במבחנת דוגמנות של פלישה העצבית סרטנית: מודל גנגליון השורש הגבה

גידולים מוצקים להפיץ בשלוש דרכים עיקריות: פלישה ישירה, ממרח הלימפה, והתפשטות hematogenic. עם זאת, יש אמצעי הרביעי של התפשטות סרטן זה התעלם לעתים קרובות, הפצה לאורך עצבים. פלישה עצבית סרטנית (CNI) היא מסלול ידוע של התפשטות הסרטן, במיוחד סרטן של הראש והצוואר, ¹ הערמונית ^{2, 3} ולבלב. CNI ^4-8 מתרחש בלמעלה מ 80% של אנשים עם אדנוקרצינומה של לבלב, מוביל כדי גידול retroperitoneal התפשט עצבי גנגליון צליאק. יש תאים סרטניים neurotropic אלה יכולת ייחודית להעביר בכיוון אחד לאורך עצבים כלפי מערכת העצבים המרכזית (CNS). ⁹ ממצא זה מצביע על כך microenvironment perineural יכול להיות מנוצלת על ידי תאי סרטן, מתן הגורמים התומכים גידול ממאיר.

אחד הדגמים כמה במבחנה למחקר CNI הוא הגרעינים השורש הגבי (DRG) / דגם תאים סרטניים. mod זהאל משמש לעתים קרובות כדי לחקור את האינטראקציה בין תאי paracrine stroma והסרטן עצביים. ^10-18 במודל זה, עכבר או שורות תאים סרטניים אנושיות גדלות תאי מטריקס (ECM) סמכו הכנות של DRG המתורבת טרי ניתק.

מאמר וידאו זה מציג את היישום של במבחנה CNI ב אדנוקרצינומה ductal הלבלב.

ארבע עד C57BL נקבה שישה בן-שבוע / CJ עכברים (הרלן, ירושלים, ישראל) שימשו בניסוי פי האגודה הערכה וההסמכה של מפרטים טיפול בבעלי חיים מעבדה. כל הפרוצדורות בוצעו בהתאם טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדה השתמש ומח' תקנות חקלאות.

1. קציר חוט השדרה

1. להרדים את העכבר באמצעות תא ₂ CO. הימנע נקע בצוואר הרחם כיוון שהוא עלול לגרום נזק שורשי גנגליון בשל כוחות גזירה. מכאן ואילך, לבצע את כל השלבים בתנאים סטריליים.
2. משרים את חיה עם 70% אתנול. שלב זה חשוב עבור עיקור למניעת השיער מגרירת דרך האיברים הפנימיים.
3. השאירו את העכבר להתייבש מן אתנול. מנע כל מגע של אתנול עם האיברים הפנימיים בשל רעילות עצבית.
4. לאחר ייבוש העכבר, מקם אותו באמצעות סיכות אפרקדן(פנים למטה). מניחים את הפינים שעל כל hindlimb ו forelimb.
5. בעזרת מלקחיים, לעשות חתך קו אמצע הארכת craniocaudally מהצוואר האחורי של הגב התחתון. לאחר מכן, להעלות דשי עורי באמצעות מלקחיים בילטרלי ולחשוף הרקמה התת עורית.
6. למשש גולגולת עכבר עד שמגיע לצומת craniocervical. בעזרת מספריים בניצב החיה, בקעה את שרירי צוואר רחם עמוד שדרה בצומת craniocervical (חוליות צוואר הרחם ^-7), באמצעות מלקחיים כבדים. לנתח את עמוד שדרת caudally, ולהסיר את עמוד השדרה עם מלקחיים כבדים עד שהגיע לרמת המותני (רמת גפיים אחורית).
7. בצע חיתוך רוחב זנב מלא ברמת עמוד השדרה המותני (חוליות 5 ^th) באמצעות מלקחיים כבדים.
8. מגלגלים את העכבר מעל (עם הפנים כלפי מעלה). אין צורך לכסות את החתך מאז DRG מופק רמות שדרה תחתונות ולא צוואר הרחם.
9. צמצמו על קו האמצע מהצוואר אל הבטן, לחזור בועור רוחבי ואז לחתוך כדי לפתוח את הצפק.
10. הסר את האיברים הפנימיים בתוך הצפק (כבד, טחול, לבלב, קיבה ומעי) כמקשה אחת. לאחר מכן, להסיר את איברי retroperitoneal (כלומר, כליות ולבלב). Cranially, לפתוח את בית החזה.
11. בעזרת מלקחיים להב כירורגי, לחתוך את הצלעות, משאיר 5 מ"מ של צלעות בילטרלי משם מעמוד השדרה. בשלב זה, עמוד השדרה מופרד משאר הגוף.
12. שטפו את עמוד השדרה מדם עם בופר פוספט טרי קר (4 ° C) (PBS) פעמיים.

2. בידוד השורש הגבה גרעינים (DRG)

1. השתמש stereomicroscope עם הגדלה 4X.
2. מקם את עמוד השדרה על פלטפורמה קולטת הלא לא חסידה (Telfa / ניילון). מקם את הפנים עמוד השדרה למעלה על האוריינטציה סקראל הזנב אותו.
3. הסר את כל שרירי עמוד שדרה ורקמות חיבור. השתמש צלעות כציון דרך לעצבים כפי שהםלעזוב את עמוד השדרה. צלעות גם להגן על העצבים מן הכלים כירורגיים. DRG ממוקמים בחלק הצווארי, החזי, ואתרי המותני של החוליות.
4. לאחר מכן, מספריים באמצעות לחתוך את הגוף בחוליות קו האמצע ולחשוף את חוט השדרה ושורשי DRG ידי הכחשה לרוחב עדינה של הגוף בחוליות.
5. במרחב צלע, בצע את העצבים ההיקפיים מדיאלית לאורך לרוחב צלע אל DRG.
6. זהה את DRG. זה נראה כמו חלמון של 'ביצת עין' שוכב על העצב.
7. חותכים את דיסטלי עצב צלעי אל DRG עוזב 2-3 מ"מ של דיסטלי החוצפה הגרעינים, לשמש הכחשה. זה "זנב" יוסר לאחר הקטיף.
8. אחוז העצב באמצעות מלקחיים. צביטת הגוף DRG עצמו יגרום נזק לתאים עצביים יש להימנע.
9. מתקרב DRG proximally יחד התקשרותו אל חוט השדרה, באמצעות הקדמי שלה ושורשים אחוריים.
10. החל הכחשה עדינה על DRG ידי משייכת EFעצב ferent (גדם עצב צלעי) רוחבי, וחתך את הקדמי ואת האחורי שורשים הקרוב DRG.
11. שמור את DRG בצלחת פטרי 35 מ"מ מלא DMEM טרי קר, קרח בתוספת 10% נסיוב עגל עוברית (FCS), 1%, סטרפטומיצין פניצילין, 1% חומצות אמינו לא חיוניות, ו פירובט סודיום 1%.

3. השרשה בצלחת פטרי

1. בצע את הצעדים הבאים על הקרח באמצעות פיפטה טיפים מראש מקורר כדי למנוע התמצקות ECM.
2. תחת סטראו בהגדלה 2-4X, מניחים צלחת פטרי תחתית זכוכית 35 מ"מ על רשת נייר.
   חשוב: עבודה על קרח כדי לשמור על ECM במצב נוזלי. צור נקודה בקוטר 1 מ"מ (כ 20 μl) של ECM מדולדל גורם הגדילה במרכז הרשת.
3. תחת להדמיה ישירה, למקם את DRG במרכז המקום ECM קרוב לתחתית של המנה.
   הערה: התאים הסרטניים בשימוש בפרוטוקול זה הם תאים סרטניים בעכברי לבלב (KPC) establisהד מ דגימות הגידול מבודדים טרי מעכברים KPC כמתואר במקום אחר ^19.
4. קציר תאים 40,000 סרטן מתרבויות ומחוברות, לשטוף אותם פעם אחת עם PBS, resuspend אותם 40 ECM μl על הקרח.
5. תחת ראיה ישירה של הרשת באמצעות מיקרומטר סטראו מידה 500 בכל כיוון מן DRG. בשלב זה לאט זרע 10,000 תאים / 10 μl ECM. השתמש טיפ 2-10 μl precooled להזריק את התאים קרובים לתחתית הצלחת, הימנעות ההתפשטות שלהם במטריצה ​​או הניתוק של מטריקס. (איור 1).
6. משאיר את הכלי בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית במשך 10-15 דקות כדי לחזק. הימנע ייבוש ECM.
7. לאט לאט להוסיף DMEM, שהוכן כאמור, על הקיר הצדדי של הצלחת. הוסף מספיק בינוני כדי לכסות את ECM (כ 2 מ"ל).
8. שים את הצלחת בחזרה אל האינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס.
9. חלף בינוני עם בינוני טרי ביום הבא.
10. החלף את המדיום כל 2 ימים. </ Li>

4. רכישת נתונים, זמן לשגות Videomicroscopy

1. ביום 7 לאחר ההשתלה, לקחת את הצלחת עבור מיקרוסקופיה זמן לשגות. שים לב תאים מסוימים עשויים לחייב רכישה מוקדם יותר בגלל הגירה מהר.
2. במהלך ההדמיה לחיות, במקום צלחת בסביבה סגורה בטמפרטורה ממוצעת של 37 ± 0.1 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
3. רשום את התאים באמצעות מצלמת המכשיר מצמידים תשלום מושם על המיקרוסקופ.
4. קח תמונות דיגיטציה כל 10 דקות עד 72 שעות כדי לעקוב אחרי תנועת תא בין שלושה לשישה תאים שונים.
5. חלף בינוני לאחר 24 שעות.
6. בצע רכישת נתונים וניתוח פשוט באמצעות תוכנת מיקרוסקופ.

ניתוח 5. נתונים

1. עבור יישומים מתקדמים יותר (כלומר, מעקב תא 2D או 3D) להשתמש בתוכנה מיוחדת (כגון Imaris 4D). הערה: תוכנה זו קובעת את קואורדינטות XY של תאבכל רגע נתון, יחד עם המרחק ממקור, ומהירות תנועה.
2. לחשב את המהירות הממוצעת על ידי מדידת מרחק הנסיעה בין עמדות שלאחר מכן ב 10 מרווחי דקות. חישוב מדד ההגירה הקדמי (FMI) המהווה את המרחק של חזית התא מן neurite ומתאר את התנועה חד כיווני של התאים כלפי DRG.

לדימות באמצעות מיקרוסקופיה וידאו, DRG ניתן לראות הנבטה neurites 5-7 ימים לאחר ההשתלה בעוד תאים סרטניים נודדות הרחק ממושבות שלהם כלפי DRG. עד היום ה -7 לאחר ההשתלה, התאים הסרטניים לבוא במגע עם neurites (איור 2).

מדד ההגירה קדימה של תאי סרטן הלבלב השתמשו בפרוטוקול הוא 3-4 לקפל גבוה יותר מזה של שורות תאים אחרים (QLL2, B16F) (איור 3 א). איור 3 ב מציג X נציג ו- Y לתאם גרף, המתאר את נתיב הגירה של תא סרטני KPC במגע עם העצב; ניתוח videomicroscopy זמן לשגות הראה הבדלים בתנועה קדימה אבל לא מהיר בין תאי KPC ותאים שאינם פולש (איור 3 ג-ד).

איור 1 "src =" / files / ftp_upload / 52,990 / 52990fig1.jpg "/>
איור 1:. איור סכמטי של הפרוטוקול אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2:. תא סרטני הפלישה לאורך נוירונים של DRG (א) DRG (למעלה) תאים סרטניים (למטה) ביום 0 לאחר זריעה (הגדלה 5X). (ב) DRG וסרטן תאי ביום 7 לאחר הזריעה (גדלת 5X). (ג) תאים סרטניים נודדים לאורך הנוירון DRG (חיצים). כל הברים מייצגים 50 מיקרומטר. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

בתוך-page = "1">
איור 3:. השורש הגבי גנגליון (DRG) נוירונים להשרות CNI (א) מדד הפלישה העצבים של תאים סרטניים MiaPaCa2, תאים KPC, QLL2, ותאי NIH3T3. (ב) לתאם גרף המתאר את נתיב הגירה של תא סרטני KPC במגע עם העצב (אדום) ותא QLL2 (סגול). קואורדינטות Y ו- X מוצגות. (N = 12-20 בכל קבוצה). (ג) ניתוח של המרחק ממקור של תאים נודדים סרטן QLL2 עם קשר אקסונלית ו- (ד) תאים סרטניים KPC (n = 20). הכיוון של גירה היה כל זמן לעבר גנגליון העצב. ערכי P ב (א) חושבו על ידי מבחן t דו-צדדי סטודנטים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

מחקר זה נתמך על ידי פרס פיתוח קריירה מחקרית ע"ש ברברה גודמן (2011-601-BGPC) ומענק מהקרן הדו-לאומית למדע ארה"ב-ישראל. אין לבצע גילויים כספיים נוספים של המחברים.