In vivo לשעבר vivo גישות לחקר סרטן השחלות גרורתי התיישבות של מבני ספוט החלב בהצפק שומני

שלא כמו רוב הגידולים מוצקים, גרורות מסרטן בדרגה גבוהה השחלות הצפק (HGSC) מוגבלות לחלל הצפק ^1. לפיכך, טיפולי הצפק יעילים עלולים לשלוט או לחסל HGSC. נכון לעכשיו, גישה טיפולית סטנדרטית היא cytoreduction כירורגית בשילוב עם כימותרפיה ^1-3. למרבה הצער, הרוב המכריע של מטופלים חווים ולהיכנע לסיבוכים של הישנות מחלה. סטטיסטיקה העגומה אלה מראה את הצורך בהבנה משופרת של קולוניזציה גרורתית, התהליך שבו תאי הסרטן בתרגום ל, לנצל, ולהתרבות בתוך רקמות מארח כדי ליצור גרורות ^2.

Omentum הוא אתר מוקדם המועדף HGSC גרורות ^4-7. שלא כמו שומן הצפק אחר, רקמת שומן omental מכילה מבנים חיסוניים חריגים ידועים ככתמים חלביים, המכילים B, T, ותאי NK ומקרופאגים, אשר ממלאים תפקידי מפתח בhomeos הצפקtasis ^8,9. בנוסף לפונקציות הפיזיולוגיות שלהם, מצאנו כי כתמים חלביים למלא תפקיד פעיל בקולוניזציה גרורתית סרטן השחלות ^4. במבחני גרורות ניסיוניים, SKOV3ip.1, CaOV3, וHeyA8 (אדם) וID8 (עכברי; C57BL / 6) תאי סרטן השחלות במהירות הביתה לכתמים חלביים, המצביע על כך שהתאים לנוע לעבר גורם chemotactic מופרש. מעניין לציין, תאי סרטן לא ליישב שומן הצפק חסר כתמים חלביים (כלומר, האשכים ושומן רחם) ^4.

על מנת לזהות מנגנוני ויסות קולוניזציה מקום חלבי, יש לנו מודלים מותאמים xenograft המאפשרים החקירה של אירועים תאיים ומולקולריים במהלך קולוניזציה גרורתית ⁴ הזמן. יתרון ספציפי של הגישות המתוארות במסמך זה דגש על ארכיטקטורה ותפקוד רקמות, המאפשר למשתמשים לבחון השערות במשולבות במלואו ובמודלי vivo לשעבר vivo של מטר^4,10 קולוניזציה etastatic. על ידי השוואת לוקליזציה של תאי הסרטן וגידול במחסנים שומן הצפק אשר גם להכיל או חסרי כתמים חלביים, חוקרים יכולים לבדוק את תרומתו היחסית (ים) של תאי שומן ותאים בתוך כתמים חלביים ללינה והצמיחה ההדרגתית של תאי סרטן השחלה ברקמות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית.

כל העכברים שוכנו, מתוחזק ומורדם בהתאם להנחיות מוסדיות טיפול בבעלי חי ועדת שימוש (IACUC) ותחת פיקוחו של אוניברסיטת שיקגו בעלי החיים מרכז משאבים.

1. בעלי חיים הכנה ללימודים ניסויי

1. לאפשר חיות להסתגל לסביבה חדשה ודיור, להתאושש מהשפעות פיזיולוגיות אפשריות של תחבורה וטיפול.
   הערה: הטכניקה הבאה היא ישימה לכל הזנים הזמינים המסחרית של עכברים. מספר בעלי החיים שישמשו לניסוי תלוי בעיצוב המחקר וצריך להיעשות בהתייעצות מסטטיסטיקאי.

2. זיהוי ובידוד של מאגרי שומן הצפק.

1. להרדים בעלי חיים באמצעות מנת יתר של CO ₂ ושיטה פיזית משנית כדי לאשר מוות.
2. כמחסני שומן הצפק קציר מהווה הסרת איברים פנימית (שיטה משנית), תואר שניke חתך קו האמצע קרוב לגבשושיות מפשעתי דרך קיר הבטן לחשוף את האיברים הפנימיים (איור 1 א).
3. לOmental השומן (OM), לחשוף את הלבלב המורכב / omental ידי הרחבת הטחול מחלל הצפק עם מלקחיים (איור 1C). שחרר omentum מהלבלב והטחול על ידי זמירה מקרוב את כל חיבורי הרקמות. ודא שכל רקמת לבלב שנותרה הוא נכרת ^4.
4. לאשכי השומן (GF), להשתמש במלקחיים כדי להרים את שומן האשכים המקיף את השחלות ובלו על ידי חיתוך חיבורי רקמות (t העליון righ איור 1 א) ^4.
5. לרחם השומן (UF), להשתמש במלקחיים כדי להרים את שומן הרחם מקיף את קרן הרחם ובלו על ידי חיתוך חיבורי רקמות (איור 1 א ימני תחתון) ^4.
6. לmesenteric השומן (MF), לחתוך את הצומת בין המעי הדק והשוער. שימוש במלקחיים לתוקף אחיזת הקצה החופשי שלמעי דק, ולאט לאט "קליפה" זה מהשומן mesenteric. שחרר את שומן mesenteric משורש mesenteric באמצעות מספריים לנתח (איור 1 א השמאלי תחתון) ^4.
7. לSplenoportal השומן (SF), להרים את הקצה הדיסטלי של הטחול באמצעות מלקחיים לחשוף את להקת השומן הדק של רקמת חיבור hilum של הטחול ללבלב. בלו שומן splenoportal ידי השחרור הראשון אותו מהלבלב, ולאחר מכן בזהירות לנתח אותו מהטחול (איור 1) ^4.

3. החלב ספוט זיהוי באמצעות Giemsa מכתים

1. omenta בלו (ראה שלב 2.3) מעכברי C57BL / 6 ולתקן ב5% ניטראלי שנאגרו פורמלין ב 4 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות (O / N).
2. לפרפין הטבעת הרקמות קבועות, לבחור תבנית שמתאימה לגודל של הרקמות. יוצקים פרפין המותך ממאגר הנפט כדי למלא את התבנית. פתח את הקלטת ושימוש חם לפטריות לבנות, להעביר את הרקמה לתוך התבנית.
   1. כוון את הרקמות בזהירות במהלך פרפין הטבעה לייצר סעיפים אורך. מניחים את קלטת רקמות שהכותרת מעל דפוס ולחץ בחוזקה במקום. לאפשר העובש להתקרר במשך לפחות 30 דקות.
3. לחתוך קטעי סדרתי (4 מיקרומטר עבים) מפרפין-קבוע פורמלין מוטבע גוש רקמה (FFPE). מקום שקופית precleaned תחת הסעיפים כמו הסרט של רקמה יורד בלוק פרפין.
4. סדר סעיף כל omentum; לאסוף ולהכתים כל חלק שלישי לצביעה גימזה (ראה 3.6). לאפשר שקופיות זכוכית עם הסעיפים לאוויר יבש, רצוי O / N ב RT. מגלשות יבשות מוכנות לקיבעון. להכתים את הסעיף הראשון לhematoxylin ו eosin להשוואות לשקופיות Giemsa מוכתמים.
5. Deparaffinize השקופיות על ידי שני incubations 5 דקות רציפות בxylenes. רעננות שקופיות על ידי שני incubations רציף בפעולות הבאים: אתנול 100%, 95% אתנול, ולבסוף ברז water.
   1. לנקוט באמצעי זהירות נאותה כדי למנוע את השקופיות מייבוש. לבצע את כל הפעולות בRT.
6. לחלוטין לטבול את השקופיות בצנצנת Coplin המכילה 5% פתרון Giemsa (w / v מוכן במים ברז) ודגירה של 4 דקות ב RT. יש לשטוף את השקופיות במים ברז למשך 60 שניות, אוויר יבש והר עם coverslip באמצעות תקשורת הרכבה.
7. תמונת השקופיות המוכתמות באמצעות סורק שקופיות שלם ותהליך עם תוכנה של יצרן. לכמת את הנפח החלבי נקודה בסעיפי omental הצבעוניים Giemsa באמצעות תוכנת ImageJ ^4.

4. רביה והכנת תאי סרטן השחלות בvivo לשעבר vivo מחקרים

1. 15 מיליליטר טרום חם של מדיום גידול תא עד 37 מעלות צלזיוס באמבט חום. הכן בקבוק תרבות רקמה בגודל מתאים (למשל, אזור ² משטח 75 סנטימטרים) על ידי תיוג עם שמו של קו התא, מספר מעבר, תאריך ומי שהכין את המניה הקפואה, ואת התאריךואדם שמפשיר / ציפוי התא.
   הערה: במחקרים של גרורות מידע מפורט כזה הוא חיוני, כמועד הקפאה למטה ומספר מעבר יכול להשפיע על הפנוטיפ גרורתי.
2. שימוש בסביבת סטרילית של מכסה המנוע הבטיחות הביולוגי, פיפטה 10 מיליליטר של מדיום לתוך בקבוק תרבות T-75. הסר בקבוקון של תאים ממערכת החנקן הנוזלית ולבדוק את התווית כדי לאשר את סוג התא. להפשיר רק אחד בקבוקון של תאים בכל פעם על ידי התחממות 37 ° C אמבט חום.
3. באמצעות טכניקה סטרילית, פיפטה 1x10 ⁶ מופשר תאים לתוך בקבוק התרבות. מניחים את הבקבוק בחממה כדי לאפשר לתאים לצרף. נער בעדינות את הבקבוק קדימה ואחורה כדי ליצור השעיה תא אחידה.
   1. הנח בקבוק בתרבית רקמת חממה ולשמור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% הסביבה CO _2. לאפשר לתאים לדבוק O / N.
4. תקשורת לשאוב, ולהחליף עם תקשורת צמיחה מחוממת מראש טרי. מניחים את הבקבוק בחממה וכלתאי ow לגדול. צג תא צמיחה מדי יום על ידי בדיקה ויזואלית כל 2-3 ימים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. להשתמש בטכניקות תרבית תאים סטנדרטי לתאי מעבר עם הגיע מפגש 70-80%.
   הערה: מבחני ניסיוניים לקצור את התאים בנקודת מפגש 70% כדי להבטיח שתאים באופן פעיל מתרבים.
5. לשאוב את מדיום התרבות ולשטוף עם 10 מיליליטר של תמיסת מלח שנאגרו פוספט סטרילי (PBS). לשאוב PBS ולהוסיף 0.25% טריפסין / EDTA (2 עד 3 מיליליטר לשטח 75 סנטימטר ²⁾ דגירה 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. מבחינה ויזואלית לאשר כי התאים מנותקים ולהוסיף נפח שווה של מדיום גידול, ובעדינות פיפטה תאים למעלה ולמטה כדי לקבל השעיה תא בודדת.
   הערה: זה קריטי, כי מדיום הגידול מכיל סרום כפי שמנטרל טריפסין. הכן לפחות 2 עד 4-לקפל יותר תאים מהמספר דרוש לניסוי נתון, כדי לפצות על אובדן של תאים בשלבים הבאים
6. לקבוע את אחוז תאי קיימא בהשעיה באמצעות assay הרחקת trypan הכחול באמצעות hemacytometer או דלפק תא אוטומטי.
   שים לב: כאן, השתמש רק בהכנות תא שבי ≥ 96% מתאי קיימא.
7. מעבירים את ההשעיה התא מהבקבוק לצינור חרוטי 50 מיליליטר. תאים גלולה על ידי צנטריפוגה 5 דקות ב1,100 XG, ב 4 ^{מעלות צלסיוס}
8. לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב PBS לריכוז של 2x10 ⁶ תאים לכל מיליליטר.

5. הזרקה של תאי Intraperitoneal

הערה: בניסויים שלנו, עכברי מטופלים בזרימת אוויר למינרית או ארון בטיחות ביולוגית במתקן המחסום שלנו, במטרה לצמצם את הסיכון לחשיפת הפתוגן, כדי להדגים את הטכניקה הזו באופן ברור, הנהלים בווידאו הנלווה נערכו במעבדה המאושרת לעבודה של בעלי חיים. טכניקה מיוחדת זו אינה דורשת חיות להיות תחת הרדמה. תחת פרוטוקולים שאושרו, לבצע techniq זהUE בבעלי חיים. השתמש בזנים מתאימים של עכברים במחקר זה. לדוגמא: להשתמש בעכברי מדוכאי חיסון, athymic בעירום לחקר תא סרטן השחלות אנושי (SKOV3ip.1, וHeyA8) קולוניזציה; להשתמש C57BL / 6 עכברים עם מערכת חיסון למחקר של תאי סרטן השחלות קולוניזציה עכבר (ID8).

1. עומס 500 μl של ההשעיה התא הבודד לתוך המזרק ולשים במחט סטרילית כתרים 25 G. הפעולה זו מפחיתה את תא גז לפני ההזרקה.
2. בחר את העכבר על ידי בעורפו של הצוואר ולהחזיק את הזנב באמצעות הכף והאצבע ולתקן את הרגל האחורית השמאלית בין הטבעת לאצבע קטנה (כאשר העכבר מאופק עם יד השמאל).
   הערה: כדי להימנע מאברי בטן טראומה, לרסן את העכבר כל כך טוב שהוא לא יכול לזוז במהלך ההזרקה.
3. תארו לעצמכם קו רוחב הבטן ממש מעל הברכיים, ולאתר נקודה בצד ימין של החיה וקרובה לקו האמצע. נקודת הכניסה היא גולגולת ולמעט המדיאליהפטמה האחרונה.
   הערה: החדרת המחט בצד הימין של העכבר תמנע את cecum ומפחית את הסיכון לניקוב המעיים ^11.
4. הכנס את המחט באזור התחתון של הבטן לרוחב של העכברים לעומק של כ -0.5 סנטימטר. למשוך בחזרה על הבוכנה כדי לאשר שהמחט לא חדרה כלי דם או איברים אחרים הצפק.
   1. אם כל נוזל להישאף להשליך את המזרק (ומדגם) ^11. לשאוב ירקרק-חום או צהוב מציין חדירת מחט לתוך המעיים או בשלפוחית ​​השתן, בהתאמה.
5. להזריק המדגם באמצעות לחץ איטי ויציב. למשוך את המחט ולהחזיר את העכבר לכלוב שלה. אל לסכם מזרק לפני הרשות במכל חדים.
6. עכברי קורבן באמצעות CO ₂ מחנק והסרת איברים חיוני בנקודות זמן ספציפיות לפרסם הזרקה.

6. קולוניזציה מקום החלב בvivo

1. Quantitation של לוקליזציה של תאי סרטן לכתמים חלביים באמצעות cytometry זרימה
   1. לבודד מחסני שומן הצפק מעכברים (כמתואר בשלב 2.3-2.7) הוזרק מתויג fluorescently תאי סרטן ורקמות מקום מיידיים בPBS קר כקרח.
      1. לטכניקה זו בפרט, משקל התאמה כל רקמות שומן שומן לomentum. העברת רקמות להפריד 5 מיליליטר צינורות המכילים 1.5 מיליליטר של סרום ללא DMEM ושל 0.1% (w / v) אלבומין בסרום שור. רקמות בריכה שנקטפו משלושה עכברים עצמאיים כדי להבטיח תשואה מספקת של תאים לcytometry זרימה.
   2. רקמות בשר טחון באמצעות מספריים כירורגיות ולהוסיף 1.5 מיליליטר של הסרום ללא DMEM המכיל 0.4% (w / v) collagenase I. דגירה ההשעיה רקמות על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם ערבוב סיבובי.
      1. כצעד אופציונאלי, נוסף לנתק רקמה על ידי לעיסה. במקרה זה, להעביר את ההשעיה רקמות collagenase לשקית microstomacher, ללעוס במשך 10 דקות על נמוך, מסתובב האורינטציהשל השקיות לאחר 5 דקות.
   3. דגימות סינון דרך מסנן רשת ניילון (60 מיקרומטר נקבובית) כדי להסיר שאריות גדולות יותר. איסוף תאים באמצעות צנטריפוגה ב 250 XG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס וזורקים את חלק supernatant.
   4. Resuspend התא גלולה בשל PBS 100 μl בשילוב עם 900 μl של חיץ תמוגה ACK ולדגור על RT דקות 1. תאי צנטריפוגה ב 250 XG במשך 5 דקות וזורקי supernatant.
      1. Resuspend התא גלולה ב250 μl של PBS קר כקרח. סנן את הדגימות באמצעות רשת ניילון נקבובית 60 מיקרומטר כדי להבטיח השעיה תא בודדת. יש לשטוף את המסנן עם 250 μl של PBS קר כקרח.
   5. לכמת את מספר התאים מתויגים fluorescently באוכלוסייה באמצעות cytometer זרימה מצויד בליזר צהוב-ירוק-561 ננומטר וננומטר 585/15 ננומטר מסנן bandpass. הגדר את השער לתאי tdTomato-חיובי המבוססים על ניתוח של תאי הורים ו / או בקרות שליליות מתאימות ^4.
   6. Quantitation של גרורות מיקרוסקופיות ומקרוסקופיים
      1. בנקודת הסיום הרצוי הניסיונית (ים), לבודד, ומייד למקם את הרקמות בתקשורת הקיבעון המתאימה. תקן דגימות גדולות יותר, כגון האשכים שלמים, רחם, ומחסני שומן mesenteric ב 10% ניטראלי שנאגרו פורמלין למשך 48 שעות על 4 מעלות צלזיוס. תקן דגימות קטנות (omental ושומן splenoportal, כמו גם שווי רקמות של רחם ושומן mesenteric) ב 5% ניטראלי שנאגרו פורמלין ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 2-16.
         1. לחלופין, הצמד להקפיא רקמות על ידי הצבת אותם במדיום הקפאה כגון OCT ושחרר לכמות מתאימה של חנקן נוזלי.
      2. העברה קבועה רקמות לאתנול 70% ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד ההטבעה בפרפין. שבץ ורקמות תהליך כפי שתואר ב3.2 ו -3.3.
         1. השתמש בסעיף H & E המוכתמת להעריך רקמות לנוכחות או עדר של גרורות מיקרוסקופיות (כלומר, אשכולות של 50 תאים). אשר לאהוא הנוכחות של גרורות מיקרוסקופיות בשיטה משנית כגון כתם IHC לcytokeratin 8/18 כדי לזהות תאי סרטן השחלות.

   7. החלב ספוט התיישבות Ex Vivo

   1. הקמת תנאי תרבות הבסיסיות vivo לשעבר איבר omental
      1. מניחים כל omentum להוספת צלחת תרבות אחת ומקום בתוך היטב אחד של צלחת תרבית רקמת עשר היטב המכילה 500 μl של תקשורת / F12 DME FCS המכילה 20%. לשמור על תרבויות איבר על 37 מעלות צלזיוס בסביבת 5% CO ₂ במשך 24 עד 48 שעות ו / או נקודות זמן נוספות. להשתמש בשלוש omenta העצמאי (דגימות בשלושה עותקים) לכל מצב (למשל, סוג תקשורת / נקודת זמן).
      2. כדי לאשר את תקינות רקמות בנקודתי הקצה הניסיונית, לתקן ודגימות תהליך כפי שמתואר בשלב 3. ספירה בריאה לעומת adipocytes נמקים בסעיפי H & E יכולה להעריך שלמות רקמות. מינימום של 120 ~ תאים מ5 דגימות ביולוגיות נדרש לגבש אחוז רקמת חיה כיום ^10.
      3. כדי למדוד תפקוד רקמות, omenta המקום (n = 3) בבארות נפרדות של צלחת 24 היטב המכילה 500 μl של תקשורת / F12 DME עם FCS 20%. לאפשר omenta להתנות את התקשורת על 37 מעלות צלזיוס בסביבת 5% CO ₂ למשך 24 שעות, ולאחר מכן להסיר 250 μl לשימוש בELISA assay IL-6 ^10.
   2. שיתוף תרבות vivo לשעבר של omentum העכבר עם תאי SKOV3ip.1-GFP
      1. לגדול ולהכין תאים מתויגים fluorescently כאמור בסעיף 4 וגלול בריכוז של 2 × 10 ⁶ תאים למ"ל.
      2. החל ~ 6 μl של דבק רקמות הקרום של להכניס את התרבות ולאפשר לו אוויר יבש. לשטוף את הממברנה פעמיים עם מים סטריליים כדי להסיר כל דבק מוגזם. אוויר יבש הקרומים מתחת למכסת מנוע למינרית.
      3. בלו בזהירות את omenta ולצרף אותו לmemb המצופה הדבקהRANE באמצעות מלקחיים סטרילית. לאפשר לרקמות לדבוק בקרום 1 דקות לפני הוספת תקשורת. הוסף 500 μl של ההשעיה התא זה על גבי זה omentum בכל הכנס תרבות. מלא סביב תא transwell האזור עם 2.5 מיליליטר של DME / F-12 ^10.
      4. דגירה omenta עם השעיה תא במשך 6 שעות על 37 מעלות צלזיוס בסביבת CO ₂ של 5%. מוציא בזהירות ולשטוף את omenta עם ~ 10 מיליליטר של PBS. דמיינו מוקדי תאי סרטן ניאון באמצעות מערכת הדמיה ניאון מתאימה ^10.

זיהוי ובדיקה היסטולוגית מאגרי שומן הצפק

נתיחה אנטומיים גולמית מאפשרת זיהוי של ארבעה מחמשת המקורות העיקריים של שומן הצפק (איור 1 א). נע בכיוון השעון מהמרכז העליון הם: omentum (OM; התווה) ממוקם על הבטן והטחול, שומן האשכים (GF) המקיף את השחלה השמאלית (OV), שומן הרחם (UF) שצורף לקרני הרחם (אה) ולפדר (שלי) מחובר למעי הדק (SI). השחלה (OV), קרן רחם (אה), ובמעי הדק (SI) מצוינות כנקודתי התייחסות. שומן splenoportal (SP) מקיף את עורק הטחול ומחבר את hilum של הטחול לעורק צליאק (איור 1). לבסוף, omentum מחובר לקיבה והלבלב (איור 1 ג). המבנה הגולמי והגודל יחסי של רקמות אלה מוצגים באיור 1D. בדיקה היסטולוגית של הרקמות דואר מראה כי splenoportal ושומן omental לכלול מבנים חלביים נקודה [MS] בפריפריה הרקמה, מוקפים adipocytes []; רחם, האשכים, ושומן mesenteric לא (1E איור).

זיהוי נקודת החלב באמצעות Giemsa מכתים

כדי לאפשר ההשוואה של תוכן מקום חלבי הכולל בין זנים שונים עכבר, חלבי נקודת נפח ושטח נוכחי בomenta פרט ונרשמת בשיטה חדשנית. כפי שתואר בשיטות, "הר שלם דיגיטלי" של omenta נבנה על ידי צביעת כל חלק שלישי של רקמה בפתרון 5% Giemsa ולכידת תמונות של הרקמות המוכתמות (איור 2 א). כתמי החלב יופיעו כאזורים מכתימים בצבע כחול כהה (איור 2). זהותם של האזורים אלה ככתמים חלביים אושרה בסעיפים סדרתי על ידי שתי צביעת H & E וIHC לתאים חיוביים לCD45, סמן הלימפוציטים נפוצים ( אל et 4, תמונות (איור 2 א) לוקטו ועובדו לבנייה "הר שלם דיגיטלי", שלאחר מכן יכול לשמש כדי לחשב את הנקודה החלבית אזור הנפח ובomenta הבודד.

הערכה כמותית ואיכותית של קולוניזציה הסרטן של omentum

שיטה מבוססת cytometry זרימה פותחה על מנת לכמת את מספר תאי הסרטן נמצאים במחסני שומן לאחר הזרקת intraperitoneal. פרוטוקול זה שימושי במיוחד כדי ללמוד את צעדי התישבות מוקדמות של התהליך גרורתי. לדוגמא, באיור 3 א, תאי ID8-tdTomato הוכנו והזריקו intraperitoneally לעכברי C57BL / 6. בשעת 7 ימים לאחר הזרקה (dpi), איברי השומן נקצרו וניתקו לתוך השעיה תא בודד כמתואר בשיטות. מספר לסה"נ tdTomatoLLS היה לכמת באמצעות cytometry זרימה (איור 3 א, משמאל). Omentum הראה עלייה של כ 12-פי במספר האירועים tdTomato-חיוביים, יחסית לPBS- הזריק בקרות (איור 3 א, ימין), אבל לא היה גידול משמעותי בהכנות תא משומן האשכים, שומן רחם, או לפדר . גישה מבוססת IHC איכותי משלימה גם הראתה כי 7 ימים לאחר הזרקת ה- IP של תאי SKOV3ip.1, נגעי תאי הסרטן דומים נצפו גם בשומן omental וsplenoportal (איור 3). IHC לפאן-cytokeratin האנושי (פאן-CK) מאשר את נוכחותם של תאי סרטן בתוך הכתמים החלביים. הספציפיות של צביעת IHC אושרו באמצעות שליטת IgG לנוגדן פאן-cytokeratin (איור 3). קולוניזציה סרטן השחלות ID8 של מחסני שומן הצפק הוערכה באמצעות C57BL עכברים / 6 בשעת 7 dpi. נגעי תאי הסרטן גדולים בכתמים החלביים של שני omentum ושומן splenoportal בחוץבשורה. אשכולות קטנים של תאי הסרטן נראו מדי פעם במחסנים שומן אחרים, כפי שמודגמים בהבלעת הפנל. לפיכך, אחד יכול לגשת הן את המספר והמיקום של תאים ביחס בתוך רקמה נתון.

assay vivo לשעבר ללמוד קולוניזציה סרטן השחלות של כתמים חלביים

כדי להתמודד עם המגבלות של תנאי in vivo, תוך שמירה על הרכב ומבנה רקמה, אנו מותאמים גישת vivo לשעבר ללמוד קולוניזציה תאים סרטניים בשחלות של רקמות omental. רקמות omental כל נכרת מן העכברים בהצלחה בתרבית לשעבר vivo ללמוד אינטראקציה סרטן השחלות עם כתמים חלביים. תאי SKOV3ip.1-GFP היו זורעים על vivo לשעבר רקמות omental התרבותית ונשמרו על 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה של 6 שעות. תאי ניאון GFP החיובי היו גלויים במוקדים דיסקרטי בשני vivo לשעבר וin vivo (איור 4 א). תחת שני התנאים, אימות היסטולוגית באמצעות הצביעה H & E אישרה לוקליזציה של תאי סרטן לכתמים חלביים (איור 4). כתם מאשרים באמצעות כתם cytokeratin לתאי הסרטן הראה הנוכחות של מוקדי תאי הסרטן בתוך הכתמים החלביים (איור 4C). נתונים אלה מראים את הכדאיות של שימוש vivo לשעבר מתקרבת ללימודים מבוססי מנגנון כדי להשלים את ממצאי in vivo.

איור 1. מקומות ומבנים יחסי של מחסני שומן הצפק העיקריים. נתיחה אנטומיים גולמית המראה את המיקום היחסי של ארבעה מחמשת המקורות העיקריים של שומן הצפק (). Omentum (OM; התווה), שומן האשכים (GF), שומן רחם (UF), לפדר(שלי), השחלה (OV), קרנות רחם (אה), ומעי דק (SI) מוצגות שומן Splenoportal (SP; התווה) (ב). נחשף על ידי הרמת הטחול עם מלקחיים (C) omentum העכבר הראה גזור. חופשי מהלבלב כדי לשפר את ההדמיה D:. גדלים ומבנים של שומן הצפק נכרת יחסית; לפדר מוצג מחובר לשורש mesenteric. הערכת א היסטולוגית של שומן הצפק לנוכחותם של כתמים חלביים adipocytes (), (MS) מקום חלבי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. גישה מבוססת Giemsa לכימות כתמים חלביים ברקמת omental. (); תמונה של קטע השלם omentum מוכתם Giemsa. סעיפים סידוריים של רקמת omental הוערכו על ידי: צביעה (B) Giemsa; כתמים חלביים מצוינים עם חצים שחורים (ג) H & E מכתימה.; , ו( ד) IHC באמצעות נוגדן אנטי CD45 לזהות ימפוציטים בתוך מבנה המקום החלבי. סרגל קנה המידה הוא אותו לBD ומציין 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

3. תאי סרטן השחלות איור מעדיפים ליישב שומן הצפק המכיל כתמים חלביים. Cytometric זרימת מנתח של omentum (OM), שומן רחם (UF), שומן האשכים (GF), ולפדר (שלי) שנקטפו מן העכברים ב 7 dpi של ID8- תאי tdTomato (משמאל). הנתונים מוצגיםכמתקפל שינוי גידול של תאים tdTomato-postive על עכברים שהוזרקו-PBS (מימין). ברים שגיאה מצביעים סטיית התקן של הממוצע. ** מציין p <0.01 בהשוואה לקבוצת ביקורת PBS. בחינה (B) של רקמות על ידי שתי היסטולוגיה סטנדרטית וIHC תערוכות קולוניזציה הדומה של כתמים חלביים בשני omentum ושומן splenoportal (לאחר ההזרקה של 1x10 6 תאים SKOV3ip.1 לעכברים עירום). סעיפים הוערכו על ידי צביעת H & E. נוכחותם של תאי אפיתל (סרטן) בנגעים אושרו על ידי זיהוי IHC של cytokeratin באמצעות פאן-cytokeratin נוגדן (פאן-CK). IHC באמצעות נוגדן אלוטיפ IgG לפאן-cytokeratin שימש כביקורת למכתימה סגוליות. סרגל קנה המידה הוא זהה עבור כל התמונות ומציין 100 מיקרומטר. (ג) הערכה של קולוניזציה סרטן השחלות ID8 של מחסני שומן הצפק בC57BL עכברים / 6 בשעת 7 dpi. אנא לחץכאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

קולוניזציה איור 4. vivo לשעבר של תאי סרטן השחלות לomentum. העמודות מייצגות השוואה של שלושה תנאי הניסוי מראים omenta הנאיבי (משמאל), הזרקת ההודעה IP omenta מעכברים 6 שעות של 1 x 10 6 תאי SKOV3ip.1 (במרכז) וomenta עם SKOV3ip.1-GFP יישב בתנאי vivo לשעבר (מימין). omenta נאיבי (בלנק), יישב omenta ידי SKOV3ip.1-GFP מassay in vivo (קובץ מצורף in vivo) או omenta יישב על ידי SKOV3ip.1-GFP בתנאי תרבות לשעבר vivo (קובץ מצורף vivo לשעבר). הדמיה של הקרינה omenta כל לGFP מציגה דפוס התישבות דומה לשני in vivo ומבחני vivo לשעבר (). צביעת H & E סעיפים סידוריים שלomenta מפנל מאשר את נוכחותם של תאי הסרטן מקומיים לכתמים החלביים (B). Cytokeratin לתאי סרטן השחלות מאמת צביעת H & E (C). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

למחברים אין מה לחשוף.