העשרה לתאי גזע Chemoresistant סרטן השחלות משורות תאים אנושיות

עמידות לכימותרפיה היא מכשול מרכזי לטיפול וריפוי סרטן. סרטן השחלות הוא הגורם^{החמישי המוביל} למקרי מוות הקשורים לסרטן בקרב נשים בארצות הברית (עובדות ומספרים של האגודה האמריקאית לסרטן 2013). החולים מגיבים בתחילה היטב לכימותרפיה, אך רוב החולים חוזרים¹. לאחר הישנות, חולים מטופלים במגוון תרופות כימותרפיות נוספות עם תועלת מועטה מאוד². המאפיינים הכלליים של CSCs כוללים יכולות שגשוג בלתי מוגבלות, שמירה על מצב לא מובחן, עמידות לטיפול תרופתי, תיקון DNA יעיל ויכולת ליצור תאי גידול ממאירים עם פנוטיפים שונים³. CSCs מציגים לעתים קרובות ביטוי של גנים של תאי גזע כגון Nanog, Oct4, Sox2, Nestin, CD133 ו-CD117. CSCs מבטאים לעתים קרובות רמות גבוהות של ABCG2 וגנים ALDH שעשויים לתרום לפליטת תרופות ולחילוף חומרים^3,4.

הראיות הסופיות הראשונות ל-CSCs הודגמו על ידי בידוד תאים יוזמי לוקמיה מיאלואידית חריפה שהיו מסוגלים להתחדש בעצמם וליצור גידול⁵. תאי גזע לוקמיים אלה ביטאו CD34 על פני השטח ויצרו לוקמיה בעכברים NOD/SCID (מדוכאי חיסון)⁵. מאז זוהו CSCs בסוגי סרטן רבים כולל לוקמיה/לימפומה, שד, שלפוחית השתן, המעי הגס, רירית הרחם, סרקומות, קרצינומה של הכבד, מלנומות, גליומות, שחלות, לבלב, ערמונית, קרצינומה של תאי קשקש וריאות⁶. לכן, היכולת לחקור תת-סוג זה של תא סרטני היא יתרון.

מטרת מחקר זה היא ליצור פרוטוקול לבחירה ובידוד של CSCs עמידים לכימותרפיה. דווח על מספר שיטות לבידוד CSCs מקווי תאי סרטן השחלות. ספרואידים שאינם נדבקים שבודדו מתרבויות OVCAR-3, SKOV3 או HO8910 מפגינים תכונות דמויות גזע^7,8. בידוד של תאי CD133+ מתרביות OVCAR-3 מניב גם CSCs. CSCs נבחרו גם בתרבית על ידי טיפול בתרופות כימותרפיות. טיפול בשורות תאי גידול (תאי OVCA433, Hey ו-SKOV3) עם ציספלטין ופקליטקסל מאפשר הרחבה ובידוד של CSCs^4,9. בעוד שתרבית של סוגי תאים מסוימים במדיה CSC מובילה לבידוד של CSCs, תאי SKOV3 לא שרדו תרבית במדיה נטולת סרום או יצרו תאי כדור⁴. לכן, טיפול בתאים עם ציספלטין ופקליטקסל סייע להתרחבות או לבידוד של אוכלוסייה זו⁴.

באמצעות שינוי של ההליך שהוצג על ידי מא ועמיתיו⁴ פיתחנו שיטה לבידוד CSCs משורות תאי סרטן השחלות. הפרוטוקול שלנו הוא יתרון מכיוון שהוא מניב תאים ברי קיימא יותר תוך שימוש בתרופות כימותרפיות פחות רעילות. התאים מטופלים בציספלטין ולאחר מכן גדלים במצע נטול סרום בתוספת גורמי גדילה (מדיה של תאי גזע). אנו מבודדים את תאי הכדור הלא נצמדים המתקבלים ובודקים אותם לביטוי סמני תאי גזע. מודל זה מאפשר לחקור את תכונות CSC והתגובה לטיפול תרופתי.

.1 תא תרבות ותיוג פלורסנט של שורות תאי סרטן השחלות

1. הכן תקשורת SKOV3: תקשורת מקוי בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS), L-גלוטמין 0.1 מ"מ, 50 U / ml פניצילין, ו50 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין. לשמור OVCA429 תאים בתקשורת המינימלי חיונית (MEM) בתוספת 10% FBS, פירובט נתרן 1 מ"מ, L-גלוטמין 0.1 מ"מ, 50 U / ml פניצילין, ו50 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין.
2. הפץ שורות תאי SKOV3 וOVCA429 בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO _2. לגדל תאים לconfluency 40-50%.
3. לייצר תאים לבטא חלבון אדום ניאון (RFP) במטרה לעקוב אחר כדאיות במבחנת in vivo.
   1. כדי ליצור תאי SKOV3 להביע RFP, להוסיף חלקיקי lentiviral להביע RFP וpolybrene / מ"ל ​​10 מיקרוגרם לתקשורת SKOV3 בהעדר פניצילין וסטרפטומיצין ל72 שעה.
   2. לאחר 72 שעה, לבחור עבור RFP תאים חיוביים על ידי תא הקרינה הופעל Sorting (FACS) כדלקמן: RFP Trypsinize ולא RFP לבטא בתאים, צנטריפוגות ב XG 125 למשך 5 דקות, תאים גלולים ב10 ⁷ / מ"ל תאי PBS המכיל BSA 0.1%. על סדרן תא, להשתמש בתאים שאינם RFP כדי לקבוע את הפרמטרים למיון. ואז לאסוף תאי המבטאים גבוה RFP באמצעות לייזר 561 ננומטר.
   3. לחלופין, אם פלסמיד lentiviral מבטא קלטת עמידות לאנטיביוטיקה, לבחור עבור תאי RFP להביע ידי culturing באנטיביוטיקה המתאימה (כגון 10 מ"ג / מ"ל ​​blasticidin). הערה: הכמות של חלקיקי lentiviral שצריך להיות בשימוש יכול להשתנות על ידי אצווה ועל ידי סוג תא. כייל lentiviral נכון צריך להיות שנקבע לכל סוג תא.

.2 העשרה של תאי גזע סרטניים

1. פנק את SKOV3, SKOV3-RFP, או OVCA429 שורות תאים עם 20 מיקרומטר של ציספלטין ל72 שעה. זהירות: ציספלטין הוא רעיל. השתמש בבגדים / כפפות מגן ולהימנע ממגע עם קרומי עור וריר. אל תשליך אני ציספלטיןשפכי n.
2. הכן תקשורת CSC: תקשורת DMEM / F12 סרום ללא תוספת 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​אינסולין, 10 ng / גורם גדילה באפידרמיס רקומביננטי אנושי מ"ל (EGF), 10 ng / גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי מ"ל (bFGF), ng 12 / גורם מעכב לוקמיה מ"ל , ואלבומין 0.4% בסרום שור (BSA).
3. תאי Trypsinize. תרבות ששרד תאים בתקשורת CSC.
   הערה: לאחר 2 ימים בspheroids שאינו חסיד התרבות יהוו.
4. שינוי בתקשורת כל 2 ימים על ידי איסוף מדיה המכילה תאים וצנטריפוגה ב125 XG למשך 5 דקות. אז resuspend גלולה בתקשורת CSC הטרי. בדקו תאים לכדאיות כל 2 ימים על ידי ספירת תאים וביצוע הרחקת trypan כחולה.
5. ואז לאסוף CSCS עבור ניסויים נוספים על ידי צנטריפוגה 129 XG למשך 5 דקות וresuspending גלולה בthiocynate פנול המכיל guanidinium (RNA), שנאגרו מלוח פוספט (PBS: 137 mM NaCl, 2.7 מ"מ KCl, ו11.9 מ"מ חיץ פוספט, pH 7.4) עם BSA 0.1% (עבור cytometry זרימה), או מדיה CSC להמשיךculturing התאים.
6. צג מורפולוגיה של תאי CSC באמצעות מיקרוסקופ אור ב20X ו40X הגדלה.

.3 אפיון CSC באמצעות ניתוח ביטוי גנים לסמני תאי גזע

1. לאסוף 3 הכנות של CSCS על ידי איסוף מדיה המכילה תאים, צנטריפוגה ב129 XG למשך 5 דקות, וresuspending גלולה בפתרון של thiocynate guanidinium פנול המכיל (ניתן להשתמש בשיטות אחרות להפקת RNA).
2. הכן RNA סך באמצעות TRIzol על פי הפרוטוקול של היצרן. לסנתז DNA המשלים (cDNA) .1-1 מיקרוגרם של RNA באמצעות ערכת cDNA ההפוך תמלול זמינה מסחרי.
3. לבצע תגובה הפוכה עיבד כמותית השרשרת של פולימראז (qRT-PCR).
   1. מרכיבים את תערובת הורים עבור כל קבוצה של פריימרים המכילים תערובת qRT-PCR, פריימרים, ומים לסך 8 μl לדגימה (יכולים להיות מוגברים פריימרים עם fluorophores שונה באותה היטב). לדוגמא, ליצורתערובת אב אחד לOct4-FAM, Nanog-Hex, וGAPDH-Cy5. צור תערובות הורים נפרדות לNestin וProm1. הוסף 2 μl של תבנית cDNA לדגימה.
      הערה: במחקר זה, qRT-PCR בוצע באמצעות פריימרים מפורטים בטבלה 1.
   2. לבצע את כל qRT-PCR בשני עותקים עבור כל דגימה באמצעות זמן אמת thermocycler PCR מסוגל לאתר fluorophores מרובה. כולל לא שולט תבנית.
   3. לנרמל ביטוי גנים בתאי גזע לביטוי GAPDH עבור כל דגימה בשיטת ΔΔC _T.

Primers הטבלה 1 המשמש לאפיון CSC ידי qRT-PCR.

1. CSCS קציר על ידי איסוף מדיה המכילה תאים וצנטריפוגה ב125 XG למשך 5 דקות. הוסף 500 μl של פתרון ניתוק מסוג התאים לא פרוטאוליטים לשבור-up תאים. תאי צנטריפוגה ב125 XG למשך 5 דקות כדי להסיר פתרון ניתוק תא. לאחר מכן לשטוף את תאים פעמיים עם PBS הקר.
2. דגירה בתקשורת צמיחה נורמלית עבור שעה 1 לפני תאי תיוג. ספין למטה תאים 5 דקות ב129 x גרם. Resuspend תאים בPBS עם BSA 0.1% עם אנטי CD133-PE ואנטי CD117-FITC.
3. תקן תאי הלילה בparaformaldehyde 1%. זהירות: Paraformaldehyde הוא (קרצינוגן חשד) רעיל. הפוך במנדף ולהשתמש תוך שבוע.
4. לבצע cytometry זרימה לנתח CD117 (עם אנטי CD117 מצומדת לFITC) ביטוי על פני השטח של תאים בזרימה cytometer וCD133 (עם אנטי CD133 מצומדת לPE). לאסוף נתונים על תאים בFL1 (לFITC) וFL3 (לPE) ערוצים. צור שערים לתאים המבטאים את שניFITC וPE. צור עלילת נקודה עם 4 רביעים (FITC- וPE-, FITC + PE-, FITC- PE +, וFITC + וPE +) ולקבוע את מספר התאים בכל רבע.

.5 ניתוח CSCS לתגובה טיפולית

1. צלחת 5,000 תאים לכל טוב (SKOV3, SKOV3-RFP, SKOV3 CSC וSKOV3-RFP CSCS) על צלחות 96 היטב הלילה.
2. פנקו עם ציספלטין (0, 1, 10, 100, ו1,000 מיקרומטר) או פקליטקסל (0, 0.01, 0.1, 1, 10, ו100 מיקרומטר) ל96 שעה.
3. בצע MTT (3 (4,5-Dimethylthiazol-2-י.ל.) ברומיד -2,5-diphenyltetrazolium) assay כדאיות תא.
   1. צלחת תאים 5,000 לכל טוב 100 μl על צלחת 96 היטב (תאי צלחת בשני עותקים וכוללים תקשורת לשלוט רק בארות).
   2. לאחר 24 שעות, להוסיף 10 μl של 10 מ"ג / מ"ל ​​MTT. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2-4 שעות (עד צורות משקע).
   3. הוספה של MTT ממס 4 מ"מ HCl 100 μl, 0.1% NP-40 בisopropanol. דגירה במשך 15 דקות בחושך.
   4. קראו צלחות ב570 ננומטר על r צלחתeader.

על מנת להוכיח כי אנו מבודדים CSCS משורות תאי סרטן השחלות אפיתל באמצעות טיפול ציספלטין, שרכשנו ראשון את תמונות של שורות התאים לפני טיפול ואחרי הבחירה. אנחנו השתמשנו במיקרוסקופ אור כדי ללכוד תמונות של חסיד (ללא טיפול) SKOV3 וOVCA429 תאים וSKOV3 וOVCA429 CSCS (איור 1). CSCS להופיע בסיבוב לא ומחובר לצלחות תרבית רקמה (איורים 1 ו -2). בנוסף, אנו מראים שתאי SKOV3 transduced עם RFP לשמור הקרינה שלהם לאחר הבידוד של CSCS הוכחה כי התאים הם קיימא (איור 2).

תרבויות CSC קיימא הוערכו לתגובה שלהם לטיפול תרופתי. CSCS הפגין התנגדות מוגברת לציספלטין (במיוחד ב100 מיקרומטר) ופקליטקסל (10 מיקרומטר) (איור 3). CSCS לעתים קרובות מאופיין בביטוים של גנים בתאי גזע. ביטוי של CD133 (הידוע גם בProm1), Nestin, Nanog, וOct4 נבדקו. CD133 היה מושרה באופן משמעותי בתרבויות SKOV3 CSC בהשוואה לתאים שלא טופלו (שליטה) (איור 4 א). CD133 גם היה מושרה בתרבויות CSC השוואה לקבוצת ביקורת שלא טופלה על ידי 16 פי ופי 13 בתאי OVCA429 וOVCA429-RFP (מידע לא מוצג). בניסויים ראשוניים Oct4, Nanog, וNestin היו גבוה בתרבויות SKOV3 CSC לעומת לא מטופלים, אך התוצאות לא היו (איור 4 א) משמעותיים מבחינה סטטיסטית. עם חזרה על ניסויים אלה Oct4 וNanog גדלו בSKOV3 CSCS בהשוואה לתאי בקרת הורים (איור 4). Oct4 הוגדל על ידי 4.7 פי ו8 פי בתאי OVCA429 וOVCA429-RFP הבא פרוטוקול העשרת CSC (לא מוצג). לבסוף, תערוכת SKOV3 CSCS מוגברת ביטוי פני תא של CSC סמן CD117 (איור 5). לסיכום, שיטה זו מאפשרת לבחירה של CSCS קיימא אליפטית (המבטא סמנים של תאי גזע) בסרטן השחלותשורות תאים על ידי בחירה עם ציספלטין וצמיחה בתקשורת של תאי גזע.

איור 1 המורפולוגיה של SKOV3 וOVCA429 תאים ותאי גזע סרטני (CSCS) נבחרה מSKOV3 וOVCA429 תאים. מיקרוסקופ לעומת השלב מתאר SKOV3 וOVCA429 תאים (חסיד), כי הם לא טופלו ונבחרו לCSCS (אליפטית).

איור העשרה .2 לCSCS מניבה spheroids שאינו חסיד. התאים (א) SKOV3 שלא טופל ומועשר לCSCS (60X הגדלה). (ב) תאי SKOV3-RFP שלא טופל (ב) או מועשר לCSCS (ג וד). פנלים משמאל מתארים תמונות בניגוד שלב ולוחות מימין מתארים הקרינה. הגדלה מקורית 40X. סרגל קנה מידה = 400 מיקרון.

איור תערוכת CSCS .3 מוגברת chemoresistance בהשוואה לשורות תאים שלא טופלו. SKOV3 (A, B) וSKOV3-RFP (C, D), SKOV3 CSCS (A, B) וSKOV3-RFP CSCS (C, D) טופלו בשונה ריכוזים של ציספלטין (וג) או פקליטקסל (טקסול) (B, D). assay MTT לאחר הטיפול 96 שעה בוצע. ניסויים בוצעו בn≥3 וסטטיסטיקה חושבה באמצעות שתי הדרך ANOVA; * P <0.05, *** p < ;. 0.0005 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ביטוי איור 4 גזע סמן התא בCSCS בהשוואה לתאים שלא טופלו. ניתוח qRT-PCR בוצע עבור SKOV3 (שליטה) וSKOV3 CSCS. () CD133 (Prom1), Nestin, Nanog, וOCT4 (מנורמל לGAPDH). ( B) ניסוי נוסף להוכחה שCSCS SKOV3-RFP שהתקבל מתאי תשואת פרוטוקול זה עם OCT4 המוגבה וNanog בהשוואה לתאים שלא טופלו. תוצאות היו מנורמלות עם ביטוי GAPDH. N = 3 וסטטיסטיקה חושבו באמצעות סטודנטים T-בדיקה; ** P <0.02, *** p <0.002.

5 "FO: = תוכן ברוחב" "src =" 5in / קבצים / ftp_upload / 51,891 / "width =" 51891fig5highres.jpg 500 "/>
איור 5 ניתוח תזרים Cytometry של סמנים בתאי גזע בתאי SKOV3 וSKOV3 CSCS לבד או transduced או בלי RFP. CD133, CD117, וCD133 ביטוי / CD117 ב (א) SKOV3 תאים (שלא טופלה / שליטה), (ב) SKOV3 CSCS, (C) SKOV3-RFP תאים שלא טופלו, ו( D) CSCS SKOV3-RFP. ניסויים בוצעו בשלושה עותקים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

המחברים מצהירים שאין להם אינטרס כלכלי מתחרה.