חקר ההשפעה של חומרי הדברה על Caenorhabditis elegans נוירונים

1. הכנת פלטות פטרי מצופות חומרי הדברה

1. הכינו צלחות אגר פטרי (קוטר 6 ס"מ עובד הכי טוב) בהליכים סטנדרטיים.
   הערה: ניתן להכין אותם חודשים מראש ולאחסן אותם במקרר עד לשימוש. הביאו את הצלחות לטמפרטורת החדר (RT) על הספסל. ברוב המקרים, יש לספק לקבוצות התלמידים צלחת עבור כל דילול של תערובת חומרי ההדברה, כולל בקרת מים.
2. הכינו 1 מ"ל מכל דילול של חומר ההדברה הנבחר בצינורות מיקרופוגה מסומנים של 1.5 מ"ל. לטיפול בטוח, הקפד לקרוא את ההוראות ולספק כפפות או לעבוד במכסה מנוע, אם מוצע.
   הערה: דילולים מומלצים לבדיקה: 1 מ"ל חומר הדברה בחוזק מלא, דילול 1:10 במים (100 מיקרוליטר חומר הדברה, 900 מיקרוליטר מים מזוקקים), דילול 1:100 (10 מיקרוליטר חומר הדברה, 990 מיקרוליטר מים), דילול 1:1000 (10 מיקרוליטר של דילול 1:10, 990 מיקרוליטר מים) ועוד.
3. הכינו מפזר תמיסה על ידי כיפוף זהיר של פיפטת פסטר מזכוכית (בגודל 9 מ"ל) בלהבת מבער בונזן. השתמשו בלהבה כדי לסגור את פתח הפיפטה. לאחר מכן יש לעקר אתנול את המפזר לפני כל מריחה על צלחת הפטרי.
4. בעזרת מיקרופיפטה, מניחים 100 μL של הדילול (או בקרת המים) על מרכז האגר ומפזרים בעדינות על פני השטח עם המפזר המעוקר. יש לעקר מחדש את המפזר לפני כל שימוש.
5. הניחו בצד את צלחות הפטרי מכוסות, ותנו לתמיסה להיספג במשטח עד "יבש".
   הערה: בהתאם לחומרי ההדברה ולרמות הלחות במעבדה, זה עשוי לקחת קצת זמן. ייתכן שהתלמידים יצטרכו להכין את הצלחות שלהם יום לפני תקופת החשיפה.
6. לתקופות חשיפה ארוכות מ-12 שעות, יש להוסיף 50 מיקרוליטר של תרבית לילה של Escherichia coli לצלחות לפני הוספת הנמטודות. עבור ניסויים חריפים (12 שעות או פחות), אין צורך שיהיה E. coli על הצלחות.

2. הוספת נמטודות לצלחות מצופות חומרי הדברה

הערה: התלמידים יצטרכו לקבל צלחת של נמטודות בוגרות (תרביות 5 ימים הן הטובות ביותר) של הזן הפלואורסצנטי LX929, הזמין מהמרכז לגנטיקה Caenorhabditis elegans. ישנם שני הליכים אפשריים לכך. אם לתלמידים היה ניסיון קודם בעבודה עם נמטודות (לדוגמה, אם הליך זה הוא חלק מתרגיל רב-שבועי והם כבר למדו כיצד לבחור נמטודות באמצעות בחירת תולעים), השתמש בשלב 2.1. אם לא, השתמש בשלב 2.2.

1. קטפו נמטודות עם קוטף תולעים. עצבו בחירת תולעת מחתיכת חוט פלטינה 1 אינץ' שנמסה לפיפטת פסטר באמצעות להבת מבער בונזן. הרימו גוש קטן של E. coli דביק על הפיק ואז הרימו נמטודות בוגרות באמצעות הגוש הדביק. לקבלת גודל מדגם הגון, בחר 10 נמטודות עבור כל צלחת טיפול.
   הערה: תלמידים ללא ניסיון רב יכולים לבצע את השלבים 2.2-2.3.
2. השתמש micropipette כדי להניח 1 מ"ל של מים סטריליים על צלחת של נמטודות. ערבבו את המים מסביב כדי להרים את הנמטודות, ואז הסירו את הנוזל עם הנמטודות לצינור מיקרופוגה של 1.5 מ"ל.
3. תן לנמטודות להתיישב על ידי כוח הכבידה במשך כ -10 דקות, ואז בזהירות להסיר לפחות 500 μL של המים ולהשליך. השהה מחדש את הנמטודות, ובעזרת קצה פיפטה צהוב חתוך, הסר 50-100 מיקרוליטר של תולעים תלויות לכל צלחת טיפול. ודאו שבכל צלחת יש לפחות 10 תולעים בוגרות.
4. הגדר טיימר, או ציין את השעה, וחשוף את הנמטודות ב- RT לפרק הזמן שנבחר. בזמן החשיפה שנבחר, הכינו שקופיות מיקרוסקופ לתושבות רטובות. את השקופיות יש לבצע באותו יום כמו microscopy.
   הערה: קבוצות הסטודנטים יבחרו את זמן החשיפה שלהם במהלך תכנון המחקר העצמאי שלהם.

3. הכנת שקופיות מיקרוסקופ לתושבות רטובות

הערה: שלבים 3.1-3.3 יכולים להתבצע על ידי כל קבוצת תלמידים. הכינו שלוש שקופיות כל אחת.

1. הכן שתי שקופיות על-ידי הצבת פיסת נייר דבק בצד אחד בלבד של השקופית. הסרט משמש ליצירת העובי הנכון עבור האגרוז ליצירת כרית בעובי אחיד. לאחר מכן מקם ביניהם שקופית נקייה שאינה בשימוש על הספסל, כפי שמודגם באיור.
2. השתמש במיקרופיפטה כדי להניח טיפה של 10 μL של אגרוז מומס (3% במים מזוקקים פעמיים (ddH₂O), שחומם באמצעות מחמם בלוק יבש של 65 מעלות צלזיוס) על מרכז המגלשה שבאמצע.
3. שטח את הטיפה על-ידי הנחת שקופית נקייה נוספת למעלה, בניצב לשקופית עם הטיפה, כפי שמוצג באיור. שיטחו על ידי הפעלת לחץ כך שנפילת האגרוז תיצור את עובי סרט התיוג.
4. האגרוז יתמצק תוך כדקה. לאחר מכן, הפעילו לחץ יציב כדי להפריד בין שתי המגלשות. מעגל האגר ייצמד לאחת המגלשות. הניחו את המגלשה הזו, אגר כלפי מעלה, על הספסל, והניחו לה להתייבש במשך 1-2 דקות לפני השימוש.

4. הרכבת נמטודות חיות לשקופיות מיקרוסקופ

1. כדי להוסיף נמטודות לשקופית המוכנה עם כרית האגרוז, הוסף טיפת מים של 5 מיקרוליטר המכילה 1 M נתרן אזיד (NaN₃) לכרית האגר. תמיסה זו מרדימה את התולעים ומשתקת אותן.
   זהירות: תמיסת מלאי נתרן אזיד עלולה לגרום למחלה אם היא נבלעת.
2. לאחר מכן מעבירים נמטודות (לפחות 10 בכל שקופית טיפול) לטיפה באמצעות בורר תולעים. לעקר את הקטיף לפני ואחרי השימוש בו כדי להעביר נמטודות.
3. השתמש במלקחיים כדי להוסיף כיסוי על ידי הנחתו בזווית והורדתו לאט. מנע מהחלקה להחליק או להוריד מהר מדי באמצעות עיפרון או בדיקת מתכת.
4. הניחו את התושבת הרטובה המוכנה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לצפות בתולעים, תחילה תחת הגדלה של פי 10 וניגודיות פאזה, ולאחר מכן תחת הגדלה של פי 40 עם ניגודיות פאזה ותאורת פלורסנט.

5. מיקרוסקופ פלואורסצנטי

הערה: קבוצות תלמידים צריכות להכין הרכבה רטובה של כמה תולעים מכל סוג על שקופיות מיקרוסקופ נפרדות, שעליהן לתייג בהתאם. ההוראות הבאות הן טיפים כלליים לגבי השימוש במיקרוסקופ תרכובת פלואורסצנטית סטנדרטית שיכול להיות בעל מערך טרינוקולרי מחובר, מצלמה דיגיטלית ומערכת מחשב. התלמידים צריכים להכיר את הגדרות המיקרוסקופ, כולל המטרות, סוגי מסנני האור, היכולת לעבור בין שדה בהיר לאור פלואורסצנטי, כיצד לשלוח את אות האור למצלמה הדיגיטלית וכו '.

1. הניחו תושבת רטובה מוכנה אחת בכל פעם על במת המיקרוסקופ ואבטחו אותה במקומה באמצעות אטבי שלב המיקרוסקופ.
2. התחל להציג את התושבות הרטובות על ידי צפייה ראשונה עם מטרת ההגדלה הנמוכה ביותר, שהיא בדרך כלל פי 10, והשתמש בשדה בהיר או בניגודיות פאזה כדי להמחיש ולהתמקד בנמטודות.
3. ברגע שנמטודה ממוקמת בשדה הראייה, התמקדו בה באמצעות ידית המיקוד העדינה במיקרוסקופ. העבר את התאורה לפלואורסצנטיות על ידי סיבוב החוגה. לאחר מכן כוון את האור למצלמה כדי ללכוד את התמונות הדיגיטליות. התאימו את התאורה באמצעות תוכנת ההדמיה כך שהנוירונים יהיו מוארים בבהירות אך לא רוויים יתר על המידה.
4. בשלב מסוים, קבל תמונה נפרדת של סרגל באותה הגדלה כמו תמונות התא כדי לספק קנה מידה להגדלה עבור האיור שלהם. הניחו קטע קצר של סרגל שקוף, או שקופית מיקרומטר, על במת המיקרוסקופ, התמקדו בו באמצעות ידית המיקוד העדינה, וקבלו תמונה באמצעות תוכנת ההדמיה.
5. קבל תמונות נוספות (מלפחות 10 נמטודות נפרדות) בהגדלות גבוהות יותר, במידת האפשר. סביר להניח שהאור החזק ילבין את האזור שממנו הוא מצולם, לכן עקבו בקפידה אחר ההדמיה ואל תאפשרו לאור להישאר באותו אזור במגלשה לפרקי זמן ארוכים. הקפד לתת שמות לתמונות שנרכשו כדי לעקוב אחר הנמטודה והאזור, כמו גם אחר הטיפול וההגדלה.
6. צור תיקיה במחשב והעבר את התמונות לתיקייה לשימוש בניתוח ובהכנת דמות.

6. סולם הערכת שלמות מורפולוגית

הערה: מאפיין ציטולוגי מרכזי של נזק נוירודגנרטיבי בתאי עצב הוא שינוי במורפולוגיה של הסומה. ישנן שלוש מורפולוגיות שניתן לראות ולספור בקלות.

1. ספרו את תאי העצב עם תהליכים פלואורסצנטיים חלקים ואחידים וגופי תאים לא עגולים כרגיל, כפי שמוצג באיור 1 ו-2.
2. לעתים קרובות, הסומה הופכת מעוגלת ונפוחה למראה בהשוואה לתאי עצב בריאים וצעירים. ספרו את תאי העצב שנראים כך כ"מעוגלים".
3. נוירונים עם תהליכים עצביים ארוכים יכולים להציג blebbing, שבו יש puncta מעוגל או אפילו פערים בתהליכים. ספרו את תאי העצב שמראים את התכונות האלה כ"מפוצצים".

איור 1: הערכת ההשפעות של חומר הדברה המכיל ניאוניקוטינואידים על מורפולוגיה של נוירונים. (A) נוירונים כולינרגיים לא מטופלים מהזן הפלואורסצנטי LX929. (B) נוירונים כולינרגיים שנחשפו לחומרי הדברה (T+S). (C) אחוז תאי העצב שמפגינים דממה בשני התנאים. קווי שגיאה הם השגיאה הסטנדרטית של הממוצע. מציין p < 0.001 מ-ANOVA חד-כיוונית. בסך הכל נותחו 113 תאי עצב מ-12 נמטודות בודדות. נתון זה שונה מ Bradford et al. (2020).

תרשים 2: השפעות חומר הדברה המכיל מנגן על מורפולוגיה של נוירוני דופמין. קבוצת הסטודנטים לא סיפקה סרגל קנה מידה לדמות שלהם, אלא צילמה את התמונה בהגדלה של פי 40. (A) סומא עצבי CEPDL ו-CEPVL (מסומן) בתולעי ביקורת. נוירון הראש השלם סומא והתהליכים שלהם מצביעים על חוסר התנוונות. (B) תהליכי CEPD L&R פוטטיביים (כוכבית) ו-CEPV L&R neuronal soma (מסומן) בתולעים החשופות בחריפות. הסומה והתהליכים ביטאו GFP, אך נראה שיש דעיכה בביטוי GFP בתהליכים גביים. (C) סומא עצבי CEPDL ו-CEPVL (מסומן) בתולעים החשופות באופן כרוני. הסומא לא ביטא GFP, והתהליכים לא נראו לעין, מה שמעיד על ניוון משמעותי.