הזרקת orthotopic של תאי סרטן השד לחלב שומן Pad של עכברים לחקר התפתחות גידול.

הסרטן הוא מחלה מורכבת מאוד שהייתה הנתונה ללימודים במשך מאות שנים. סרטן השד הוא סוג הסרטן הנפוץ ביותר; היא מתרחשת בעיקר אצל נשים, אך עשויים להתרחש גם באופן ספורדי בזכרים ^27. המחלה בעיקר נגרמת על ידי האובדן של חלוקת תא שלטון מנגנון בקרה אשר בתורו מוביל לצמיחה אינסופית של תאים בגוף. יכולות להיגרם תקלות אלה על ידי מספר מנגנונים: ראשון, תאים בריאים צריכים אותות צמיחה מהתאים המקיפים על מנת להתרבות ואילו תאים סרטניים לעשות גורמי הגדילה שלהם ולהגדיל את הביטוי של קולטנים גורם גדילה וכך להשיג שיעור גבוה יותר שגשוג ^1; שני, תאי הסרטן הם פחות רגישים לאותות אנטי-שגשוג ^8; שלישי, כדי לאזן את המספר הסלולרי במוות של תאי גוף גם נדרש; עם זאת, תאים סרטניים להימלט ממוות מתוכנת של תאים, המכונים אפופטוזיס ^14; רביעי, תאים לדבוק מטריצות תאיעל מנת לשרוד, אך תאים סרטניים יכולים לגדול ללא הצורך בהתקשרות ולהראות התנגדות לanoikis ^19; חמישי, הפעלה של הטלומרז עוקפת את ההתקצרות הטלומרים ומונעת הזדקנות replicative ^21; ואחרון אחרון חביב, דילוג של בקרת איכות DNA בעקבות תוצאות מיטוזה בתוכן גנטי שינה ^15,16. על מנת לזהות אונקוגנים או מדכאי גידול שמשחקים תפקיד בהתפשטות הבלתי מווסתת זה, ניסויי צמיחת גידולים בעכברים הם קריטיים.

צמיחת גידול ראשונית היא בדרך כלל לא הסיבה העיקרית למוות. הגירה של תאים סרטניים מהאתר הראשי לאתר המשני, המכונה גרורות, הוא הגורם המוביל למוות ברוב חולי סרטן ^22. גרורות הכרוכות פלישת תאים סרטנית, intravasation, נסיעה דרך מחזור הדם, הימנעות התקפה חיסונית, extravasation וצמיחה באתר המשני. אפיתל מעבר mesenchymal (EMT) הוא תהליך מפתח בגרורות וכרוכות מתג בפרופילי ביטוי גני מניב תאים עם תנועתיות והפולשנות גבוהות יותר, שהם דרישות קדם לתא הגרורות ^12. ככל שהתהליך הסרטני היא התוצאה של שילוב של פעולות שונות, כוללים אינטראקציות הדדיות בין תאים סרטניים, תאי סטרומה ותאים פרו ואנטי דלקתיים, גישה במבחנה לסרטן לעתים קרובות אינה מספקת הבנה מלאה של התהליך הסרטני. בדומה לכך, לעתים קרובות יכולים להיות לא למדו טיפולים נגד הסרטן משפיעים על כלי הדם של גידול במבחנה, ובכך השימוש בin vivo הגישות הוא בלתי נמנע.

ללמוד התקדמות סרטן השד, שיטות ניסיוניות שונות פותחו. המודל הנפוץ ביותר הוא ההזרקה תת עורית של תאי סרטן השד בעכברים ^5. בהגדרת ניסוי זה, החוקר יכול להציג מגוון רחב של שינויים בקו תא של בחירה במבחנה (כלומרupregulation, downregulation של חלבונים) ולהזריק את התאים מתחת לעור. למרות ששיטה זו היא פשוטה ותהליך ההזרקה הוא פשוט ללא כל צורך בביצוע ניתוח בעכברים, האתר שבו הגידול מוזרק אינו מייצג את הסביבה המקומית החלב גידול והיעדר הסביבה זו עלולה לגרום להתפתחות סרטן שד ש שונה מזה שנצפה בהפתולוגיה אנושית. שנית, עכברים מהונדסים גנטי נמצאים בשימוש לעתים קרובות ככלי in vivo ללמוד התקדמות סרטן השד. במודל זה, ביטוי אונקוגן (כלומר PyMT, Neu) הוא מונע על ידי אמרגן רקמות ספציפי החלב מוביל להיווצרות של של גידול בשד ספונטני. התקנה ניסיונית זו שימושית כדי ללמוד את היבט טיפול במחלה על ידי הזרקת סמים או נוגדנים בעת בדיקת גודל גידול בזמן ^3. עם זאת, גידול עכברים אלה עם זני עכבר אחרים חסרים או מוטציה בגן של עניין גם יכול לתת תוספותights לתוך התפקיד של חלבונים שונים בצמיחה של גידולי סרטן שד ^24. החסרון של המודל הזה הוא שהוא נוטה וריאציה בגודל הגידול ומספר. יתר על כן, את רמת ביטוי transgene תלויה באתר האינטגרציה בגנום ויכולה להשתנות מזן עכבר אחד לעוד ^4. במודל זה, הביטוי של transgene יכול להיות מושגת על ידי כל התאים אפיתל עם מקור ואילו במחלות של בני אדם, רק תת-אוכלוסייה של תאים לבטא אונקוגן או downregulate הרמות המדכאים גידול ^26. ללמוד גרורות, תאי סרטן השד יכולים גם להיות מוזרקים לוריד (מודל מכונה גרורות ניסיוני) ^25. עם זאת, גישה זו משחזרת רק את התהליך גרורתי באופן חלקי; עוקף את הדרישה לתאים סרטניים לפלוש וintravasate, ומתחיל מהנקודה שבה תאי גידול הם בקלות הווה במחזור הדם.

בעבודה שלנו, אנו משתמשים להזריק orthotopicמודל היון ללמוד את מעורבותם של הגנים של עניין בהתקדמות סרטן השד ^13. אנו ביטוי היתר של החלבון בתאי סרטן השד אנושיים ולהזריק אותם לתוך כרית שומן החלב של NOD גמא SCID עכברים / (NSG). שיטה זו יש יתרון בדרכים רבות: היא מאפשרת שינויים גנטיים מהירים מאוד ומגוונים בשורת התאים המוזרקת, הוא מכסה את כל התהליך של התקדמות סרטן השד מצמיחת גידול ראשונית לגרורות באתרים רלוונטיים באופן פתולוגי, והוא גם מספק מודל ניסיוני טוב לבוחן את ההשפעה של טיפולים טיפוליים במחלה מוקדם או מאוחר שלבים. בנוסף, משתמש באחד מודל זה יכול לחקור את התפקיד של סטרומה לעומת חלבונים המופקים מתאים סרטניים בהתקדמות מחלה באמצעות עכברים או תאים מהונדסים גנטי. למרות זריקות תת עורית קלות יותר לביצוע, דגמי orthotopic להצמיח אוכלוסיית תאי הסרטן יותר tumorigenic וגרורתי יותר. לפיכך, תוצאות שהושגו באמצעות ההזרקה תת עוריתים יכול להיות גם שגוי שלילי או חיובי שגוי ^6,17 עידוד השימוש במודלי orthotopic ללמוד את צמיחת הגידול.

ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת רווחת בעלי החיים של המרכז הרפואי של אוניברסיטת ליידן (LUMC).

1. הכנת תאים, מכשירים ועכברים

1. יום לפני המבצע, לגלח את NOD גמא SCID העכברים / (NSG) מהפטמה הרביעית לקו האמצע ולשקול את העכברים כדי לוודא שיש את כל העכברים משקולות שווים בקירוב.
2. החיטוי מספריים, שתי פינצטה ושני מלקחיים ישר יתוש (איור 1 א).
3. ביום הפעולה, לשטוף את אדנוקרצינומה השד האנושית (מד"א MB-231) תאים שניתן להזריק פעם אחת עם ופר פוספט (PBS), pH 7.4 וtrypsinize התאים. להרוות את טריפסין על ידי הוספת 10 מיליליטר תקשורת DMEM סרום המכיל בחלק העליון של התאים. צנטריפוגה התאים ב1,200 סל"ד 7 דקות ב RT להסיר סרום על ידי resuspending התאים או בPBS או באמצעי תקשורת ללא סרום. צנטריפוגה אותם שוב כדי להסיר עקבות של סרום לחלוטין. Resuspend תאי PBS אותקשורת.
4. ספירת התאים עם hemocytometer ולחשב את כמות התאים. השתמש 500,000 תאים / עכבר בלא יותר מ -150 μl. אופציונאלי לPBS או תקשורת, resuspend תאי matrigel.
   הערה: קבע את כמות התאים בהתאם לסוג התא בשימוש.
5. מקום תאים בצינורות microcentrifuge סטרילי ולשמור אותם על קרח.
6. מלא את אחד 50 מיליליטר צינור צנטריפוגות חרוטי עם 35 מיליליטר של pH 7.4 PBS וצינור נוסף 50 מ"ל חרוטי צנטריפוגות עם אתנול 70%. משרים צמר גפן לתוך צינור אחד.

2. הזרקה Orthotopic

1. לבצע את הניתוח בשכונת סטרילי כדי לשמור על אווירה סטרילית. להרדים את העכבר על ידי תת עורי הזרקת תערובת Xylazin / קטמין במינון של 10 מ"ג / קילוגרם, 100 מ"ג / קילוגרם משקל גוף בהתאמה. תקן את העכבר על כרית חימום. לאשר את ההצלחה של הרדמה על ידי חוסר התגובה לקמצוץ הבוהן.
   הערה: אם אחד הוא לא מכיר היטב את ההליכים כירורגיים, ניתוח עשוי להימשך זמן רב יותר. לארגןההרדמה במינון בהתאם.
2. החל משחה עיניים על העיניים של עכברים, כדי למנוע את העיניים מהתייבשות.
3. נקה את האזור המגולח באמצעות מקלון צמר גפן טבול אתנול מוכן בשלב 1.6. לסירוגין סקראבס באמצעות בטאדין ואלכוהול שלוש פעמים בצורה מעגלית מסתובבת ממקום החתך המתוכנן צריכה להתבצע. לחלופין, להשתמש ionophore כחומר חיטוי.
4. לעשות חתך קטן בין הפטמה הרביעית וקו האמצע עם מספריים ולעשות כיס על ידי החדרה מקלון צמר גפן טבולה בpH 7.4 PBS.
5. השתמש בפינצטה כדי לחשוף את כרית שומן החלב. שים לב לכרית השומן על ידי הצבע הלבן שלה.
6. לסחוט את כרית השומן עם פינצטה האחרות מבסיסו; בדרך זו, לחשוף באופן מלא את כרית השומן (איור 1) כדי לבצע זריקות בקלות.
7. Homogenize תערובת התא על ידי pipetting למעלה ולמטה. לשאוב בעדינות 50 μl של השעיה תא לתוך מזרק אינסולין להזריק לכרית שומן החלב על ידי החזקת המחט אופקית. לאשר זריקה מוצלחת על ידי בדיקה לנפיחות של כרית השומן.
8. שחרר את כרית השומן בעדינות.
9. תפר את החתך באמצעות נהג מחט. הפוך שלושה זורק על ידי סיבוב התפר סביב נהג המחט בכיוון השעון, נגד כיוון השעון וכיוון השעון. יש להשתמש בשני קשרים לתפר.
   הערה: ודא שהקשרים הדוקים אחרת עכברים יכולים לפתוח את התפרים.
10. לאחר ניתוח, להזריק משכך כאבים, כגון temgesic ב0.05-0.1 מ"ג / קילוגרם משקל גוף, מתחת לעור כדי להקל על הכאב.
11. אל תשאיר את בעלי החיים ללא השגחה עד שהם מרוויחים את ההכרה ולשמור על recumbence sternal. מניחים את כל החיות לכלובים שונים עד שהם התאוששו באופן מלא.
12. כדי לשמור על סטריליות, להשתמש כלובים ומים autoclaved. לשנות את הכלובים כל שלושה ימים כדי לשמור על האווירה נקייה.

3. קצירת איברים לניתוח

1. ביום של קציר, 8 שבועות לאחר ההשתלה של התאים, למלא צינורות צנטריפוגות חרוטי 15 מיליליטר עם 3 מיליליטר הפתרון של Bouin לכל עכבר. בנוסף, משתמש בשני 15 מיליליטר צינורות מלאים ב5 מיליליטר פתרון פורמלין לכל עכבר.
2. להרדים את בעלי החיים על ידי הזרקת Xylazin / קטמין, במינון של 10 מ"ג / קילוגרם 100 מ"ג / קילוגרם משקל גוף מתחת לעור. חכה עד שהחיה מאבדת את רפלקס נסיגת קמצוץ הבוהן.
3. תקן את החיה עם מחטים על בסיס. ביצוע חתך ארוך, אנכי קו האמצע עם מספריים. לעשות שני חתכים אופקיים ממש מתחת לרגל הקדמית ומעל הרגל האחורית. לחשוף את הגידול על ידי מצמיד העור לבסיס. למדוד באמצעות קליפר נפח הגידול.
4. לנתק את הגידול מהעור באמצעות מספריים. Snap להקפיא חלק מהגידול בחנקן נוזלי לבידוד RNA. מניחים את החלק השני, לתוך צינור צנטריפוגות חרוטי מלאים בפורמלין לבצע אימונוהיסטוכימיה הבאה הטבעת פרפין.
5. מוציאים בעדינות את הריאות. הנח אתעזב את הריאות לפתרון של Bouin. שמור את הריאות בפתרון במשך 3 ימים. שימו לב מוקדים גרורתי שטחיים באופן ברור לעין בלתי מזוינת. לחלופין, למקם את הריאה הימנית לתוך פורמלין כדי לוודא micrometastasis באמצעות haematoxylin וeosin מכתים (H & E).
   הערה: למרות ש, גרורות ריאות נצפו לעתים קרובות בסרטן השד, אפשר גם רוצה לאסוף עצם, כבד, מוח וטחול לנתח גרורות. התאים באזור גרורתי הם צפופים יותר ושונים מורפולוגית ולכן ניתן להבחין בקלות מרקמת ריאה.
6. יום לאחר קציר, לשאוב את פתרון פורמלין מ -15 מיליליטר צינורות ולהחליף עם 70% אתנול. להטביע רקמות פרפין ולבצע מחקרי אימונוהיסטוכימיה.
7. לבדיקת דם, לפתוח את חלל החזה עם מספריים. למשוך 450 דם μl באמצעות לנקב לב. מניחים דגימת דם בצינור microcentrifuge המכיל 50 μl של 3.2% נתרן ציטרט. אחרי הדם נאסף, לסובב אותו XG ב 2000 עבור 10 מייליםn. אחסן את דגימות הפלזמה ב -20 ° C עד לשימוש נוסף.
   הערה: קיימות מספר טכניקות איסוף דם אחרות נפוצה בתרגול ²⁰ והטכניקה שצריכה להיות בשימוש תלויה בהגדרת ניסוי ובחירתו של המדען. אם דגימת דם אינה נדרשת, להרדימו על פי הפרוטוקול של בעלי החיים או על פי הנחיות המוסד.

יישום מוצלח של "מודל סרטן שד orthotopic" מבוסס על הזרקה נכונה של תאים לתוך כרית שומן החלב. שגיאות ניסיוניות כגון חיסון מדויק של תאים או דליפה עלולות לגרום לשינויים בגודל גידול או אפילו העדר גידול שמוביל להיווצרות של מבנה מחפשים דומה לכרית שומן החלב מוזרקת עם חיץ שליטה (איור 2 א). שיעור הצמיחה של הגידול תלוי בטיבו של קו התא שהוחדר ובאופן כללי, ניתן לראות דרך העור של העכברים (איור 2). שלא כמו בניסויים במבחנה, שיעור הצמיחה של התאים הסרטניים לא יכול להיות קבוע בזמן in vivo (איור 2 ג). בשל חוסר חמצן וחוסר של חומרים מזינים, אזורי נימקי עלולים להיווצר ואזורים אלה ישפיעו על שיעור הצמיחה של הגידול (איור 2 ד). בנוסף, הגן של עניין עשוי להשפיע שלב מסויםהתקדמות הסרטן (מוקדם או מאוחר), ובכך ובהתאם להגדרות הניסיוניות, צמיחת גידול עלולה להתחיל מהר אבל להאט בסוף או להיפך.

יש להקפיד במהלך הליך הסרת הגידול; טיפול קפדני עשוי להשפיע על המבנה של הגידול וגורם לבעיות בניתוח immunohistochemical. סביב גידול האזור עשוי להציג כלי גדול הנובעים משיפוץ של כלי דם. כלים אלה לשחק תפקיד מכריע בהוצאת פסולת ולספק את רקמת גידול עם חומרי מזון וחמצן ובכך להקל על צמיחת גידול (איור 2). כינונה של neovessels (אנגיוגנזה) יכול להיחקר על ידי צביעת הגידול לסמני neovessel (כלומר CD31, CD34).

אוסף של הריאות בפתרון של Bouin עוזר לדמיין מוקדים שטחיים גרורתי על הריאות (איור 3 א). המוקדים ניתן להבחין בין רקמת ריאה באמצעות הצבע החיוורד הם קל לזיהוי 18. גרורות עלולות להתבטא במספר המוקדים נוצרו על פני השטח הריאה. עם זאת, יצירת מוקדים הוא תא קו תלוי; תאים שאינם אגרסיביים להצמיח micrometastasis בלבד או לא גרורות בכל. גרורות מיקרו ניתן לזהות בקלות עם כתמי haematoxylin / eosin ברקמת ריאה-מוטבע פרפין (איור 3 ג).

איור 1:. חומרים ושיטות () ציוד כירורגי הנדרש להזרקה של תאי סרטן השד לתוך כרית שומן החלב תמונת נציג מראה את החשיפה של כרית שומן החלב (B)..

איור 2:. סקירה כללית של צמיחת גידולי שד orthotopic בעכברי שליטת Media (א) או (C) נפח גידול נמדד עם calliper על ידי שימוש בנוסחא הבאה:.. גידול נפח = 0.5 x אורך x רוחב x רוחב (D) מורפולוגיה כוללת של הגידול מנותח עם צביעת H & E. אני עומד לתאים הסתננו, T מציין תאי גידול וN מייצג אזור נימקי. (בר סולם = 200 מיקרומטר)

איור 3: גרורות לריאות גידול () ריאות של עכברים שהוזרקו orthotopically עם תאים סרטניים (מד"א MB-231).. דגירה של ריאות בפתרון של Bouin חושפת את המוקדים גרורתי על ריאות. ריאות (B) מעכברי שליטהשעבר הזרקת orthotopic של תקשורת שליטה. כפי שניתן לראות בבירור, ריאות שליטה אלה לא מראות גרורות מקרוסקופית. (ג) H & E מכתים מראה את האזור גרורתי ברקמת ריאה. הכנס מציג סקירה ההגדלה נמוכה של רקמת הריאה המכילה את המיקוד גרורתי. המלבן המקווקו השחור בהוספה מיוצג בלוח הגדול. תאי גידול מסומנים על ידי הקו המקווקו הלבן; שים לב לגרעינים גדולים יותר וצפופים יותר. (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר שחור, סרגל קנה מידה לבן = 20 מיקרומטר)

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.