבית תאים כגון אנטיביוטיקה בתרחיף התא הסרטני עלולה לגרום לירידה בכדאיות עוברי תרנגולת.
5. בזהירות לשאוף את supernatant ו resuspend תאים עם 1 מ"ל של PBS קר כקרח.
6. ספור את מספר התאים באמצעות המוציטומטר או כל ציוד ספירת תאים אחר זמין.
   הערה: פרוטוקול סינון זה דורש שכל מושבה גרורתית תיזום על ידי תא בודד. בעת ספירת התאים יש לוודא כי התאים עוברים טריפסינה מלאה וקיימים כתרחיף של תא בודד (אין גושי תאים).
7. להזרקה תוך ורידית (IV), רכז תאים ל 0.5 x 10⁶ – 1.0 x 10⁶ תאים / מ"ל. השתמש 1x PBS קר כקרח כדי לדלל ו / או להשהות מחדש תרכיזי תאים. צפו כי כ 1 מ"ל של השעיית תאים יהיה צורך עבור כל עשרה עוברים.
   הערה: ריכוז תרחיף התא ההכרחי בתרחיף נקבע בעיקר על ידי רמת הניסיון של הנסיין. עיין בסעיף הבא לקבלת פרטים נוספים.

2. הזרקה תוך ורידית של תאים סרטניים להיווצרות מושבה גרורתית

הערה: בהתאם לפרוטוקול זה ניתן להזריק עד מאה עוברים תוך יום אחד. בדרך כלל לוקח זמן רב יותר לבודד את המושבות הגרוררתיות מאשר להזריק את התאים הסרטניים ולכן מומלץ לבצע ניסוי ראשוני כדי להעריך את הזמן הדרוש להשלמת כל השלבים. שימוש בתוויות פלואורסצנטיות דיפרנציאליות של תאים סרטניים מסייע להפחית את מספר בעלי החיים ואת הזמן הדרוש לכל ניסוי. לדוגמה, תאי ביקורת יכולים להיות מסומנים עם RFP (חלבון פלואורסצנטי אדום) בעוד תאי גידול מוטנטיים יכולים להיות מסומנים לחלופין עם GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק). במקרה זה, לכל ניסוי יש בקרה מובנית שמתקנת את השונות בין העוברים.

1. הרכיבו את מנגנון ההזרקה כפי שמוצג באיור 1B. ראשית, הרכיבו מחט על המזרק ולאחר מכן האריכו את מחט המזרק עם חתיכת צינור באורך 3-5 ס"מ.
2. שברו את קצה מחט הבורוסיליקט בעזרת המלקחיים העדינים (~ 20-60 μL רוחב).
3. טען את המזרק עם תרחיף התא הסרטני (50-200 μL) והכנס את מחט הבורוסיליקט לתוך הצינורית (איור 1B).
4. בדוק את מחט בורוסיליקט עבור סתימת תאים ובועות אוויר. חיוני להזריק תאים כתרחיף של תא בודד כדי להבטיח שכל מושבה גרורתית תיזום על ידי תא בודד.
   הערה: תאים סרטניים נוטים להצטבר ב- PBS תוך 1-2 שעות לאחר טריפסיניזציה, ולכן יש להכין אותם מיד לפני ההזרקה. במידת הצורך, תאים ניתן להשעות מעת לעת באמצעות מזרק 1 מ"ל המשמש לזריקות (ללא מחט בורוסיליקט).
5. אם נצפתה סתימת תאים בתוך הנימים, הסירו את הנימים, השהו מחדש את התאים והחליפו אותם בנימים חדשים. השתמש בבוכנה כדי לדחוף החוצה בועות. אם לא נצפתה סתימת תאים או בועות, המשך לשלב הבא.
6. הסירו את מכסה הכיסוי והעבירו את העובר מתחת לסטריאוסקופ. זהה את הווריד המתאים להזרקה על משטח CAM. ורידים ועורקים יוצרים את הרשת המורכבת בתוך רקמת ה-CAM (איור 1C). ורידים נבדלים על ידי צבע אדום בהיר כי הם נושאים דם עשיר בחמצן לעובר.
   הערה: עבור מניפולציה כללית של עוברים, הזרקת תאים סרטניים וכריתת מושבה גרורתית, השתמש בסטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במטרות 0.8x ו- 1.5x ו- 10x ומשקפיים 10x להדמיה. ניתן להשתמש בהצלחה גם במיקרוסקופים פחות מתקדמים עבור הליכים אלה, בהתאם לרמת הניסיון של המשתמשים. הקוראים יכולים ליצור קשר עם המחברים לקבלת המלצות מפורטות יותר.
7. מצא את הווריד האידיאלי להזרקת תאים שהוא בדרך כלל רק מעט רחב יותר (10-20%) מקוטר קצה מחט בורוסיליקט וממוקם באמצע הדרך בין העובר לדופן צלחת השקילה. בדרך כלל קל יותר להזריק בנקודה הסמוכה לביפורקציה של הווריד.
   הערה: הזרקה לווריד גדול יותר עשויה להיראות קלה יותר, אך תוביל לדימום יתר ולירידה בהישרדות העובר.
8. לחץ על קצה המחט כנגד דופן כלי הדם והפעל לחץ עדין באותו כיוון כמו זרימת הדם. במידת הצורך, השתמש בצמר גפן (המוחזק ביד השנייה) כדי לעזור לעגן או לייצב את כלי הדם המוזרק.
9. לחץ בעדינות על בוכנה מזרק. ניתן לדמיין זריקה מוצלחת על ידי התבוננות ב"ניקוי" של כלי הדם כאשר תרחיף התאים הסרטניים נכנס לזרם הדם.
10. ממשיכים ללחוץ על בוכנה מזרק במשך 2-10 שניות עד נפח ההשעיה הרצוי מוזרק לתוך זרם הדם של הווריד. בסך הכל, הזרקה של עובר יחיד עשויה לדרוש 1-10 דקות, בהתאם לרמת הניסיון של המשתמש. אם דימום מוגזם או הצטברות נוזלים צלולים מופיעים במקום ההזרקה, יש להשליך את העובר.
    הערה: קל "להזריק יתר על המידה" עובר. השיקול הכללי שיש לזכור הוא שמושבות גרורתיות לא צריכות לגעת זו בזו לאחר תקופת צמיחה של 4-5 ימים. באופן אידיאלי, ~5-10% מנימי הוורידים הסופניים של CAM צריכים להיות משותקים בהם לאחר הזרקה מוצלחת (איור 1D, E). כפי שהוזכר בסעיף 1, ניתן להשתמש בטווח של ריכוז תאים (0.5 x 10⁶ – 1.0 x 10⁶ תאים / מ"ל). ריכוזים נמוכים יותר ידרשו זמן הזרקה ארוך יותר אך יפחיתו את סתימת המחטים. ריכוזים גבוהים יותר ידרשו זמני הזרקה קצרים יותר אך יגבירו את סתימת המחטים. מומלץ לנסות מספר ריכוזים כדי למצוא את האחד הנוח ביותר עבור מפעיל. בדרך כלל, ריכוז גבוה יותר (1.0 x 10⁶ תאים / מ"ל) עדיף על פני קיצור זמן ההזרקה.
11. הסר את המחט מה- CAM וטפח בעדינות את אתר ההזרקה עם צמר גפן כדי להסיר דם או תאים סרטניים עודפים.
12. מכסים את העובר בצלחת השקילה במכסה ומחזירים את עובר העוף המוזרק לאינקובטור.
13. חזור על ההליך עם העובר הבא עד להזרקת כל העוברים.

איור 1: קווי מתאר של הזרקת תאים סרטניים ובידוד מושבה גרורתית.(A) תרשים זרימה המתאר את שלבי פלטפורמת הסינון של עוברי תרנגולות. (B) הזרקת תאים סרטניים על במת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי הסטריאופוני. (C) הזרקת התאים הסרטניים לתוך כלי הדם של CAM. (D) תמונה המציגה הזרקה מוצלחת של תאים סרטניים (צפיפות תאים סרטניים מקובלת), שצולמה מיד לאחר ההזרקה. (E) תמונה המציגה הזרקה לקויה של תאים סרטניים, הנראית כעובר שמוזרק יתר על המידה. שימו לב להצטברות תאים סרטניים בנימי הדם (חיצים לבנים). פסי קנה מידה = 1 ס"מ.