יצירת גנגליון שורש גבי, חציל ותרבית תאים מנותקת

1. תרבית DRG מעכבר בוגר

1. הניחו את ה-DRG שנאסף בצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ המכילה 3 מ"ל של מדיה נטולת סרום קר כקרח (SFM).
2. העבירו כל DRG בודד בצלחת פטרי מזכוכית יבשה, ותחת מיקרוסקופ כירורגי, נקו וקצצו את עודפי הסיבים ורקמת החיבור שעדיין מחוברים ל-DRG באמצעות להב. ניתן לזהות בקלות את ה- DRG כמבנה שקוף בולט לאורך עצב / שורש עמוד השדרה הלבן. כלי דם נמצאים לעתים קרובות סביב DRG.
3. הניחו את ה-DRG הנקי בצלחת פטרי חדשה המכילה מדיית SFM קרה כקרח.
4. דללו את תערובת החלבונים הג'לטינית (ראו טבלת חומרים) ב-SFM קר כקרח (1:1).
5. צלחת DRG ex vivo בצלחות 12 באר מצופה מראש עם 10/20 μL של תערובת חלבונים ג'לטינית ומניחים אותם בתוך האינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO2 במשך 30-60 דקות.
6. הוסיפו בעדינות 1.5-2 מ"ל SFM למערכת התרביות כדי לכסות את כל הצמח ולשמור על הצמחים בתנאי גידול (37°C ו-5% CO2).
   הערה: זהו שלב קריטי מכיוון שה- DRG מעוגן לצלחות הזכוכית רק על ידי תערובת החלבונים הג'לטיניים הפולימריים. זמן פילמור ומיומנויות פיפטינג הם קריטיים כדי למנוע ציפה.
7. שנה את מדיום הגידול של DRG כל 72 שעות ותן ל- DRG לגדול כל עוד יש צורך.

2. בידוד תאי עצב חד-תאיים מ-DRG

1. הניחו את כל ה-DRG שנאסף בצינור סטרילי בנפח 1.5 מ"ל עם 1.2 מ"ל של מדיה F12 המכילה 1.25 מ"ג/מ"ל של collagenase IV ודגרו עליו בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2 למשך 45 דקות. חזרו על שלב זה במשך 45 דקות נוספות לאחר הדגירה הראשונה.
2. יש לטפל בחצילים עם 2 מ"ל של חומר F12 המכיל טריפסין (0.025%) למשך 30 דקות מיד לאחר הטיפול ב-collagenase IV בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
3. יש לדגור עם 2 מ"ל של חומרי הדפסה מסוג F12 המכילים סרום בקר עוברי (FBS; 33%) בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2 למשך 15 דקות.
4. לשטוף extplants שלוש פעמים עם 2 מ"ל של מדיה F12 ולהמשיך לנתק אותם מכנית עם פיפטה זכוכית עד שהמדיה הופכת מעונן.
   הערה: הליך זה כולל איסוף של DRG נקי/גזוז מהחיה, כפי שהוסבר בסעיף הקודם. בעת ביצוע דיסוציאציה מכנית של explants, להיות עדין ולא להשתמש בכוח מופרז שכן זה יכול להוביל שפיכה ואובדן של חומר עבודה.
5. סנן את תרבית התאים המנותקת דרך מסנן 0.22 מיקרומטר כדי להסיר זיהומים ורקמת חיבור עודפת. צנטריפוגה את התא המסונן ליזט ב (2,500 x גרם) במשך 2 דקות.
6. הסר את supernatant ו resuspend את גלולת התא ב 500 μL של מדיה neurobasal המכיל תוספת עבור תרבית עצבית (1x), תערובת אנטיביוטיקה (1x), L-גלוטמט (0.5 mM), גורם גדילה עצבי (5 מיקרוגרם / מ"ל) (ראה טבלה של חומרים).
7. העלו את התאים המנותקים על שקופיות כיסוי מצופות למינין (50 מיקרוגרם/מ"ל; ראו טבלת חומרים) בצפיפות תאים מועדפת. קביעת צפיפות התא באמצעות מונה תאים.
   הערה: ציפינו תאים ב-25,000 תאים/שקופית כיסוי. טכניקה זו מאפשרת דיסוציאציה של תאי עצב ותאי לוויין גלייה. מרכיב הגליה בתרבית משותפת עם הנוירונים הפסאודו-קוטביים ממלא תפקיד קריטי בהישרדות העצבית.