ניתוח פונקציונלי של מעגל האכלת הזחל ב דרוזופילה

DOI: 10.3791/51062

November 19, 2013

Parag K. Bhatt¹, Wendi S. Neckameyer¹

¹Department of Pharmacological and Physiological Science,Saint Louis University School of Medicine

דרוזופילה היא מערכת מודל חזקה מאוד ללימוד פיתוח מעגלים עצבי בשל זמן דור מהיר, עלות ניסוי נמוכה, והיכולת לתפעל ולשלוט בגורמים גנטיים וסביבתיים. נוירוגנזה, ממצא נתיב עצבי וsynaptogenesis הם נשמרים בין בני האדם ודרוזופילה, ולכן המנגנונים ביצירה, שמירה ושינוי מעגלים עצביים הנשמרים גם כן.

נוירוטרנסמיטורים קלאסיים, כגון סרוטונין (5-hydroxytryptamine, או 5-HT) יכולים לשמש כגורמי גדילה לפני אימוץ תפקידיהם כמולקולות איתות במעגלים העצביים הבוגר ^1-3 מחקרים קודמים הראו כי מוטרדים רמות של 5-HT בעובר לשנות את הקישוריות של נוירונים בוגרים ^4. אחרים הראו כי יישום מחוץ לרחם של 5-HT לנוירונים בתרבית Helisoma להדחיק תולדת neurite כמו גם synaptogenesis ^5-7. בDrosophila, רמות 5-HT התפתחותיים הם הפוך קשורים למספר דליות וגודל, כמו גם את מידת aborization, לאורכו של neurites מקרינה למעי הקדמי ממערכת העצבים המרכזית ^8.

עצבית סרוטונין הוכח לווסת את התנהגויות האכלה במינים שונים, ובכלל זה דרוזופילה ^8-9. מעגל ההאכלה בדרוזופילה הוא מעגל פשוט יחסית שיכול לשמש כמודל, כדי לקשר את הפלט הפונקציונלי (האכלה) עם שינויים בהתפתחות תחזיות axonal מהמוח אל המעי הקדמי. Schoofs et al. הראו כי האכלת זחל דרוזופילה מוסדרת על ידי גנרטורים דפוס מרכזיים המשפיעים על מערכת השרירים ^10. בעוד האנטומיה שרירים הספציפית אינה מובנת לחלוטין, זה כבר הראה כי העצבים מחושים, עצב לסתי, ועצב אבזר prothoracic אחראים למטרות שרירים מעורבות בהתנהגות אכילה. רוב הנתונים מעורבים האנטומיה השרירים ועצבים של האכלה חסר חוליות מוגבלים לזחלי Calliphora.

שיעור ההאכלה של זחלי instar שני ניתן להעריך על ידי הכחשה של sclerites cephalopharyngeal (ווי פה), וניתן לשחזור ותפוקה גבוהה. צלחות cephalopharyngeal מעוצבבים על ידי סיבים מתא עצב 5-HT המרכזי דרך העצב חזיתית. Proventriculus, או המעי הקדמי, הוא מעוצבבים על ידי סיבי serotonergic (recurrens עצב) שfasciculate בmidgut ואחראים להתכווצויות של המעי הקדמי (איור 1) ^11-12. שינויים בהסתעפות באקסון והמספר והגודל של ורידים לאורך neurite, ניתן ונרשמת תוך שימוש בטכניקות immunohistochemical. מניפולציה 5-HT העצבי במהלך פיתוח, במישרין או בעקיפין, יכול לשנות את הפלט הפונקציונלי של מעגל הזנה זו, שניתן להעריך ומתואם עם שינויים בmorpholoGY של ארכיטקטורת neurite.

1. תחזוקה של כלובי אוכלוסייה

1. לשמור על כלובי אוכלוסייה ב ° C25 על מחזור אור חשוך שעות 12. כל עוד קבוצות ביקורת והניסוי נחשפות לאותם תנאי התאורה, אז בטכניקה זו ניתן לבצע בסביבת מעבדה סטנדרטית.
2. אפשר לנקבות להטיל את ביצי לילה על צלחות מיץ תפוחים אגר.
3. לאסוף זחלים שבקעו זה עתה על ידי שמירה על צלחות עם ביצים שהופקדו זה עתה ב25 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. מניחים מנה קטנה של שמרים במרכז הצלחת למשוך זחלים שבקעו.
4. אסוף 1 זחלי instar ^st שהגרו לשמרים להדביק במרכז צלחת מיץ תפוחים. השתמש במרית מתכת להעביר אותו לצלחת מיץ תפוחים טרי. שמרי רסק נוסף ניתן להוסיף על מנת להבטיח שיש מזון מתאים עד מבחני מבוצעים. גם צלחות מיץ ענבים ניתן להשתמש במקום של צלחות מיץ תפוחים.
5. השג l מאוחר 2 ^{nd-מוקדם} 3 ^rd instararvae ידי מתן 1 ^st instars לגיל ל40-48 שעה. בטווח זה שיעורי ההאכלה קבועים ^13. גיל יכול להיות מאושר על ידי בדיקה של הפה הווים כפי שיש שינויים ברורים במבנה הזה עם כל נשירת זחל.
6. זחלים המאוחר 2 ^{nd-מוקדם} 3 ^rd instar נאספים עבור מבחני התנהגות על ידי בעדינות ולשטוף בהרחבה צלחות מיץ תפוחים עם מים ואיסוף הזחלים על מסנן רשת. הזחלים ואז הועברו לצלחת אגר.
7. כל הניתוחים מבוצעים במקביל באמצעות שליטה וחיות מעבדה.

2. פרדיגמה התנהגות - נידות

1. הנח זחל instar 3 ^rd בודד על מצע אגר 2% בצלחת תרבית רקמת 100 מ"מ ולאפשר את הזחל להסתגל ל30 שניות. זחלים להשתמש sclerites cephalopharyngeal (ווי פה) כדי להניע את גופם על פני השטח של המצע אגר. הדבר נעשה על צלחת נפרדת כי אנילא קשה יותר לדמיין את הגוף של ההתכווצויות בשמרי הפתרון כמו בעלי החיים הוא כמעט באותו הצבע כמו השמרים.
2. לצפות ולהקליט כל תנועה אחורית לקדמית מעל המצע לתקופה של 1 דקות. n = 20 עבור כל גנוטיפ. לא יותר מ 10 בעלי חיים צריכים להיות assayed לכל צלחת.

3. פרדיגמה התנהגות - האכלה

1. שימוש Inox # 5 פינצטה בוטה, בזהירות להעביר את זחל instar 3 ^rd מהצלחת אגר של תנועה למרכז צלחת מלאה אגר ועליהן 5 מיליליטר של שמרי הפתרון של 2% אופה הופעל. ודא כי הפתרון הוא הומוגני כמו השמרים יישבו לאורך זמן. כאשר בשמרי הפתרון, זחלים יישארו במידה רבה במקום ומזון, הקלה על תצפית של ההתנהגות. שיעור התכווצויות וו פה ישירות בקורלציה עם כמות המזון ingested ^14.
2. לאפשר זחל להסתגל ל30 שניות.
3. לצפות ולהקליט את מספרהתכווצויות וו פה לתקופה של 1 דקות. n = 20 עבור כל גנוטיפ.

4. וניתוחי גוט הזחל

1. בצע פתרון קיבעון פורמלדהיד כיתה EM 4% בתמיסת מלח 1x שנאגרו פוספט (PBS) ומקום בכוס מקום 3 היטב.
2. לנתח בזהירות נדודי אומץ זחל instar 3 ^rd מאוחר בצלחת זכוכית 3 היטב באמצעות פתרון 1x PBS, ולוודא בכל פעם שproventriculus נותר בשלמותה. עם מלקחיים אחד, החזק את הקצה האחורי, ועם אחרים, להחזיק את הפה הווים. בעוד מחזיק נייח הסוף האחורי, משוך בעדינות על ווי הפה כדי לקבל גישה לאומץ. הסר את כל רקמות קשורות (בלוטות רוק, מוח, גוף שומן, וכו '), לאחר מכן להעביר את כל בטן למנת 3 המכילה גם את תיקון פורמלדהיד. נדודי 3 זחל instar ^rd משמשים כי בשלב זה של פיתוח, הזחל מפסיק האכלה בהכנה לpupariation, וproventriculus מנוקה של שמרים.
<li> דגירה אומץ ב 4 ° C למשך הלילה בתיבת תרבית רקמה אטומה.
3. לפני הסרת פתרון קיבעון פורמלדהיד מבארות, להסיר את caeca הקיבה וקליפ midgut ~ 150 מיקרומטר ² מproventriculus כך שבבירור ניתן לראות תחזיות ללא מכשול.
4. הסר לתקן פורמלדהיד מהבארות ולהחליף עם 1x PBT (1x PBS, 0.1% אלבומין בסרום שור ללא פרוטאז, 0.1% X-100 טריטון) פתרון חיץ. ביסודיות לשטוף את אומץ 6x עבור 10 דקות ב 1x PBT. הנח דגימות רקמה על הכתף מכאני בעת עושה כביסות.
5. דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 ב10 ^-6 M 5-HT כדי לשפר את האיתות של סרוטונין. ביסודיות לשטוף את אומץ 6x עבור 10 דקות ב 1x PBT. המחקרים קודמים הוכיחו כי זה ריכוז של 5-HT אקסוגניים אינו משפיע על ארכיטקטורה עצבית או צפיפות דליות בניתוחי immunohistochemical ופשוט משפר את האות ^ל15-16 יחס רעש.
6. דגירה על 4 &# 176; C למשך הלילה בנוגדן ראשוני נגד סרוטונין (חד שבטי שהועלה בעכבר או polyclonal גדלה ארנב). ביסודיות לשטוף את אומץ 6x עבור 10 דקות ב 1x PBT. הנח דגימות רקמה על הכתף מכאני בעת עושה כביסות.
7. לדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות בשני נוגדנים (IgG 568 העז אנטי עכבר או נגד הארנב אלקסה פלואוריד; 1:400 דילול). ביסודיות לשטוף את אומץ 6x עבור 10 דקות ב 1x PBT. הנח דגימות רקמה על הכתף מכאני בעת עושה כביסות.
8. דגירה ב4 סודיום קרבונט מ"מ עבור 10 דקות על הכתף מכאני, ואז לעלות ב4% סודיום קרבונט n-propyl gallate/20 מ"מ, ולהציג תחת הקרינה. סודיום קרבונט משמש כדי להמיר את הדגימות למאגר וה-pH בשימוש בתקשורת mountant.
9. צלם תמונות של דגימות רקמת immunostained בהגדלה 400X לניתוח.

5. ניתוח עצבי המעגלים

1. סיבי neurite היו לכמת (מספר וגודל של ורידיםומידת הסתעפות) באמצעות Neuroleucida וNeuroexplorer. עם זאת, זה גם יכול להיות מושלם באופן ידני או באמצעות פשוט neurite Tracer (יישום חינם שניתן להוריד באינטרנט).
2. עקוב אחר תחזיות סיבים בודדות מהמוח אל proventriculus ולכמת מספר דליות, סניפים ומספר ורידים גדולים ליחידת אורך. סיבי העצב מקרינים מהמוח הם ארוזים לתוך עצב recurrens ואינם נגישים לניתוח עד שהם מגיעים proventriculus שבו הם נפרדים וfasciculate.

מעגל האכלת serotonergic בזחל דרוזופילה יכול לשמש כמודל יעיל מאוד כדי לבחון את השפעתם של גורמים מסוימים בהתפתחות מערכת עצבים. על ידי quantitating שיעור האכלה, אפשר לקשר את ארכיטקטורת אקסון של מעגל ההאכלה עם הפלט הפונקציונלי שלה (איור 1). Assay של תנועה משמש כביקורת פיזיולוגית להכחשות של קרסי הפה, שכן זחלים להשתמש קרסי הפה שלהם כדי להניע את עצמם על פני השטח של אגר. לא צריך להיות שום הבדל בתגובות של תנועה בין בקרה וגנוטיפים מוטציה אם המוטציות משפיעות רק על 8 (איור 2 א) במעגל ההאכלה. אם הבדלים משמעותיים לעשות להתרחש, זה אפשרי התנהגות הזחל נפגעה על ידי טיפול לא נכון. אם תחנת הזחלים במהלך assay כדי לנסות לחדור דרך המצע אגר, הם עשויים להיות זקנים מדי, וסביר להניח שמעבר לנדודי instars.אפשר גם המצע אגר עשוי להיות קשה מדי, ובכך הופך אותו קשה לפי ווי זחל כדי לתפוס את המצע אגר, זה יכול להיות מטופל על ידי הרטבת השטח אגר.

assay זה יכול לשמש כדי להעריך אם זני דרוזופילה עם מומים אנטומיים עצביים משפיעים על התפתחות של מעגל הזנת serotonergic. גוף אליפסואיד המוטציה הפתוח (EBO 3) יש פגם מבני בגוף אליפטיים של המתחם המרכזי. השוואה עם הזן הפראי סוג ההורים קנטון-S, CS וו, מגלה כי ליקויים אנטומיים אלה במהלך תוצאת התפתחות המוח בהאכלת דיכאון, בעוד שתנועה אינן מושפעת (איור 2).

המומים אנטומיים בEBO 3 מוטציות מופיעות לשנות את הפיתוח של ארכיטקטורת neurite של המעי. איור 3 מציג את השינויים בארכיטקטורה של סיבים בcompa זחלי EBO 3אדום עם CS וו; זחלים אלה להציג גידול בהסתעפות כמו גם עלייה במספרם של שני ורידים גדולים והקטנים לאורך neurite. שימו לב לצומת הסניף (חיצים), ורידים (ראשי חץ), וורידים גדולים (כוכביות). איור 4 מייצג את לכמת את התמונות האלה.

quantitation נכון של ארכיטקטורת אקסון דורש שהתמונות תהיה ברורות מאוד. איור 5A מייצג תמונה מתאימה לניתוח. תמונות באיכות ירודה יקשו להבחין בין הסיבים והוורידים (איור 5). כאשר מצלם ארכיטקטורת הסיבים, להימנע מלקיחת תמונות הכוללות את התחזיות בקדמיות של proventriculus, שכן הסיבים בחוזקה אלה ארוזים ונפרדים מכל אחד אחרים ועשויים להופיע כאילו הם מסועפים. סיבים האחוריים יותר בתוך midgut הם יותר מסועפים, כי הם fasciculate ברגע שהם מחדש בבתוך רקמה זו. לכמת את סניף ומספר דליות, וגודל של ורידים, ניתן לנתח באופן ידני או באמצעות תכנית שנועדה לצורך חקר מורפולוגיה neurite, כגון Neuroleucida. כל עוד proventriculus לא ניזוק במהלך פרוטוקול immunohistochemical, והתמונה היא בפוקוס, ההכנות תהיה מקובלות להדמיה וניתוח. אם ארכיטקטורת הסיבים היא להבחין בבירור מהרקע, ואם ניתן לזהות ורידים בודדים לאורך neurite, ההכנה מתאימה לניתוח. כמו כן, אם ניתן לזהות ורידים בודדים משאר הסיבים, זה גם אינדיקטור נוסף לאיכות תמונה לניתוח. כל הסיבים מנותחים למעט אלה שמחוץ לטווח של פוקוס (ובמקרים מסוימים הסיבים יהיו עקום בין מטוסים המרובים של פוקוס).

"Width =" es/ftp_upload/51062/51062fig1.jpg "/> 500px
איור 1. מעגל האכלת הזחל. פילה של זחל instar 3 rd מראה רקמות מוח ומעיים (). רקמות גוט גזורים מזחלי instar 3 rd היו immunostained עם נוגדן שהועלה נגד hydroxylase דרוזופילה העצבי טריפטופן (DTRH, B) או 5-HT ( ג)., לינה. E, וושט; MH, ווי פה; Pr, proventriculus; Br, מוח (שים לב לדפוס של נוירונים 5-HT). ראש חץ מייעד את העצב הקדמי; חץ, עצב recurrens C.. proventriculus מראה סיבי עצב (ראשי חץ). בר = 20 מיקרומטר קנה המידה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

<br /> איור 2. מומים אנטומיים בתוצאות התפתחות המוח בדיכאון התנהגות האכלה. החיות היו assayed לשל תנועה () והתנהגויות אכילה (ב '). התנועה הייתה מעושה. n = 20 לכל assay התנהגות, 2-3 ניסויים בלתי תלויים. **** P <0.0001, מבחן t מזווג. קווים מעל הגרף מתארים שגיאת תקן של הממוצע. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3. מומים אנטומיים במהלך פיתוח של מערכת העצבים המרכזית בתוצאות סטייה באדריכלות מעיים סיבים. רקמת גוט גזור מזחלי instar 3 rd וimmunostained עם אנטי-5-HT. חץ מציין צומת סניף. ראש חץ מציין דליות קטנות. דה אסטריסקמציין דליות גדולות. בר = 40 מיקרומטר קנה המידה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 4. מומים אנטומיים בתוצאת התפתחות המוח באדריכלות מעיים סיבים סוטה. ניתוח של רקמת proventricular מזחלי instar 3 rd גזור וטופחו עם אנטי-5-HT. מספר, neurite הסתעפות () של ורידים הכולל לכל אורך 0.1 מ"מ neurite (ב ') ומספר ורידים הגדולים (> 1μm 2) לכל אורך מ"מ 0.1 (C). CS וו, 20 סיבים מ17 אומץ מ2 ניסויים בלתי תלויים; EBO 3, 20 סיבים מ18 אומץ מ3 ניסויים בלתי תלויים. **** P <0.0001, ** p <0.01, * p <0.05 tt, מזווגקווים בהערכה מעל הגרף מתארים שגיאת תקן של הממוצע. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 5. איכות של תמונות היא חשובה כדי לכמת נכון של ארכיטקטורת מעיים סיבים. רקמות גוט גזורים מזחלי instar CS וו 3 וimmunostained עם אנטי-5-HT. (). תמונה באיכות טובה. (ב '). תמונה באיכות ירודה. בר = 40 מיקרומטר קנה המידה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

יש לנו מה למסור.