גרימת פגיעה מוחית טראומטית חודרת בזבובי דרוזופילה בוגרים

1. פגיעה מוחית טראומטית חודרת (PTBI; איור 1)

1. מיין זבובי F1 שזה עתה נסגרו. בחר זכרים צעירים תוך 6 שעות לאחר האקלוזיה. הניחו את הזכרים הללו בבקבוקונים נקיים המכילים מזון, עם 40 זבובים או פחות בכל בקבוקון.
   הערה: זה מושג בקלות רבה יותר באמצע הבוקר על ידי הרדמת זבובים על כרית CO₂ וזיהוי זכרים בוגרים שעדיין יש להם מקוניום (הנראה ככתם ירקרק כהה דרך דופן הבטן) במעיים.
2. חיטוי סיכות Minutien (ראה טבלת חומרים) למשך 5 דקות לפחות על ידי הנחת ~100 פינים בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל מלא ב-70% אתנול.
3. יש לחטא את כרית ה-CO₂ ואת מברשת הצבע על ידי ריסוס 70% אתנול ולנגב עם טישו נקי ונטול מוך. לאחר שהכלים נקיים ויבשים, העבירו 40 זכרי F1 ממוינים או פחות בחזרה למשטח הנקי.
4. הפרד את זכרי ה-F1 ל-2 קבוצות על משטח הזבוב. קבוצה אחת תשמש כביקורת, זבובים לא פצועים. קבוצת הניסוי השנייה תהיה נתונה ל-PTBI.
5. בעזרת מלקחיים, משוך 4-5 פיני Minutien חדשים מתוך צינור המיקרו-צנטריפוגה והנח אותם ליד קצה כרית CO₂. תחת טווח הניתוח, בחר סיכת Minutien ישרה עם חוד חד.
   הערה: שימוש בסיכת מינוטיין בודדת לניסוי יפחית את השונות. שימוש חוזר בסיכות חדות. הנח פינים פגומים או קהים בצינור מיקרו-צנטריפוגה נפרד בנפח 1.5 מ"ל המכיל 70% אתנול לסילוק בטוח.
6. אם אתה עובד עם זבובים מהצלב הסטנדרטי, הפעל את מנורת הדיודה פולטת האור (LED) של מיקרוסקופ הסטריאו המצוידת במסנני העירור והפליטה המתאימים לחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). זה מאפשר עירור ב-440-460 ננומטר ומאפשר הדמיה של 500-560 ננומטר.
   הערה: עם המנורה וערכת המסננים הזו, גופי התאים של גוף הפטרייה יזוהרו בירוק דרך ציפורן הראש (איור 1C). עבור זבובי פרמה-תאומים או זבובים מגנוטיפים אחרים, ניתן להשתמש במאיר אור לבן סטנדרטי עבור מיקרוסקופ סטריאו כדי להמחיש ציוני דרך על ציפורן הראש כדי למקד את הפגיעה בגוף הפטרייה (איור 1C).
7. השתמש במלקחיים כדי להרים ולהחזיק את סיכת Minutien שנבחרה ביד אחת (לאנשים ימניים, זו בדרך כלל יד ימין) ואת המכחול ביד השנייה (בדרך כלל שמאל). בחרו זבוב מקבוצת הניסוי ומקמו את הזבוב כך שתהיה לכם מבט גבי על קפסולת הראש עם ראש הזבוב ימינה. הנח את המברשת על החלק הקדמי של בית החזה הגבי ודחף כלפי מטה בעדינות כדי לייצב את הזבוב.
8. כוונו את קצה סיכת ה-Minutien אל גופי התאים של גוף הפטרייה בצד ימין של הראש וחדרו לקפסולת הראש. אם משתמשים בציוני דרך, התמקדו בציפורן הראש הגבי בין האוקלי לשפת הגב של העין (איור 1).
9. לאחר השלמת הפציעה, השתמש במכחול כדי לדחוף את הראש מסיכת ה-Minutien בעדינות.
10. אם אתם משתמשים במוח עבור RNA-Seq או qRT-PCR, בצעו פגיעה שנייה בצד שמאל של הראש.
11. חזור על שלבים 2.8-2.10 כדי לפצוע את כל הזבובים בקבוצת הניסוי.
12. לאחר שכל הזבובים נפצעו, הנח את הביקורת והזבובים הפצועים בבקבוקונים מסומנים ונפרדים המכילים מזון. הניחו את הבקבוקונים בצורה אופקית (כלומר, על הצדדים) בזמן שהזבובים מתאוששים מההרדמה ובמהלך ההזדקנות שלאחר מכן כדי למנוע מהזבובים להיתפס במזון.
13. הנח זבובי צלב סטנדרטיים ב-25 מעלות צלזיוס, וזבובי פרמה-תאומים ב-30 מעלות צלזיוס ליישון.
14. עבור זבובים שגילם עולה על 24 שעות, הניחו אותם על מזון נקי כל 1-2 ימים.

איור 1: פגיעה מוחית טראומטית חודרת (PTBI) למוח המרכזי של דרוזופילה במבוגרים. (A) סכמטי של החלק החיצוני של ראש זבוב בוגר. זוהי תצוגה חזיתית. לפיכך, הצד הימני של החיה נמצא משמאל לצופה. (B) סכמטי של החלק הפנימי של ראש דרוזופילה בוגר עם מסלול הפציעה המסומן באפור. זוהי השקפה אחורית. לפיכך, בתמונה זו ובאיורים הבאים, הצד הימני של המוח נמצא מימין. PTBI של המוח המרכזי משפיע על מבני מוח מרובים, כולל גוף הפטריות (ירוק) ורקמות מחוץ למוח, כולל גוף השומן (כחול) והמוציטים (אדום). CB = אזור מרכזי במוח. OL = אזור האונה האופטית. (C) מבט גבי של ראש בוגר חי שבו גופי פטריות (ראשי חץ) מסומנים בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). זהו 'הגנוטיפ הסטנדרטי' (ראה טקסט לפרטים). פרוטוקול PTBI מביא באופן שחזורי לפגיעה בגופי הפטריות.