בידוד והתרבות של שריר לב מאוס למבוגרים לתא איתות ו במבחנה לב היפרטרופיה

שריר לב הוא לא שגשוג. יש כמה שורות תאי cardiomyocyte פרוזדורים, כמו HL-1 ו-AT-1 תאים שמקורם בגידולי פרוזדורי עכבר; עם זאת, אין קווים סלולריים cardiomyocyte חדרית המבוגר זמינים למחקר. תרביות תאים ראשוניות של שריר לב עכבר מבוגר לספק מודל רב עוצמה למחקר לב ברמה התאית ומולקולרית. עד כה, הם היו בשימוש נרחב למחקר ביוכימי, פיסיולוגי, ותרופתי ^1. בנוסף, השימוש התכוף בעכברים מהונדסים גנטי יש חייבת שיטות יעילות של בידוד cardiomyocyte. תרבות טהורה מאפשרת לתנאים חופשיים מאינטראקציה עם איברים אחרים ומחזור המערכתי, כגון באמצעות גורמי neurohormonal ודמוי הורמון אנדוגני ^2,3. עם זאת, בידוד מוצלח של שריר לב יכול להיות מאתגר.

הפרוטוקול אנחנו מציגים כאן מבוסס על החוויות שלנו עם cardiomyocyt חולדה הבוגרתes ואת השיטה שתוארה על ידי או 'קונל ואח' ^4,5. במיוחד ב2007 ^5, הם תיארו טכניקות מפורטות מהכנות חיץ לתרבית תאים וassay הפונקציונלי. מאז myocytes העכבר רגישים מאוד להתכווצות שריר הלב בהשוואה לעכברים, המאגרים או מדיה המשמשים לזלוף, עיכול, Ca ^{2 +} סובלנות, ציפוי והתרבות בפרוטוקול העכבר הם השלימו עם מעכב ספציפי עירור התכווצות צימוד, 2, monoxime 3-Butanedione (BDM) לעכב ההתכווצות הספונטנית שלהם, ומכאן את יכולת הקיום והתשואה של myocytes בצורת המוט לשפר באופן משמעותי. בפרוטוקול הציג כאן, myocytes מופרד בחיץ אשלגן גבוה מהלב המבודד על ידי זלוף Langendorff שונה עם הסוג II collagenase. Collagenase השני שובר בצורה יעילה את המטריצה ​​הבינה תאית ותאים משחרר. פתרון זלוף גם שומר חילוף חומרים תאיים ברמה נמוכה ^6. בadditiב, מערכת הלב המבודדת מהרווארד Apparatus אנחנו משמשים כאן היא מעוצבים היטב לטמפרטורה מדויקת ושליטה בלחץ קבועה ^7. גישה זו מספקת הכנות לשחזור מאוד ואוכלוסיות אחידות מסוג התא בודד, שניתן להשתמש בם בתרבות הלילה למדידת חלבוני איתות או תרבות 2-3 יום למבחני hypertrophic לב.

כל המחקר על עכברים שנעשה על פי נהלים והנחיות של המכון הלאומי לבריאות, והפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת טולדו, המכללה לרפואה ומדעי חיים.

1. הכנת מערכת זלוף

1. היום לפני הבידוד, למלא את כל מערכת זלוף (כולל מאגרים) עם תמיסה של חומר ניקוי ללא שאריות אלקליין מהיר. אפשר הפתרון לספוג לתוך המערכת לכמה שעות או למשך לילה.
2. למחרת בבוקר, כוון את טמפרטורת thermocycler 37 ° C ולאפשר הפתרון כדי להתחמם. הסר את תמיסת הסבון ולשטוף את המערכת ביסודיות עם מים מזוקקים מעוקרים. אל תשכחו את כל הענפים בצד.
3. למלא את המערכת עם חיץ זלוף באמצעות משאבת peristaltic מתמדת ולצייר כל בועות אוויר יצא מהאולם אב העורקים (מלכודת בועה) עם מזרק צד רכוב כדי להגן עלהלב מחסימה כלילית. קצב הזרימה של משאבת peristaltic צריך להיבדק באופן שיגרתי.

2. הכנת חוצץ, תרבות מדיה, וצלחות

1. זלוף הצפת: הפוך 500 מיליליטר של חיץ 1x זלוף לפני השימוש. חיץ סידן ללא זה מכיל 113 mM NaCl, 4.7 מ"מ KCl, 0.6 מ"מ KH ₂ PO _4, 0.6 מ"מ Na ₂ HPO _4, 1.2 מ"מ MgSO _4, 10 מ"מ Na-HEPES, 12 מ"מ NaHCO _3, 10 מ"מ KHCO _3, 0.032 פנול מ"מ אדום, טאורין 30 מ"מ, 10 מ"מ BDM, ו5.5 גלוקוז מ"מ. התאם את ה-pH ל 7.0 עם 2 M HCl ולסנן דרך 0.2 מסנן מיקרומטר, לאחסן ב 4 ° C.
   הערה: א) פתרון זלוף צריך להיות מוכן באותו היום שבו נעשה בו שימוש. במקרים מסוימים, זה מקובל לאחסן את הפתרון בפחות מ 3 ימים ב 4 ° C. ב) יש חיץ זה ריכוז אשלגן גבוה עד 15.3 מ"מ, אשר יכול לשמור על שריר הלב שקט, להפחית ג ה-ATPonsumption ולהגדיל את Ca ^{2 +} היכולת סובלנית.
2. עיכול חוצץ (300 U / ml, 25-50 מיליליטר / לב): להכין רק לפני זלוף. שוקל 15,000 U של פעילות הכוללת של הסוג II collagenase, מתמוסס ב50 חיץ זלוף מיליליטר במכסת מנוע בתרבית. הוסף 25 μl של 100 מ"מ CaCl ₂ (פתרון מניות, מסנן מעוקר) כדי להפוך את ריכוז סידן הסופי 50 מיקרומטר. לחמם את החיץ ל37 מעלות צלזיוס כאשר מוכן לבידוד. שלא כמו טריפסין, collagenase עובד הכי טוב בנוכחות של 50-100 מיקרומטר Ca ^{+ 2.}
3. התחנה חוצץ (50 מיליליטר / לב): לפעול במכסת מנוע בתרבית. מערבבים 45 מיליליטר של חיץ זלוף עם 5 מיליליטר FBS סטרילי.
   1. Ca ^{2 +} פתרון אני (12.5 מיקרומטר Ca ^{2 +):} הוסף 2.5 μl של 100 מ"מ CaCl _2-20 מיליליטר של חיץ לעצור ולערבב.
   2. Ca ^{2 +} הפתרון השני (100 מיקרומטר Ca ^{2 +):} הוסף 10 μl של 100 מ"מ CaCl _2-10 מיליליטר של חיץ לעצור ולערבב.
   3. Ca ^{2 +} פתרון III (400 מיקרומטר Ca ^{2 +}): הוסף 40 μl של 100 מ"מ CaCl _2-10 מיליליטר של חיץ לעצור ולערבב.
   4. Ca ^{2 +} IV פתרון (900 מיקרומטר Ca ^{2 +):} הוסף 90 μl של 100 מ"מ CaCl _2-10 מיליליטר של חיץ לעצור ולערבב.
4. ציפוי בינוני (50 מיליליטר / לב): העברה 43 מיליליטר של ממ המכיל 2 מ"מ L-גלוטמין ו1.26 מ"מ CaCl ₂ לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל סטרילי במכסת מנוע בתרבית ולהוסיף 5 מיליליטר של FBS, 1 מיליליטר של פתרון מניות BDM ( 500 מ"מ, מסנן מעוקר), ו0.5 מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין (10,000 U / ml). לערבב ולאזן במשך 2-3 שעות לפני בידוד myocyte ב2% CO _2, חממת 37 ° C עם כיפות רופפות. ממש לפני ציפוי myocyte, להוסיף 0.5 מיליליטר של 200 מ"מ ATP (pH 7.2, פתרון מניות, מסנן מעוקר) לבינונית.
5. תרבות בינונית (50 מיליליטר / לב): העברה 48 מיליליטר של ממ המכיל 2 מ"מ L-גלוטמין ו1.26 מ"מ CaCl ₂ לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל סטרילי במכסת מנוע בתרבית ולהוסיף 1 מיליליטר של פתרון מניות BDM (500 מ"מ, filter מעוקר), ו0.5 מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין (10,000 U / ml). לערבב ולאזן ב2% CO _2, חממת 37 מעלות צלזיוס לפני בידוד myocyte. לפני השימוש, מוסיף 0.5 מיליליטר של 100 מ"ג / מיליליטר BSA (מסנן מעוקר) לבינוני.
   הערה: שימוש בחממה ₂ CO 2% מאפשר שמירה על רמת חומציות התרבות בינונית ב6.9-7.0, אשר מסייעת myoctyes לשמור עד 24 שעות המורפולוגיה בצורת המוט שלהם.
6. Laminin מנות (1-2 מיקרוגרם / ² סנטימטר) מצופים או צלחות: העברה 200 μl של 1 מ"ג / מיליליטר laminin עכבר טבעי ל20 מיליליטר של PBS מעוקר (w / o סידן ומגנזיום) ומערבבים. הוסף 1 מיליליטר למאכלי 35 מ"מ, 2.5 מיליליטר למאכלי 60 מ"מ, או 5 מיליליטר למאכלי 100 מ"מ, לנער כדי לכסות באופן שווה על המשטחים, ומקום ב2% CO _2, חממת 37 מעלות צלזיוס עד לציפוי myocyte.
   הערה: אם המנות או צלחות לא משמשות ביום המצופה, הם יכולים להיות אטומים עם Parafilm ומאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס (ציפוי איטי) למשך הלילה. איטום הוא requIRED כדי למנוע אידוי וזיהום. יכולות להיות כל הזמן צלחות מצופות על 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע עד 1.

3. ההסרה מאוס לב וCannulation

1. משרים את המספריים ומלקחיים ב70% אתנול ל30 דקות ולתת להם להתייבש.
2. לשקול את העכבר כדי 0.1 גרם הקרוב ביותר. הקלט את משקל הגוף שלה, מתח, מין ותאריך לידה.
3. הזרק 200 הפרין μl (100 IU / עכבר) ip 10 דקות לפני הרדמה כדי למנוע קרישת דם בעורקים הכליליים. להרדים את העכבר עם 200 מ"ג / קילוגרם משקל גוף של קטמין ו10 מ"ג / קילוגרם משקל גוף של xylazine ידי הזרקת ה-IP ולחכות 5-10 דקות עד שהעכבר מפסיק להגיב לצובט זנב / הבוהן.
4. לאבטח את העכבר במצב שכיבה בעדינות על ידי תיקון הרגליים הקדמיות וhindpaws למשטח עבודת pinnable (קלקר כלומר) על מגש ניתוחים בבעלי חיים או ספסל שולחן ליד מערכת זלוף.
5. נגב את החזה והבטן עם 70% אתנול. הפוך עור קו האמצעncision מאמצע הבטן לסרעפת עם מספריים כירורגית.
6. חותכים את הסרעפת עם עוד מספריים כירורגית והחזק את עצם החזה עם מלקחיים משוננים מעוקלים. לחתוך בילטרלי וretroflect כלוב בית החזה כדי לחשוף את הלב.
7. הרם את הלב מעט באמצעות מלקחיים משוננים וatraumatic מעוגלים עדינים ולנתח את הלב מתוך חלל החזה הקרוב ככל האפשר אל קיר בית החזה הגבי.
8. להעביר את הלב לצלחת 100 מ"מ המכילה חיץ זלוף קר. לקצץ בזהירות רקמות חיבור, כגון ריאות, בלוטת התימוס, והסמפונות.
9. זהה את אב העורקים וענפי הגולגולת שלה, אשר בדרך כלל מוסתרים על ידי בלוטת התימוס וכרית שומן. חותכים את אב העורקים מתחת סניפה הראשון ^13, אחוז בקיר אב העורקים, הרם את הלב, ומעט להחליק אותו לצינורית זלוף מלא נוזל אב העורקים (צינורית הנירוסטה OD 1.0 מ"מ עם קצה קהה / שטוח וחריצי 1 ו -2 מ"מ מעל טיפ, או מחט האכלה לשימוש חוזר G 22) באמצעות שני f עדין קצה אולטרהorceps.
   הערה: א) נוזל זלוף צריך להיות נוטף במהלך cannulation לב כדי למנוע בועות גז מלהיכנס לעורקים הכליליים; ב) שמור על הקצה של הצינורית בדיוק מעל שסתום אב העורקים.
10. הצמד את אב העורקים לצינורית ולקשור את אב העורקים לצינורית עם 6-0 משי כירורגית. כל cannulation צריך לקחת פחות מ 120 שניות.

4. לב זלוף ועיכול

1. Perfuse הלב עם חיץ זלוף ללא סידן בקצב זרימה של 4 מיליליטר / דקה על 4-5 דקות עד השפכים יתבהרו, ולאחר מכן לעבור לחיץ עיכול המכיל 50 מיקרומטר CaCl ₂ ותנקבו ל3.5-20 דקות בהתאם לזן עכבר, לחץ זלוף ופעילות collagenase. במידת צורך, להגביר את לחץ אב העורקים ל70-80 מ"מ כספית, כאשר לעכל. בעת צורך, perfusate האנזים יכול להיות ממוחזר לעיכול. בדרך כלל, 300 חיץ U / מיליליטר אנזים יהיה לעכל את לב ב10-12 דקות בקצב זרימה של 4 מיליליטר / דקה;אם הפעלת לחץ afterload ב70 מ"מ כספית, 300 U / ml ייקח רק 3.5-5.5 דקות בקצב זרימה של 4 מיליליטר / דקה.
2. תפסיק עיכול כאשר הלב הופך מעט חיוור ורפוי. זה צריך להיות ספוגי כאשר צבט בעדינות.

5. ניתוק תאים והשבת סידן

1. משוך את אב העורקים מהצינורית עם מלקחיים ספוגי אתנול 70% ולשים הלב לתוך צלחת 60 מ"מ סטרילי המכילה 2.5 חיץ עיכול מיליליטר. לעבור למכסת המנוע בתרבית באמצעות אספקה ​​סטרילית, להישאר מודע לטכניקות סטריליות לכך וצעדי מעקב.
2. הסר את אב העורקים, אטריה, וכלי גדול עם מספריים כירורגיות עדינים. בעדינות להקניט את החדר ל10-12 חתיכות קטנות עם שני מלקחיים עדין קצה.
3. בעדינות פיפטה חתיכות לב ותאים למעלה ולמטה ~ 10x עם טפטפת העברה 10 מ"ל ולאחר מכן להעביר לצינור חרוטי פוליפרופילן 15 מ"ל. יש לשטוף את הצלחת עם 7.5 מיליליטר תמיסת סידן אני מכיל 12.5 מיקרומטר CaCl ₂ והעברהזה לתוך הצינור, וכתוצאה מכך נפח סופי של 10 מיליליטר.
4. בעדינות פיפטה ההשעיה התא למעלה ולמטה באמצעות פיפטה העברה עדין קצה לפזר את החתיכות הגדולות של רקמת לב.
5. אז צנטריפוגות במשך 3 דקות ב20 XG להפריד את תאים שאינם קטנים myocyte כגון תאים וfibroblasts אנדותל.
6. לשאוב את supernatant ו resuspend את כדור myocyte ב10 מיליליטר תמיסת סידן אני עם תוספת של של 200 מ"מ ATP 100 μl (pH 7.2, פתרון מניות, מסנן מעוקר). השאר את השפופרת במכסת המנוע של 3-5 דקות.
7. העברה לשכפל 10 aliquots μl לhemacytometer לספור myocytes מוט בצורה ועגול. לחשב את המספר הכולל של myocytes ולחשב את אחוז myocytes בצורת המוט.
8. צנטריפוגה myocytes במשך 3 דקות ב20 x גרם. הסר את supernatant ו resuspend את כדורים ב10 השני פתרון מיליליטר סידן המכיל 100 מיקרומטר CaCl _2. לפזר את myocytes עם פיפטה ההעברה עדין הקצה על ידי pipettingלמעלה ולמטה.
9. חזור על השלב לעיל (5.8) באמצעות פתרון סיד III (400 מיקרומטר CaCl ₂₎ ורביעי (900 מיקרומטר CaCl _2), בהתאמה.
10. לתרבות העיקרית myocyte עכבר, resuspend את כדור myocyte הסופי ב 5 מיליליטר של ציפוי בינוני. לספור את המספר הכולל של myocytes ולחשב את אחוז myocytes בצורת המוט.

6. תרבית תאים

1. התאם את הריכוז של myocytes בצורת המוט ל25,000 myocytes / מיליליטר בצורת מוט בצינור 50 מ"ל. בעדינות פיפטה myocytes באמצעות פיפטה 10 מ"ל להשעות אותם היטב. הימנע משקיעת תא בפיפטה והצינור כדי להבטיח צפיפות תאים שווה לכל מנה או צלחת.
2. לאחר aspirating את פתרון ציפוי laminin, צלחת myocytes לאלה מנות או צלחות. חלק בעדינות את המנות או צלחות קדימה ושלושה עד ארבעה פעמים אחורה ומצד אל צד בתבנית דמוית צלב על פני השטח של מכסה המנוע בתרבית.
3. מניחים את הכלים או הצלחות בCO 2%₂ באינקובטור ב 37 ° C. דגירה של 1-3 שעות כדי לאפשר מצורף myocyte בשיעור של כ -80%.
4. לאחר התקשרות, בעדינות לשאוב את המדיום המכיל myocytes פנוי ופסולת תא. בעדינות להוסיף מדיום תרבות לצדדים של המנות או צלחות. לבצע את זה שינוי בינוני אחד אחד. מייד להחזיר את הכלים או צלחות לאינקובטור.
5. אחרי תרבות O / N, ניתן לשנות myocytes לאותו מדיום ללא BDM לפני הלימודים של תא איתות לטווח קצר. שמור BDM בתרבות לטווח ארוך עבור מבחני hypertrophic או אפופטוזיס.
   הערה: BDM (monoxime 2,3-butanedione) יכול לעכב את שרירן-ATPase ולמנוע התכווצות. העיכוב של התכווצות מבוססת שרירן שלה הוא הפיך בקלות. הוא דיווח כי BDM יכול להיות כמה תופעות לוואי אפשריות, כגון מתנהג כמו פוספטאז שאינו ספציפי, הגדלת שחרור סידן מSR, ושינוי של ריכוז סידן חופשי ונכס חשמלי סלולאריrties, ולכן לפני הטיפול, יש להסיר BDM. יתר על כן, במקרים מסוימים, Blebbistatin מעכב ספציפי שרירן השני יכול להיות תרופה חלופית לעכב ^8,9 התכווצות cardiomyocyte. עם זאת, במקרים שלנו, BDM הוא טוב יותר מאשר Blebbistatin למען האיכות והכמות של שריר הלב.

1. כימות בידוד מוצלחת

שני קריטריונים משמשים לכמת את ההצלחה של הבידוד: ראשון, המספר הכולל של שריר לב מבודד, ושנית, היחס של myocytes שאינו סובלני בסידן סובלני לעגל בצורת המוט. באופן כללי פרוטוקול זה לוקח בערך 75-90 דקות מהסרת לב לציפוי myocyte ותשואות סביב 1 מ'cardiomyocytes בצורת מוט (70-90% מmyocytes הכולל שנקטפו) מלב עכבר בוגר אחד. זה עשוי להשתנות עם משקל גוף עכבר ומתח. בדרך כלל, ניתן לאסוף .7-1.0 מיליון myocytes בצורת מוט מעכבר ~ 25 גרם C57BL/6J, 1.2-1,600,000 myocytes בצורת מוט מעכבר שוויצרי שחור 35 גרם ~, ו0.7-1,200,000 myocytes בצורת המוט יכול ייגבה מהטרוזיגוטיים ~ 30 גרם Na / K-ATPase (S α1 / R) 10 או ~ 22 גרם ספציפי NCX-KO 11 עכבר לב. בדרך כלל יש לי myocytes המבודד מוט צורה ברורה עם קצוות מלבניים ופסים צולבים ברורים,מוצג באיור 1.

2. זיהוי תפקוד תא

נתונים הקודמים שלנו הראו בבירור כי בשריר לב עכברוש בילוד בתרבית, 100 ouabain מיקרומטר יכול להפעיל PI 3 זירחון Akt K תלוי ולגרום להיפרטרופיה 12. כדי לאשר את התוצאות של אלה בשריר לב עכבר בוגר, cardiomyocytes עכבר C57BL/6J המבוגר היו בתרבית וטופל בouabain. איורים 2 ו 3 מראים בבירור כי ouabain יכול להגדיל זירחון Akt באופן תלוי מינון ולגרום לשילוב [3 H]-לאוצין במהלך סינתזת חלבון.

איור 1. שריר לב בצורת מוט רגיל מעכבר שוויצרי שחור אחרי הלילהתרבות. myocytes צולמו תחת מיקרוסקופ לעומת שלב באמצעות תוכנת צילום.

איור 2. הפעלה של AKT ידי ouabain בשריר לב עכבר C57BL/6J מבוגר מתורבת. Myocytes נחשפו לouabain מיקרומטר 0-50 במשך 5 דקות, וlysates היה assayed לפוספורילציה (סר 473) AKT (p-Akt) וAkt ידי מערבי כתמים. הפעלה הייתה לכמת כיחס בין פוספורילציה לAkt הכולל (n = 5-10). * P <0.05 לעומת שליטה, ** P <0.01 לעומת שליטה.

איור 3. Ouabain ממריץ את סינתזת חלבון בשריר לב עכבר C57BL/6J המבוגר בתרבית לאחר חסך סרום 4 שעות, טופלו myocytes עם התנאים מצויינים בנוכחות או עדר של ouabain או 100 ננומטר ET-1 (בקרה חיובית) יחד עם [3 H]. - לאוצין (1 μCi / מיליליטר) במשך שעה 12. lysates הסלולרי היו זירז עם TCA 5% וresuspended ב0.2 M NaOH/0.1% SDS, והרדיואקטיביות נספרה במונה נצנץ. סינתזת החלבון לדגימה הייתה מחושבת CPM / חלבון ומנורמל בהשוואה לשליטת מ"ג.

טבלת 1. פתרונות / מאגרים לבידוד שריר לב עכבר בוגר.

טבלה 2. הכנת מלאי פתרון ואחסון עבור בידוד ותרבות cardiomyocytes עכבר מבוגר.

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.