מאמר שיטה

מדידה של הזחל פעילות ב דרוזופילה צג פעילות

DOI:

10.3791/52684

⸱

30 באפריל 2015

 ,  , 
1Department of Biology, University of New England

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דוח זה מתאר שיטה למדידת פעילות הזחלים של דרוזופילה באמצעות מוניטור פעילות הדרוזופילה TriKinetics. המכשיר משתמש בקרני אינפרא אדום כדי לזהות תנועות של עד 16 בעלי חיים בודדים. ניתן לנתח נתונים כדי לייצג פרמטרי תנועה כולל קצבים ומיקומי בעלי החיים בתוך תאי הבדיקה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זחלי דרוזופילה משמשים במחקרים התנהגותיים רבים, אך מכשיר פשוט למדידת פרמטרים בסיסיים של פעילות הזחלים לא היה זמין. פרוטוקול זה עושה שימוש מחדש במכשיר המשמש לעתים קרובות למדידת פעילות בוגרים, מוניטור הפעילות של TriKinetics Drosophila (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) כדי לחקור את פעילות הזחלים. המכשיר יכול לנטר את תנועות בעלי החיים ב-16 צינורות בדיקת זכוכית בודדים בקוטר 8 ס"מ, באמצעות 17 קרני גילוי אינפרא אדום לכל צינור. תוכנת רישום שומרת נתונים באופן אוטומטי במחשב, רושמת פרמטרים כמו מספר התנועות, זמני הפעלת החיישנים ומיקומם של בעלי חיים בתוך הצינורות. לאחר מכן ניתן לנתח את הנתונים כדי לייצג תנועה כוללת ו/או העדפת מיקום כמו גם מדידות אחרות. כל הנתונים נגישים בקלות ותואמים לתוכנות גרפים ומניפולציה בסיסיות של נתונים. פרוטוקול זה ידון כיצד להשתמש במכשיר, כיצד להפעיל את התוכנה וכיצד להפעיל בדיקת פעילות זחלים מתחילתה ועד סופה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש בדרוזופילה ככלי גנטי שינה את הידע המדעי על מערכות ביולוגיות. זחלי דרוזופילה שימשו במגוון מחקרים כולל כאב1, התפתחות2 וכמודל לחקר גנים של מחלות אנושיות3. פעילות דרוזופילה מקיפה מגוון התנהגויות המשתנות בתנאים שונים כולל טמפרטורות2, חשיפה לתרופות4 ובין גנוטיפים שונים. עם זאת, למרות השימוש המשמעותי בזחל כאורגניזם מודל, שיטה פשוטה וסטנדרטית לניתוח פעילות הזחלים לא הייתה זמינה. כיום, מחקרי תנועת זחלים רבים משתמשים בתוכנת ניתוח וידאו מתוחכמת5. למרות עוצמתם, המורכבות של כלים אוטומטיים כאלה עלולה להרתיע מעבדות שאינן מצוידות עדיין לחקור תנועה מלכלול ניתוח של פרמטרים אינפורמטיביים של פעילות במחקריהן. בשיטות אחרות שאינן אוטומטיות, כגון ניתוח זחילת הרשת, התנועה מקבלת ניקוד על ידי צופה אנושי, מה שמציג את האפשרות של סובייקטיביות ומגביל את התפוקה לחיה אחת בכל פעם6-7. מחקר דומה השתמש במבחן זחילה של 5 נתיבים, שמדד את הזמן שלקח לזחלים לעבור מרחק ליניארי מסוים8. במבחנים לא אוטומטיים כאלה, נמדדת תזוזה אך זה לא מביא בחשבון נסיעה לא ליניארית בין נקודות ההתחלה והסיום. כפי שנדון להלן, השיטה המתוארת כאן אחראית יותר לתנועת הזחלים בפועל, היא אובייקטיבית, קלה לתפעול ומציעה תפוקה חזקה.

כדי לחקור בקלות את התנהגות פעילות הזחלים מבלי להתפשר על דיוק, יעילות או עלות, שיטה זו משתמשת ב-TriKinetics Drosophila Activity Monitor (DAM), מכשיר המשמש לעתים קרובות לחקר פעילות מבוגרים. שימוש במכשיר אחד לחקר פעילות הבוגרים והזחלים הוא חסכוני, ומאפשר השוואה ישירה של תנועת בעלי חיים בשני שלבי חיים אלה. המערכת, הכוללת את הרזולוציה הגבוהה ביותר של היצרן, עושה שימוש ב-17 קרני גילוי אינפרא אדום לכל שפופרת בדיקה, המתעדות את פעילות הזחל כאשר קרני החיישן נשברות בתוך 16 הצינורות הבודדים. לאחר מכן המערכת שומרת באופן אוטומטי מידע מוקלט במחשב, מה שהופך אותו לזמין למניפולציה באמצעות תוכנת גרפים בסיסית. הנתונים המתקבלים מייצגים את הקרניים שנשברו על ידי זחלים בודדים (שניתן להמיר לקצב), תנועה כאשר זחל נשאר בתוך קרן גלאי ומיקום החיות בתוך תאי הבדיקה במהלך תקופת הקלטה (מה שמאפשר לחשב את העדפת המיקום). המערכת יעילה ופשוטה יחסית לתפעול, ומביאה ניתוח פעילות בסיסי הניתן לשחזור בהישג ידה של כל מעבדה החוקרת זחלי דרוזופילה.

כדי להדגים את כוחה של בדיקה זו, מוצגים נתונים המראים את השימוש בה כדי לאמת הבדלים בפעילות הנובעים מטמפרטורות סביבה משתנות, כמו גם באמצעות השוואה של מוטציה שתוארה בעבר כהיפואקטיבית (IAV1)9 עם בקרה שנותחה באופן נרחב (w1118).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת הזחלים

  1. כדי לנתח זחל רצוי להעדפת תנועה או עמדה, לגדול זחלים בתנאים סטנדרטיים לגיל הרצוי לassay 10 באמצעות מזון זבוב סטנדרטי 11.
  2. הפוך מסנן רשת על ידי מתיחת ניילון כיתה משי הרשת מעל משפך. אבטח את הרשת בצוואר המשפך עם גומייה. מניחים את המשפך בכוס.
  3. לאסוף זחלים לניתוח, לגרוף מרית מלאה של מזון המכיל זחלי ליקוט מבקבוק התרבות ולשטוף במים ברז RT על מסנן הרשת, איסוף זחלים בודדים ישירות מהרשת עם מכחול 10.

2. הכנת Assay צינורות

  1. כדי להכין לחבר צינורות assay, להרתיח בזהירות ג'ל אגר 4% ויוצקים לתוך צלחת פטרי לעומק של 1.5 סנטימטר. זה יספק התוספת לכל צד של הצינור כאשר חיה מוקפת. פתרון 4% הוא צפוף מספיק כדי למנוע מזחלי עמ 'enetrating התקעים.
  2. ודא שצינורות נקיים וברור לפני הכניסה של זחל. אם הם לא, זה עלול לחסום תנועות ממוקלטות.
  3. כדי להבטיח לי זחלי לחות מספקת לתנועה, להכין בקבוק לחיץ המכיל כמות קטנה של מים חמים. הפוך את הבקבוק, כוון את היציאה לכיוון כיור בזהירות ולסחוט בעדינות כדי לגרש מים מצינור האיסוף.
  4. הכנס את שקע הבקבוק לתוך צינור assay. לסחוט את הבקבוק כדי לספק אדי מים לתוך צינור assay עד שכבה דקה של עיבוי מופיעה על הקיר של הצינור. 1 וידאו מראה זחל נע בצינור עם כמות מתאימה של לחות.
  5. לאטום את הזחל בצינור, להסיר את הג'ל אגר 1.5 סנטימטרים עובי מצלחת פטרי ומניח על משטח רשת כדי לאפשר זרימת אוויר מתחת לאגרתי כך שתקע אגר יכול להיות מוכנס לתוך הצינור. לחץ קצה אחד של צינור assay לתוך הג'ל פעמיים כדי להכניס שני תקעים של ג'ל לקצה אחד.
  6. עם paintbלמהר, למקם את הזחל אחד לתוך הצינור כ 1.5 אינץ 'עמוק ולאטום את הצינור על ידי לחיצה על הסוף קרוב הזחל לתוך הג'ל אגר. הלחץ וכתוצאה מכך יאלץ את התקע השני של ג'ל אגר מהקצה השני ולאטום את החיה בתוך הצינור.
  7. צינורות מקום במכשיר MB5 Multi-Beam תסיסנית פעילות הצג (DAM), ולהתאים את עמדות הצינורות כך שבעלי החיים לא יכולים להתקדם מעבר לטווח של החיישנים.
  8. כדי להבטיח assay שצינורות לא להחליק מחוץ למסגרת קריאת אינפרא אדום של המכשיר במהלך הובלה, להחזיק את השפופרת במקום על ידי חיזוק טבעת של מרק סביב צינור אחד שבו אנשי קשר במכשיר ההקלטה.

פעילות 3. מדידה

  1. שיא פעילות בחממה כדי למנוע קריאות לא מדויקות שעלולות להתרחש כתוצאה מצללים, אורות ניאון או לשינויים בטמפרטורה במעבדה. ראה איור 5 להסדר מוצע של המערכת.
  2. הגדר חממה עד 20 ° C (ראה איור 1). כדי להימנע מהקלטות שווא בשל הפרעות ממקורות אור הליבון במהלך הקלטה, לכבות את האורות חממת ניאון ולהשתמש במקור אור LED נפרד בעת ההקלטה בחממה. לבצע ניסוי ללא כל בעלי חיים על מנת להבטיח שתנאי התאורה לא aberrantly לעורר חיישנים. לא צריך להיות שום נתונים תנועה נרשמו לאחר בדיקה זו.
  3. לאפשר זחלים להסתגל לטמפרטורה של 20 מעלות הגדרות C חממה ל5 דקות לפני תחילת assay.
  4. כדי להגדיר את מערכת DAM למרווחי הקלטה רצויה (למשל, 1 דקות), להבטיח תוכנת הקלטת מערכת סכר היא הורידה לארח מחשב 12 ולפתוח את קובץ מערכת DAM לפני החיבור לתא ההקלטה לממשק PSIU.
  5. כדי להגדיר את התדירות הרצויה ההקלטה שבה נתונים יישמרו, בחרו העדפות ולאחר מכן לחץ על מעל או מתחת לאפשרות מרווח הקריאה לבחירת מסגרות זמן שונה שבו נתוניםיאוחסן. לדוגמא, בחר לקרוא פעמים מרווח משניות 1 עד שעה 1.
  6. כדי לבחור פרמטר שונה לנתונים הקלטה, לבחור את העדפות ולאחר מכן בחר את התיבות המתאימות בסוג נתוני פלט (ספירה, מהלכים, עמדות ולהתעכב, ראה טבלה 1). כל פרמטר מספק ניתוח ייחודי של פעילות הזחל בתוך הצינור.
  7. כדי להתחיל בהקלטה, חבר את הצג לאספקת חשמל ממשק היחידה (PSIU) באמצעות כבל טלפון CAB6. חבר את PSIU לשקע חשמל. אור ירוק יציין חיבור מתאים.
  8. חבר את PSIU באמצעות כבל אפיק טורי אוניברסלי (USB) למקינטוש או Windows PC להקלטת נתונים. פתח את תכנית DAM SystemMB1v6x במחשב כדי להתחיל בהקלטת נתונים באופן אוטומטי.
  9. לאחר זמן האוסף הרצוי הוא שלם, בחר צא, ולאחר מכן צא עכשיו על מסך פעילות DAM; הנתונים לאחר מכן ניתן יהיו נשמרים באופן אוטומטי תחת מערכת נתונים DAM. קח קובץ נתונים זה (למשל, לעקוב אחר 1) וגרור לתוך תיקייה נפרדת. זה יהיה לאחסן את הנתונים הגולמיים מהתוכנה DAM, כך שהם יכולים מאוחר יותר להיות מעובד.

4. הכנת נתונים לעיבוד (DAM FileScan)

  1. כדי לעבד את המידע הגולמי לפורמט מובן לפתוח את יישום DAM FileScan ובחר תיקיית נתוני קלט בחר. לאחר מכן בחר את תיקיית הנתונים ואת הקובץ הרצוי, ובחר את אפשרות הסריקה. לבסוף בחר באורך בן לתקופה הקריאה הרצויה. זה יהיה לארגן את המידע הגולמי לפרמטרים שנקבעו על ידי המפעיל והתכנית תדווח את הנתונים שנאספו בטווח מסוים.
  2. בחר את סוג נתוני תפוקה לנתח את הגדרת התנועה הרצויה (ספירות צג, מהלכים, תשכנו). בתפריט קריאה נוספת, סכום בחר לפח (זה אם אורך בן גדול ממרווח קריאת המערכת שנבחר).
  3. שם הקובץ כראוי ולשמור. הקובץ יישמר באותו המיקום כמו התיקייה מצעד 3.9.
_כותרת "> 5. גישה לנתונים לניתוח

  1. כדי לאסוף מהלכים ממוצע, תהליך הנתונים הגולמיים המופקים מצעד 4. כדי ליצור טבלה בתוכנת גיליונות אלקטרוניים, לפתוח את הקובץ שנשמר בעבר (שלב 4.3), וכאשר חלון אשף יבוא הטקסט מופיע, גימור בחר לפתוח קבצי נתונים בפורמט גיליון אלקטרוני.
    הערה: בהתאם לסוג הנתונים מנותח, הגיליון האלקטרוני יהיה לקרוא בצורה שונה. בדרך כלל למדידת מהלכי צג או ספירה, תקופת המחקר הזמן תירשם מספרית, בזמן שכל צינור קריאה בודד יקבל מכתב מיועד. בעת הצגת הנתונים בגיליון האלקטרוני, עמודות KZ מייצגות את החריצים לצינורות assay 1-16 בהתאמה. השורות מייצגות את נקודות נתונים שנאספו.
  2. לדוגמא, אם מהלכים נאספו במשך 20 דקות במרווחי 1 דקות, בממוצע 20 השורות לחישוב מספר ממוצע של מהלכים / דקות ומדידות אחרות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מציג את התוצאות ממחקר תגובת טמפרטורה של זחלי instar השלישי שליטה, w 1,118, שימוש במכשיר הניטור כדי לזהות הבדלים בתנועת זחל בשבע טמפרטורות שונות. הזחלים נשטפו והניחו למכשיר פעילות DAM כפי שתוארו לעיל, והניחו בחממה להגדיר לטמפרטורה הרצויה. המנגנון היה אז מותר להסתגל לסביבה במשך 5 דקות לפני ההקלטה החלה. כל זחל נותח בנפרד עבור תנועה על פני תקופה של 20 דקות והמספר הממוצע של מהלכים לדקה חושב לכל בעל חיים וממוצע לכל קבוצה של 32 בעלי חיים. הנתונים נותחו ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פעילות של זחלים תסיסנית מושפעת על ידי מגוון של גורמים, כולל גנוטיפ 8, גיל 13 וסביבת טמפרטורה 2. למרות ששיטות videographic חזקות מסוגלים ניתוח מפורט ביותר שפותחו על ידי אלה שלומדים תנועה 5, זה ברמה של פרט עשויה להיות מיותרת למי שרוצה לקבוע פרמטרים בסיסיים של פעילות. השיטה המתוארת כאן מעסיקה מכשיר שזמין במעבדות רבות, קל לתפעול, מייצרת תוצאות מאוד לשחזור, וניתן לשליטה גם למי שעיקר מחקר מתמקד לא תנועה. תוצאות הדוגמא להוכיח כי assay ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי NIH P20GM103643 ל-I. Meng.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מוניטור פעילות דרוזופילה, Multibeam, 16 צינורות, כולל חוטיםTriKinetics Inc. MB5
לניטור פעילות טריקינטיקס בע"מ זכוכית PSIU24
80 x 5 מ"מ למוניטור פעילות (100)TriKinetics Inc. PGT 5x80
DAMsystemMB1v6x תוכנת רכישת נתונים עבור Macintonsh OSX (Intel)www.trikinetics.comהורדה בחינם
תוכנת DAMFileScan 108x עבור מקינטושwww.trikinetics.comהורדה בחינם
תוכנת USB (PSIUdrivers.zip).www.trikinetics.comלהורדה בחינם
DAMSystem Notes 308www.trikinetics.comלהורדה בחינם
Zeiss Stemi 2000C- סטריאו מיקרוסקופספקטרום שירותיםSP-STEMI2000C-BS
פחמן דו חמצנימיין אוקסימשטח הרדמה
Fly PadGenesee59-114משטח למיון זבובים מורדמים
מברשת צבע קטנה Winsor & Newton# 2 ROUNDאו דומה, המשמש למיון זבובים מורדמים
רשת הדפסת משי (160)msj-gallery.comSM160W63-3YDששימש בפרוטוקול זה היה ~ 0.1 מ"מ
TegoseptGenesee20-258חומר משמר
אתנול (190proof)Pharmco111000190שימש להמסת Tegosept
6 oz בקבוק תחתון מרובע (PP)Genesee32-130
"Flugs" לבקבוקי זבוב מפלסטיקGenesee49-100
בקבוקוני Drosophila, רחבים (PS)Genesee32-117
זיזים לבקבוקוני פלסטיק רחביםGenesee49-101
מדליית זהבשל קמח תירס צהוב ללא נבט
agarLabScientificFLY 8020
שמרי אופה -קמח המלך ארתורהאדום 1270
סוכר מגורען -דומינו
ממשק ספק כוח צינורות גודל נקבוביות Drosophila הכוכב משובח במיוחד

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tracey, W. D. Jr, Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila.gene essential for nociception. Cell. 113, 261-273 (2003).
  2. Ainsley, J. A., Kim, M. J., Wegman, L. J., Pettus, J. M., Johnson, W. A. Sensory mechanisms controlling the timing of larval developmental and behavioral transitions require the Drosophila.DEG/ENaC subunit. Pickpocket1. Dev. Biol. 322 (1), 46-55 (2008).
  3. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila. melanogaster.and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol. Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
  4. Cattaert, D., Birman, S. Blockade of the central generator of locomotor rhythm by noncompetitive NMDA receptor antagonists in Drosophila.larvae. J. Neurobiol. 48 (1), 58-73 (2001).
  5. Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila. hordotonal organ mutants. PNAS. 100 (26), 16053-16058 (2003).
  6. Nichols, C. D., Bechnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. (61), (2012).
  7. Godoy-Herrera, R. The development and genetics of digging behavior in Drosophila. arvae. Heredity. 56, 33-41 (1986).
  8. Sinadinos, C., Cowan, C. M., Wyttenbach, A., Mudher, A. Increased throughput assays of locomotor dysfunction in Drosophila. larvae. Journal of Neuroscience Methods. 203 (2), 325-334 (2012).
  9. Homyk, T., Sheppard, D. E. Behavioral mutants of Drosophila melanogaster. I. Isolation and mapping of mutations which decrease flight ability. Genetics. 87 (1), 95-104 (1977).
  10. Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila. larvae. J. Vis. Exp. (63), e3837(2012).
  11. Model Organisms I: yeast, Drosophila and C. elegans. Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education-database/3/essentials-of-biology-1-yeast-drosophila-and-c-elegans (2015).
  12. Woods, J. K., Kowalski, S., Rogina, B. Determination of the spontaneous locomotor activity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (86), e51449(2014).
  13. Troncoso, B., Godoy-Herrera, R., Waldo, M. The development of larval movement patterns in Drosophila). Heredity. 58 (1), 321-329 (1987).
  14. Helfrich, C., Engelmann, W. Circadian rhythm of the locomotor activity in Drosophila. melanogaster.and its mutants ‘sine oculis’ and ‘small optic lobes. Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).
  15. Johnson, A. W., Carder, W. J. Drosophila, ociceptors mediate larval aversion to dry surface environments utilizing both the painless TRP channel and the DEG/ENaC subunit, PPK1. PLoS ONE. 7 (3), (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Drosophila LarvaeLarval ActivityActivity MonitorTriKinetics DeviceInfrared DetectionAssay TubesData LoggingSoftware AnalysisAuger PlugsLarval Movement

מאמרים קשורים