בדיקת הסתעפות גליקוגן למדידת מידת הסתעפות הגליקוגן

1. הערכה איכותית של הסתעפות גליקוגן

1. הכינו תמיסת סידן כלורי רווי על ידי הוספת 74.5 גרם סידן כלורי נטול מים ל~40 מ"ל מים וערבוב. מוסיפים עוד קצת מים וממשיכים לערבב. הפוך את נפח עד 100 מ"ל עם מים ולהמשיך לערבב עד CaCl₂ מומס לחלוטין.
2. הכינו מלאי עבודה של מגיב צבע יוד/CaCl₂ על ידי ערבוב 50 מיקרוליטר של תמיסת מלאי KI/יוד עם 13 מ"ל של תמיסת CaCl₂ רוויה בצינור של 15 מ"ל. יש לערבב היטב ולאחסן בטמפרטורה של 4°C, מוגן מפני האור. הפתרון יציב לפחות שבוע בתנאים אלה.
3. קביעת הסתעפות
   1. בצינור של 1.5 מ"ל, ערבבו 650 μL של מלאי מגיב צבע יוד/CaCl₂ עם 100 μL מים וערבבו היטב. העבר את התמיסה לקובט מתאקרילט חד פעמי.
      הערה: הפתרון בקובט צריך להיות ברור בצבע צהוב חיוור.
   2. מקם את הספקטרופוטומטר, ובמצב סריקה של אורך גל, אסוף ספקטרום רקע מ- 330 ננומטר עד 800 ננומטר.
   3. בצינור של 1.5 מ"ל, שלבו 650 מיקרוליטר של יוד/מגיב צבע CaCl₂ עובד עם 50 מיקרוגרם של גליקוגן צדפות. מביאים את הנפח הסופי ל-750 מיקרוליטר עם מים ומערבבים היטב. העבר את התמיסה לקובט מתאקרילט חד פעמי.
      הערה: התמיסה בקובט צריכה להיות ברורה ובצבע כתום/חום עמוק.
4. הכניסו לספקטרופוטומטר ואספו ספקטרום בליעה מ-330 ננומטר עד 800 ננומטר.
5. חזור על שלבים 1.3.3 עד 1.4 עם 50 מיקרוגרם עמילופקטין ו-30 מיקרוגרם עמילוז.
   הערה: דגימת העמילופקטין צריכה להיות צהובה/ירוקה ודגימת העמילוז צריכה להיות ירוקה/כחולה. שתי הדגימות צריכות להיות ברורות. הקומפלקסים הצבעוניים הנוצרים יציבים, ללא שינוי בספקטרום הספיגה, למשך שעה לפחות בטמפרטורת החדר.
6. כדי לקבל אינדיקציה למבנה המסועף של דגימת גליקוגן לא מאופיינת יש לשלב 25 מיקרוגרם עד 50 מיקרוגרם גליקוגן עם 650 מיקרוליטר של יוד עובד/מגיב צבע CaCl₂. המשך כאמור לעיל, להביא את נפח 750 μL עם מים, ערבוב יסודי, ולהעביר cuvette methacrylate.
   הערה: דגימת הגליקוגן צריכה להניב צבע צהוב/כתום עד כתום/חום בהתאם למידת ההסתעפות (אורך השרשראות החיצוניות) של הגליקוגן הנוכחי. שוב, המדגם צריך להיות ברור.
7. אספו את ספקטרום הבליעה.