הקלטה חוץ גופית של תנודות תטא בהיפוקמפוס העכבר

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.                                                                                      

1. היפוקמפוס חריף בהכנה חוץ גופית

הערה: בידוד ההכנה השלמה של ההיפוקמפוס כולל שלושה שלבים עיקריים: (1) הכנת תמיסות וציוד, (2) דיסקציה של ההיפוקמפוס ו-(3) הגדרת מערכת קצב הזלוף המהיר הדרושה ליצירת תנודות תטא פנימיות. בפרוטוקול זה, ביצוע בזמן של הליכים – מדיסקציה ועד הקלטה – חשוב במיוחד מכיוון שההיפוקמפוס המבודד מהווה הכנה כה צפופה אך עדינה ששמירה על קישוריות תפקודית של המבנה במבחנה דורשת זהירות רבה. הכנת הכל מראש מבטיחה כי רמה נאותה של זילוח זמין מוקדם ככל האפשר כדי למזער את הנזק לתאים ולשמור על תפקוד פיזיולוגי.

1. תמיסת נוזל עמוד שדרה מלאכותית מבוססת סוכרוז (aCSF)
   1. הכינו תמיסת סוכרוז 1X שתשמש לדיסקציה ולדגירה לאחר דיסקציה. יש לשלב את כל הרכיבים המפורטים בטבלה 1, למעט CaCl₂, ב-1 ליטר מים שעברו דה-יוניזציה ולאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.
2. פתרון aCSF סטנדרטי
   1. הכינו aCSF סטנדרטי לזילוח בקצב זרימה גבוה של ההיפוקמפוס המבודד במהלך רישומים אלקטרופיזיולוגיים. כדי להפוך את המלאי המרוכז (5X) ל-aCSF, יש להמיס את כל הרכיבים המפורטים בטבלה 2, למעט CaCl₂, ב-2 ליטר של מים נטולי יונים, ולאחסן בטמפרטורה של 4°C.
3. הכינו את הציוד
   1. לפני תחילת הנתיחה, מקמו את אזור הספסל עם מגש פלסטיק מלא קרח (30 x 20 x 5 ס"מ), קווי צינורות המחוברים לקרבוגן ושלוש צלחות פטרי מזכוכית (10 x 2 ס"מ) (ראה איור 1).
   2. הוסף 300 מ"ל של תמיסת סוכרוז (1X מלאי) לכוס של 500 מ"ל, בעבע אותה עם קרבוגן (95% O₂, 5% CO₂) והוסף Ca₂+ [1.2 mM].
   3. מעבירים 60 מ"ל של תמיסת סוכרוז זו לצלחת פטרי זכוכית ומשאירים בטמפרטורת החדר. הכניסו את השאר למקפיא בטמפרטורה של 4°C למשך 10-15 דקות.
   4. מבעבעים את תמיסת הסוכרוז הקרה כקרח עם קרבוגן לאורך כל הדיסקציה.
   5. מלאו צלחת פטרי שנייה (תא החזקה קרה) בתמיסת סוכרוז (4°C) ושמרו אותה על קרח.
   6. הוסף 30 מ"ל של תמיסת סוכרוז קרה כקרח לכוס 50 מ"ל.

2. דיסקציה שלמה של ההיפוקמפוס

הערה: השיטה לניתוח ההיפוקמפוס המבודד זהה במהותה לזו שפותחה ותוארה במקור אך עם פרטים נוספים ושינויים לגבי קצב הזילוח וטכניקות ההקלטה.

1. דיסקציה מוחית
   1. מרדימים עכבר מתחת למכסה מנוע עם מגבת נייר קטנה ספוגה ב -1 מ"ל איזופלורן (100%) שמוסיפים לכלוב.
   2. ערפו את ראשו של העכבר המורדם ושקעו במהירות את הראש בתמיסת סוכרוז קרה כקרח (50 מ"ל כוסית, ~ 5 שניות). מעבירים למגבת נייר.
   3. השתמש באזמל כדי לבצע חתך עור מדיאלי (קאודלי לרוסטרל) ודחף את העור בצדדים כדי לחשוף את הגולגולת.
   4. פתחו את הגולגולת בעזרת מספריים קטנים והשתמשו במרית כדי לחלץ במהירות את המוח ולזרוק אותו לתוך צלחת פטרי המכילה תמיסת סוכרוז קרה כקרח. המתינו 1-2 דקות עד שהמוח יתקרר.
   5. בזמן שהמוח מתאושש, הוסיפו 2-3 מ"ל של תמיסת סוכרוז על צלחת פטרי (דיסקציה) מכוסה נייר עדשה על קרח.
2. בידוד ההיפוקמפוס
   1. הניחו את המוח על צלחת הדיסקציה במצב זקוף.
   2. הסר את המוח הקטן ואת קליפת המוח הקדמית עם סכין גילוח. חתכו את המוח לשניים לאורך מישור הקשת האמצעית והחזירו את שתי ההמיספרות המבודדות לתא ההחזקה. אפשר עוד 1-2 דקות להתאוששות.
   3. הניחו מוח בודד זקוף על צלחת הדיסקציה.
   4. סובבו את המנה עד שמבנים אמצעיים פונים לצופה וקווי המתאר המוטבעים של מתחם המחיצה נראים כשכבה דקה בצורת אגס של רקמה קדמית לתלמוס.
   5. החזיקו את המוח החצוב יציב בעזרת מרית המיקרו והניחו את הקצה הקטן של המרית המצופה פוליטטרה-פלואוראתילן (PTFE) מיד מאחורי אזור המחיצה.
   6. מכניסים את המרית המצופה מתחת למחיצה ומזיזים את הקצה כלפי מטה עד שמגיעים לצלחת הדיסקציה. חותכים את הסיבים המחברים את אזור המחיצה בצורה קאודלית. חזור על אותה פעולה לאורך הקצה הקדמי של המחיצה וחתך את הסיבים המתחברים לחלק הקדמי של המוח.
   7. כאשר המרית מחזיקה קלות את החלק הפנימי של קליפת המוח ממש מעל ההיפוקמפוס במצב זקוף, השתמשו במרית המיקרו כדי למשוך בזהירות למטה את גרעיני התלמוס, ההיפותלמוס וגזע המוח הנותרים. לאחר מכן, השתמש במרית כדי לחתוך ולהסיר את הרקמה שנמשכה.
   8. סובבו את ההמיספרה המבודדת על צדה וזהו את קווי המתאר של ההיפוקמפוס.
   9. הכנס את המרית המצופה לחדר הצידי מתחת לקצה הרוסטרלי של ההיפוקמפוס הגבי.
   10. החזיקו את המרית מיושרת אופקית עם המישור האמצעי-סגיטלי של המוח החצוי והחליקו אותה דרך קווי המתאר החלקים של דפנות החדרים עד שהקצה יוצא בצורה קאודלית.
   11. החזיקו את המרית מתחת להיפוקמפוס ולחצו אותה קלות על הסיבים המחברים לאורך השכבה הפנימית שבה ההיפוקמפוס מתחבר עם קליפת המוח שמעליו. מרחו את מרית המיקרו בצד החיצוני של שכבה זו והחליקו כנגד המרית המצופה כדי לחתוך דרך הסיבים המחברים.
   12. להשלמת החילוץ, סובבו את צלחת הדיסקציה והכניסו את המרית המצופה מתחת להיפוקמפוס הגחוני. החזיקו קלות את החלק הפנימי של קפל קליפת המוח עם המרית וחתכו דרך החיבורים האנטורינליים באמצעות תנועת חיתוך כנגד מרית המיקרו.
       הערה: ניתן להסיר את כל קומפלקס הספטוהיפוקמפוס על ידי הנחת המרית המצופה מתחת לכל ההיפוקמפוס, ומשיכת רקמת המוח הנותרת מתחת.
   13. לאחר השלמת הבידוד, שמרו על ההיפוקמפוס מונח על הצלחת והוסיפו טיפה של תמיסת סוכרוז קרה כקרח כדי לשמור על קרירותו. חתכו בזהירות את כל קליפת המוח והסיבים שנותרו והפרידו את ההיפוקמפוס מהמחיצה על ידי יישום עדין של סכין גילוח דרך fornix.
       הערה: אם רוצים לבצע רישומי מהדק טלאי מתאים פירמידליים, ניתן לחתוך את ההיפוקמפוס המבודד באופן רוחבי בזווית של 45° כדי לחשוף את השכבה הפירמידלית של Cornu Ammonis (CA)1 (הכנה "חתוכת זווית") מבלי לפגוע במעגלי הרשת המקומית בחלק הנותר של ההיפוקמפוס.
   14. מעבירים את ההכנה לתמיסת סוכרוז בטמפרטורת החדר ונותנים לה להתאושש במשך 15 - 30 דקות לפני ההעברה לתא ההקלטה.

3. הגדר את הזלוף המהיר להקלטת ההיפוקמפוס המבודד

1. הגדר את מערכת הזילוח המוזנת מכוח הכבידה כדי לאפשר זרימה רציפה במהירות גבוהה של aCSF מחומצן במהירות של 20 - 25 מ"ל לדקה.
   1. הכינו מראש צלוחיות aCSF (1X) וטבלו אותן באמבט חימום (~ 30 מעלות צלזיוס) לפחות 15 דקות לפני תחילת הניסוי. הפעל את מערכת מחמם הפתרון המובנה (30 ° C).
   2. השתמש בבועות אקווריום ובצינורות המחוברים למיכל קרבוגן כדי לחמצן aCSF במהלך הניסוי, והוסף CaCl₂ [2 מילימול] לפני תחילת הזילוח.
   3. עצור את זרימת aCSF והעבר את ההיפוקמפוס לתא ההקלטה באמצעות הקצה הרחב של פיפטת זכוכית. הניחו לתכשיר רווי הסוכרוז לשקוע ולשקוע בתחתית.
   4. הניחו את ההכנה במרכז תא ההקלטה (בקו אחד עם ציר הכניסה-יציאה) עם משטח חלק של CA1 ו-SUB למעלה.
   5. ייצב את ההיפוקמפוס עם משקלים קטנים בגפיים המחיצתיות והרקתיות והפעל מחדש את זרימת aCSF.

4. אלקטרופיזיולוגיה בהיפוקמפוס המבודד

1. הקלטה חוץ-תאית של תנודות תטא במבחנה בהיפוקמפוס
   1. לניטור חוץ-תאי של פוטנציאל שדה מקומי (LFP) או פעילות יחידה אחת מההיפוקמפוס המבודד במבחנה, השתמשו במיקרופיפטות זכוכית (1 - 3 MΩ) מלאות ב-aCSF. הקלט אותות פוטנציאליים של שדה מצומד AC עם רעש נמוך באמצעות מגבר מהדק תיקון של רווח x1000, סינון פס פס מקוון 0.1 - 500 הרץ, וקצב דגימה של 5-20 kHz.
      הערה: המיקרוסקופ שנבנה בהתאמה אישית ומשמש בפרוטוקול זה מצויד במטרות הגדלה נמוכה (2.5X) וגבוהה (40X) לתצוגה בהגדלה נמוכה של ההיפוקמפוס, כמו גם מיקרוסקופ וידאו אינפרא אדום ואפיפלואורסנציה לזיהוי תא יחיד. המרכיבים של מערכת זו כוללים מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף, קוביות מסנן פלואורסצנטיות, מצלמת וידאו אנלוגית ותופס פריימים דיגיטלי עם תוכנת הדמיה, תא זילוח מותאם אישית על הבמה (איור 2A, inset i), ומיקרומניפולטורים בדיוק גבוה עבור הקלטות עצביות ומיקום סיבים אופטיים.
   2. השתמש במצלמה המותקנת על המיקרוסקופ ומחוברת לצג מחשב כדי לבדוק את הכנת ההיפוקמפוס תחת הגדלה נמוכה (2.5X) ולבדוק במהירות שאין חתכים או נזק למשטח החיצוני. הסידור המכוון באלכסון של סיבי נאדיות לאורך פני השטח החלקים של CA1 אמור להיות גלוי (איור 2A, כניסה ii) כאשר אור מאיר מועבר דרך ההיפוקמפוס.
   3. השתמש ביעד השדה הרחב בהגדלה נמוכה כדי להציג את ההיפוקמפוס המבודד ואת המיקום של אלקטרודות LFP במיקומי הקלטה ספציפיים.
      הערה: פריסה של הכנת ההיפוקמפוס המבודד עם אלקטרודות מרובות הממוקמות במיקומי הקלטה שונים מודגמת באיור 2A.
   4. הורידו אלקטרודת LFP לתוך האמבטיה עד שהיא נוגעת בפני השטח (alveus) של אזור CA1.
      הערה: זה בדרך כלל מייצר ארעיות מהירה בהקלטה מצומדת AC, בדומה למה שקורה כאשר האלקטרודה באה במגע עם מדיית ההקלטה. צג שמע יכול להיות שימושי להאזנה לאות ערוץ LFP לאחר שלב זה.
      הערה: לעתים קרובות, סימנים מוקדמים של פעילות יופיעו רק לאחר 10 - 15 דקות, ולכן חשוב לא להתקדם במהירות לתוך ההכנה. אם לאחר תקופה זו, אלקטרודת ה-LFP שעל פני השטח עדיין לא קולטת פעילות, התקדמו עוד קצת למטה דרך אורני השכבה ועצרו מעת לעת כדי לראות אם מתעוררת צורה כלשהי של פעילות תוך כדי התקרבות לשכבת התא העיקרית. אם שום דבר לא מזוהה לאחר 5 - 10 דקות נוספות, בזהירות למשוך את האלקטרודה ולמקם אותה במקום אחר לאורך אותו אזור.
   5. מקדמים את אלקטרודת ה-LFP דרך השכבה הפירמידלית. שימו לב שפעילות הספייקינג החוץ-תאית מתגברת בתחילה כאשר מתגלה פריקה של יחידה אחת מתאי עצב בודדים (בעיקר תאי סל פירמידליים ומעכבים). הנמיכו את האלקטרודה עוד יותר ושימו לב שהדוקרנים מתחילים לדעוך שוב כאשר הקצה חוצה את הרדיאטום. שימו לב שתנודת רשת נראית בבירור בתחום תדרי התטא (4 - 12 הרץ) מתגלה ומגיעה למשרעת מקסימלית (~ 100 - 300 μV) כאשר מיקום ההקלטה יורד דרך הרדיאטום.
2. תנודות תטא על פני אזור יחיד
   1. כדי לבחון את התכונות המרחביות של תנודות תטא ספונטניות על פני אזור CA1, מקם את קצה אלקטרודת הייחוס LFP באתר CA1 מדיאלי (הממוקם מדיאלית לאורך ציר המחיצה-טמפורלי האורכי) והורד אותו לתוך הרדיאטום כפי שתואר קודם לכן.
   2. מקמו אלקטרודת LFP שנייה באתר CA1 (200 - 800 מיקרומטר מחיצה או טמפורלית מה- LFP הראשון) ושימו לב שתנודות תטא CA1 יכולות להסתנכרן על פני מרחקים גדולים יחסית.
3. תנודות תטא על פני שכבות
   1. כדי לבדוק את התכונות של תנודות תטא על פני שכבות ההיפוקמפוס, השאר אלקטרודת LFP ייחוס באתר רדיאטום CA1. מתחילים ממש מעל שכבת האוריין, מורידים אלקטרודה שנייה לתוך שכבת התא הפירמידלית ודרך הרדיאטום. שימו לב להיפוך הדרגתי של אות ה-LFP (היפוך פאזה יחסי) על פני השכבה הפירמידלית.
      הערה: לדוגמאות מייצגות של סוגי פעילות אלה, ראו איור 2B. דוגמאות לפרופילי עומק למינריים וניתוח צפיפות מקור נוכחית (CSD) הממחישים את האתר של היפוך פאזה בהיפוקמפוסי מבודד פורסמו בעבר.

טבלה 1.

טבלה 2.

איור 1: הליך דיסקציה להכנת היפוקמפוס שלם מבודד.

(a) תצוגה כללית של הגדרת הנתיחה. מימין למעלה: בקבוק תמיסת סוכרוז קר כקרח קרבוגנית (1); למטה משמאל: מגש פלסטיק מלא קרח (2) מחזיק את צלחת הדיסקציה מכוסה בנייר עדשה (3); תא האחיזה הקר המכיל תמיסת סוכרוז (4); וסט של כלים כירורגיים (5). (ב) מבט על מוח העכבר לפני המיסקציה על צלחת הדיסקציה. (ג) שחזור המוח החצוי בתא האחיזה הקר ומבט מוגדל (כניסה) של המיספרה השמאלית של המוח לפני החדרת הקצה הקטן של המרית המצופה מתחת למחיצה. (ד) מרית מצופה הממוקמת מתחת להיפוקמפוס המבודד, לאורך אזור CA1/SUB, עם רקמת המוח הנותרת נשלפת מתחתיה.

איור 2: תצורת ההתקנה להקלטת תנודות תטא במבחנה מההכנה השלמה של ההיפוקמפוס בתא ההקלטה השקוע.

(a) ההיפוקמפוס המבודד מוצג עם פריסה של אזורי ההיפוקמפוס ואלקטרודות מרובות הממוקמות בארבעה אתרי הקלטה שונים המופצים באופן ספטו-זמני (מסומן בכוכביות לבנות). בתצוגת פלטפורמת תא ההקלטה המוצגת לעיל (כניסה i), הכניסה והמוצא לזרימת זילוח מהירה מסומנים במספרים (1, 2). בתמונה המוגדלת של ההיפוקמפוס המוצגת להלן (כניסה ii), אלקטרודה בודדת ממוקמת ב-CA1 האמצעי-טמפורלי, וסיבים של הנאדיות נראים בקלות, רצים באלכסון לכיוון הסוביקולום. S: septal, T: temporal, f/fx: fimbria-fornix. (ב) ייצוג סכמטי של ארגון שכבות CA1 עם עקבות LFP מייצגות שתועדו בו זמנית משכבות אוריינס (אפור) ושכבה רדיאטום (שחור). שימו לב לשלב ההפוך של האותות בין שתי השכבות. Alv: שכבה alveus, PR: שכבה פירמידל, SR: שכבה radiatum. SLM: שכבה Lacunosum Moleculare. (ג) מעקב LFP לדוגמה המציג תנודת תטא ספונטנית שהוקלטה מאזור CA1/SUB (קטע של 20 שניות) ומקטעים מורחבים של 2 שניות (להלן) מהאות הלא מסונן; פס-פס מסונן לתדרי תטא (0.5 - 12 הרץ); גמא איטי (25 - 55 הרץ); וגמא מהיר (125 - 250 הרץ).