ספירלת גנגליון Neuron explant תרבות Electrophysiology על מערכי אלקטרודה רבות

בהתאם לארגון הבריאות העולמי, 360 מיליון אנשים ברחבי העולם סובלים מליקוי שמיעה עם השלכות עמוקות על החיים המקצועיים והפרטיים. מכשירי שמיעה יכולים לשחזר את התפקוד החושי בצורות מתונות של ליקוי שמיעה; עם זאת, במקרים החמורים ביותר, אפשרות הטיפול היעילה ביותר היא מכשיר תותב הנקרא שתל שבלול (CI). CIs מכילים מערך אלקטרודות ליניארי של עד 24 אלקטרודות, המוחדר בניתוח לתוך הסקאלה טימפאני של השבלול. האלקטרודות מגרות ישירות את נוירוני הגנגליון הספירליים, ויוצרות את עצב השמיעה ¹.

עם יותר מ-300,000 מכשירים שהושתלו ברחבי העולם, שתל שבלול הוא שתלים רפואיים מוצלחים מאוד ומדורג בין ההליך החסכוני ביותר שדווח אי פעם. למרות הצלחתו, לשתל השבלול עדיין יש מגבלות כגון רזולוציית תדרים מופחתת בהשוואה לשמיעה פיזיולוגית. זה יכול להוביל לליקויים בתקשורת יעילה בקבוצות או בסביבות רועשות, וליכולת לפענח צלילים מורכבים מאוד כמו מוזיקה. רזולוציית תדר מופחתת זו נובעת ככל הנראה מהפער בין אלקטרודות ה-CI לנוירוני הגנגליון הספירליים, מה שמוביל לגירוי של קבוצות גדולות של נוירונים. פער זה הוא בטווח של מאות מיקרומטר ^2,3. ביטול פער זה יקל על גירוי של קבוצות קטנות יותר של נוירונים לכל אלקטרודה, ובכך יגדיל את רזולוציית התדרים ואת הביצועים הכוללים של המכשיר ⁴.

כדי לחקור את השפעת הפער בין האלקטרודה לנוירון ואת ההשפעה של פרוטוקולי גירוי אופטימליים שונים, פיתחנו בדיקה ביולוגית במבחנה המבוססת על אפיון אלקטרופיזיולוגי לא פולשני של SGNs על מערכי אלקטרודות מרובות (MEAs) ⁵. בנוסף, ניתן לשנות בקלות MEAs כדי לשנות את צורת האלקטרודה, הגודל, החומר וחספוס פני השטח, כדי לייעל את ממשק הנוירון והאלקטרודה. להלן פרוטוקול שלב אחר שלב להשגת הקלטות מתרביות נוירונים של גנגליון ספירלי עכברי ולהערכת התלות בפרמטרים שהוזכרו לעיל.

טיפול ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות של הרשויות המקומיות השויצריות (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons ברן, שוויץ).

1. הכינו פתרונות לניסויים

1. הכן את תאי מטריקס (ECM) פתרון הציפוי (ראה טבלת חומר, נקודה 6): תערובת הפשרת ECM על קרח. לדלל את תערובת ECM 1:10 ב בינוני תרבות הבסיסית (ללא גורמים neurotrophic או עוברי שור הסרום (FBS)) ולאחסן על קרח.
2. הכן את המדיום תרבות (ראה טבלה חומר, נקודה 1): הכינו מלאי של מדיום Neurobasal לא המכילים FBS או גורם נוירוטרופי שמופק מהמוח (BDNF). מוסף התקשורת neurobasal עם FBS טרי (10%) ו BDNF (5 ng / ml) זמן קצר לפני הוספת תרבית תאים.
3. הכן את הפתרון התאי (ראה טבלת חומר, נקודה 2).

כביסה 2. ועיקור של MEAs

ילדה = "jove_content"> הערה: MEAs המשמש הניסויים מכילים 68 אלקטרודות מסודרים ברשת מלבנית (איור 1E). לכל אלקטרודה בגודל של 40 x 40 מיקרומטר ² עם מרווח של 200 מיקרומטר ממרכז למרכז. האלקטרודות עשויים פלטינה. האלקטרודות מחוברות המגעים המקבילים ידי מעגל עשוי פח תחמוצת אינדיום. מעגל זה הוא מבודד על ידי שכבת 5 מיקרומטר של SU-8. ראה טבלה מהותית לפרטים על הספק. פריסות MEA אחרות עשויות להיות מתאימות ניסויים אלה.

1. עבור MEAs חדש: יש לשטוף אותם על ידי טבילה באתנול 70% למשך 30 שניות ולשטוף עם מים מזוקקים למשך 30 שניות. עבודה במנדף זרימה למינרית.
2. תנו יבש MEA למשך 30 דקות במנדף זרימה למינרית.
3. שים כל MEA לתוך צלחת פטרי סטרילית בודדת (35 מ"מ x 10 מ"מימ) ואת החותם עם רדיד. לשקילת משקל הג ניתן לאחסן עד בשימוש.
4. עבור MEAs בשימוש: דגירה MEAs בצלחת פטרי (35 מ"מ x 10 מ"מ) המכילה 1 מ"ל של solut האנזימטיתיון (ראה חומרים טבלה, הצבע 6) O / N על שייקר מסלולית ב RT להסיר חומר ביולוגי. ואז להמשיך כמו בשלב 2.1.
   הערה: טפלו MEAs בזהירות באמצעות מלקחיים עם עצות גומי מכוסה.

3. הכנת MEAs לניסויי תרבות

1. מורידים את נייר הכסף איטום ולהשאיר את MEA בצלחת פטרי (35 מ"מ x 10 מ"מ) עבור הניסוי כולו.
2. מעיל MEAs עם פתרון מוכן ב 1.1: השתמש קצה פיפטה קר 200 μl (מאוחסן ב -20 ° C) כדי pipet 50 μl של פתרון הציפוי לכל MEA, המכסה את אזור אלקטרודה כולו.
3. אפשר MEAs כדי מעיל למשך 30 דקות עד 1 שעה ב RT.
4. הסר את פתרון הציפוי בעזרת פיפטה. החל 100 μl של המדיום תרבות בתוספת 10% FBS ו 5ng / מ"ל ​​BDNF ולהשאיר אותה ב RT עד ציפוי הרקמה.
5. מניח 2 צלחות פטרי המכילות את MEAs מצופה לתוך צלחת פטרי גדולה (94 מ"מ x 16 מ"מ) ולהוסיף בצלחת פטרי קטנה שלישית המכילה 1.5מ"ל של בופר פוספט (PBS) עבור humidification.
   הערה: הוספה בצלחת פטרי קטנה (שלב 3.5) המכילה PBS היא חיונית כדי למזער אידוי משמעותי של מדיום התרבות.

4. ספירלה גנגליון Dissection

הערה: לנתיחה ברוטו יכול להיעשות מחוץ למכסה המנוע זרימה למינרית (בשלב 4.1 כדי 4.4). לקבלת בתנאים סטריליים בסדר לנתיחה (ברדס זרימה למינרית) הינם שדות חובה (משלב 4.5).

1. להרדים בעלי חיים (עכברים ישנים 5-7 ביום) על ידי עריפת ראש ללא הרדמה מוקדמת.
2. לעקר את הראש על ידי ריסוס עם אתנול 70%.
3. על ידי מחזיק את הראש, לחתוך את הקשר בין העור ואת הגולגולת עם מספריים חדים / חדה לאורך קו sagittal.
4. חותכים את הגולגולת sagittally ולהסיר את המוח באמצעות מספריים חדים / בוטה.
5. חותך את העצמות הזמניות מהגולגולת ומניח אותם בצלחת פטרי המכילה תמיסת המלח המאוזנת 'קר הנקס קרח סטרילי (HBSS).
6. באמצעות dissecמיקרוסקופ tion, לנתח את הבולה התוף באמצעות מלקחיים בסדר ולבודד את האוזן הפנימית.
7. הסר את העצם של השבלול, באמצעות מלקחיים בסדר.
8. הסר את רצועת ספירלת stria vascularis (SV) יחד ידי החזקה עם מלקחיים חלקים של בסיס הגנגליון הספירלה (SG) ואת SV ולאט לאט לגלגל בנפרד את SV מבסיס -כדי-איפקס
9. לבודד את האיבר של קורטי (OC), המזכ"ל ואת כִּישׁוֹר (איור 1 א - ג)
10. הפרד את OC מן SG ו כִּישׁוֹר ידי החזקת עם מלקחיים החלק של הבסיס של SG ואת OC ולאט לאט לגלגל בנפרד את OC מהבסיס אל הקודקוד.
11. Explants לרוחב חותכים (200 עד 500 מיקרומטר קוטר) מן הגנגליון ספירלה עדיין מחוברת כִּישׁוֹר (1D איור) באמצעות מלקחיים אזמל מיקרו.

5. תרבות ספירלה גנגליון explant על MEAs

1. מניחים שתי explants גנגליון ספירלה ליד האלקטרודות על MEA הכין בעבר עם 100 μl של המדיום לתרבות.
2. מניחים את האיבר של קורטי במרחק של כ 5 מ"מ מאזור האלקטרודה.
3. שימוש במלקחיים כדי להצמיד את explants ואת האיבר של קורטי על MEA, תוך הימנעות פגיעה ברקמה.
4. מניחים את MEAs בזהירות לתוך החממה ותרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. למחרת, חזותי לבדוק כי explants יש מצורף MEA.
   הערה: אם explants לא מחובר O / N, שהם כמעט ולא יעשו זאת בימים הקרובים. The OC ממוקם סמוך התרבות לתמיכה trophic / neurotrophic.
5. הוספת 100 μl של מדיום התרבות המכיל 10% FBS ו BDNF ביום למשך 5 ימים רצופים.
6. ביום 6 להוסיף 2 מ"ל של מדיום תרבות המכיל 10% FBS ו 5ng / מ"ל ​​BDNF ותרבות הרקמה עבור 13 ימים נוספים.

קלטות אלקטרו 6. לחקור ספונטני גירוי אלקטרודה פעילות Dependent

1. שטוף את תרבות MEA עם תאיים כךlution מוכן בשלב 1.3, ב RT.
2. לייבש את המגעים בעזרת רקמות הר MEA על התקנת MEA.
   הערה: כדי לשמור על התרבות והלחה במהלך ההרכבה, להוסיף טיפה קטנה של פתרון תאי לתרבות.
3. הוספת 300 μl של פתרון תאי ולחכות 10 דקות לפני ההקלטה, כדי לאפשר למערכת כדי לייצב.
4. שיא פעילות ספונטנית למשך 2 דקות מכל האלקטרודות על ידי לחיצה על ההקלטה / לרכוש כפתור של התוכנה ולזהות אלקטרודות הקלטה.
5. גירוי אלקטרודה MEA: בחר את משרעת / משך / צורה של גירוי על התוכנה המתאימה ולהחיל לכמה אלקטרודות ברציפות כמתואר ^13. בחר את האלקטרודות בוסס על אלה מראים פעילות ספונטנית (כמו בשלב 6.4). שיא מכל האלקטרודות הנותרים.
6. כדי לא לכלול חפץ גירוי, לעורר מאותו אלקטרודה 10 פעמים. אם התרבות מגיבה לפחות 8 מתוך 10 פעמים, ניתן להניח את זה בתורתשובה חיובית על גירוי הנגרם האלקטרודה.
7. כדי לזהות את רעשי הרקע, להחיל tetrodotoxin (TTX) אל cultureat בריכוז של 1 מיקרומטר, כדי לחסום תעלות נתרן מתח מגודרת ולהקליט למשך 2 דקות. השתמש באפשרות זו כדי לבצע זיהוי ספייק (7.1 ו -7.2).

ניתוח 7. נתונים

הערה: ניתוח נתונים תוארה בעבר בהרחבה ⁶ ו ^-5. לקבלת פרטים על תוכנה השתמשו במחקר זה ראה חומרי טבלה, צבע 7.

1. באמצעות התוכנה המתאימה לזהות פעילות ספונטנית של כל אלקטרודה העסיקה גלאי המבוסס על סטיות תקן מאבחן שלאחר מכן. הליך זה מתואר ^6. פעילות מופיעה ארעי מתח מהר ככל (<5 msec).
2. בחר סף כי התוצאות לא פעילות בניתוח TTX מטופלים samples.Adapt ערך הסף עבור כל ניסוי להפלות בין positiv שוואדואר ו לתגליות שליליות כוזבות.
3. התוכנה המתאימה באמצעות יצפה בפעילות העצבית מזוהה של כל אלקטרודה כמזימה סריקה על פי נהלים קבועים (ראה איור 2 א - ג).
4. לקבוע ולהציג את פעילות הרשת הכולל מסיכום כל האירועים זוהה בתוך חלון הזזה של 10 מילי-שניות, מוזז על ידי 1 צעדים msec.
5. זיהוי פעילות הנגרמת גירוי על ידי הצגת הנתונים הגולמיים באמצעות תוכנת ניתוח מתאימה. זהה את הקוצים היחידים מחובר באופן ידני. קוצים בודדים מופיעים ארעי מתח מהר ככל, שהתרחשו לאחר חפץ הגירוי (ראש חץ באיור 2E). דוגמה לכך היא שמוצג באיור 2E.
6. בהתאם הניסוי, לנתח את מספר אלקטרודות להגיב, הסף הדרוש כדי להשיג תגובה, מספר פוטנציאל פעולה לכל אלקטרודות ופרמטרים אחרים בעלי עניין ^5.

רקמות 8. קיבוע Immunohistochemistry

הערה: התהליך המכתים יהרוס את MEA. ראה חומר שולחן (4 נקודות) עבור חומרים כימיים.

1. מייד לאחר ההקלטה לשטוף את התרבויות עם 37 מעלות צלזיוס פעמים חמות שלוש PBS. בטל PBS וליישם 4 Paraformaldehyde% (PFA) (PBS), שחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   זהירות: PFA הוא רעיל. עבודה במנדף כימי עם הגנה מתאימות פתרון שנזרק על פי הנחיות.
2. שטפו את התרבויות שלוש פעמים עם PBS ולחסום עם 2% שור סרום אלבומין (BSA) ב- PBS (0.01% Triton-X100) עבור 2 שעות.
3. מוסיפים את הנוגדן הראשון (Anti-βIII טובולין, נוגדן TUJ) מדולל PBS (BSA 2% ו 0.01% Triton-X100) ולהשאיר O / N ב 4 ° C. שטפו את התרבות שלוש פעמים עם PBS.
   הערה: מעתה ואילך לשמור על המדגם בחושך לעתים קרובות ככל האפשר כדי למזער הלבנה של נוגדני fluorescently שכותרתו המשניים.
4. מוסיפים את נוגדנים משני, מדולל PBS (BSA 2%ד 0.01% Triton-X100) ו דגירה של 1 עד 2 שעות ב RT. כדי להכתים גרעינים להוסיף 1: 10,000 DAPI (1 מ"ג / ml המלאי) במשך 10 דקות.
5. לשטוף שלוש פעמים עם PBS ו הר דגימות אחורה כדי תלושי לכסות דק (24 x 50 מ"מ ²⁾ באמצעות הרכבה בינונית (ראה חומרים טבלה, הצבע 4). תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם הגדלה 5X ו 20X.

איור 1 מסכם את הליך בידוד רקמות, הכנה והתרבות על MEA. אנו מציגים את השלבים הרצופים של דיסקציה רקמות לבודד הגנגליון הספירלה (SG) מן האפיתל החושית של האיבר של קורטי (OC) ו vascularis stria (SV) וספחנו רצועת ספירלה (איור 1 א '- ג'). Explants גנגליון ספירלה (3-4 במספר) נחתכים עם מספריים מיקרו מן גנגליון כמו סכמטי באיור 1D והניח על MEA (איור 1E), מעל לאיזור אלקטרודה (2.2 מ"מ 2). The OC מושם בסמיכות, מחוץ פני האלקטרודה. הצמיחה של התרבות ניתן לנטר לאורך זמן (איור 1G). תרשים סכמטי של הפרוטוקול מוצג באיור 1F. ניתן לאתר פעילות אלקטרו לאחר 6 ימים של תרבות, מגדילות עם זמן תרבות ממושך. אנו recommend להערכת 18 תרבויות יום אשר מייצרים מספרים גבוהים יותר באופן משמעותי של אלקטרודות הקלטה לעומת נקודות מוקדם יותר זמן 5.

הכנת תרבית תאים באיור 1.. (א) גזור טרי אוזן עכבר פנימית. לבן קו מקווקו מציין את המיקום של השבלול, קו מקווקו שחור מציין באזור שיווי המשקל. (ב) אוזן פנימית עכבר לאחר הסרת הקיר הגרמי השבלול. פניות שבלול מסומנות על ידי קווים מקווקוים לבנים. (ג) גנגליון ספירלה (SG) ו כִּישׁוֹר, האיבר של קורטי (OC) ואת vascularis stria (SV) וגידים ספירלה מוצגים לאחר דיסקציה. (ד) סכמטי של SG ו לנתיחה OC והכנת explant SG {דמות מותאמת 5 באישור המו"ל}. (ה) איור של מערך אלקטרודות רב השתמשו במחקר זה. סימול מחדש אלקטרודות מאורגנים ברשת מלבנית במרכז לכבוש שטח של 2.2 מ"מ 2. 4 אלקטרודות קרקע וקשרים בצד מומחשות. (F) סכמטי של פרוטוקול התרבות. הקלטות מבוצעות יום 18. (G) תמונות נציג (תמונות בשדה בהירות) וערכות של explants SG על MEA פיקוח בתרבות ביום 1, 6 ו -18 ברי סולם = 400 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

ניתן לאתר פעילות ספונטנית על MEA והראתה כמזימת סריקה שבו כל שורה של העלילה מייצגת ספייק זוהה. דוגמא מייצגת מראת פעילות ספונטנית זוהתה מכמה אלקטרודות (צבעים שונים הגרפים) מוצגת (איור 2A, 2B, ו 2C).

-together.within-page = "1"> בנוסף, ניתן להשתמש אלקטרודות MEA כדי לעורר את התרבות. דוגמא מייצגת מראה דופק biphasic משמש גירוי (איור 2 ד), 5 אלקטרודות להגיב (עקבות אדומות) שאינו מגיב אלקטרודות (עקבות כחולות) מוצגות באיור 2E. בניסויים אלה אלקטרודה אחד שמש גירוי וכל אלקטרודות האחרות להקלטה. פוטנציאל פעולה יחיד הופיע 1 msec לאחר חפץ הגירוי (ראש חץ שחור). את MEA ניתן immunostained בסוף ההליך על מנת להעריך את הכיסוי של תהליכים עצביים מעל האזור האלקטרודה. האלקטרודה המסומן בירוק האיור 2F שמש גירוי, ואת אלקטרודות מצוינת אדום שמשה כדי להקליט תגובות (איור 2E).

איור 2. הקלטות נתונים על MEA. (א </ Strong>) עקבות של הקלטות מקוריות של שישה מתוך 63 אלקטרודות מראות פעילות ספונטנית. (ב) העלילה סריקה של שישה האלקטרודות של איור 2A לאחר זיהוי ספייק. כל עמודה מייצגת פוטנציאל פעולה אחד. (C) עלילת סריקה כולל כל אלקטרודות (כמו A ו- B) פעילות נרשמה מ 63 אלקטרודות (ערוצי מספר 0-63) למשך 2 דקות. (ד) גירוי biphasic עם משך הזמן הכולל של 80 μsec משרעת של 80 מיקרו-אמפר שימש גירוי של תרבות מן האלקטרודה אחד (E58 באיור 2F). (E) דוגמא מייצגת של עקבות נתונים גולמיות המתקבלות לאחר הגירוי מן האלקטרודה 58 מראה פוטנציאל פעולה (עקבות אדומות) או ללא תגובות (עקבות כחולות) לאחר הגירוי (חץ-ראש שחור). (F) תרבות הגנגליון ספירלה על MEA immunostained עבור סמן העצבי TUJ (הירוק) בסוף הניסוי לדמיין נוירו כיסוי סופי של אזור אלקטרודה {דמות מותאמת 5 באישור המו"ל}. אלקטרודה 58 המשמשת גירוי מסומנת בירוק, אלקטרודות להגיב המסומנים באדום. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

לבסוף, התקנת MEA מאפשרת לחקר שינוי פני האלקטרודה אפשרי שעלולות להגביר את רגישות הקלטה. שתי זמינה מסחרי אלקטרודות MEA שמשה במחקר זה עם שני משטחי פלטינה שונים: פלטינום גריי (Grey Pt), מורכב 150 שכבת Pt ננומטר העבה (עכבה: 400 קילו-אוהם / 1 KHz) ושחור פלטינום, (שחור, Pt), מתקבל על ידי בתצהיר אלקטרוכימיים של Pt בסוף תהליך מיקרו-ייצור (עכבה: 20 קילו-אוהם / 1 קילוהרץ). ראה חומרי הטבלה (נקודה 6) לפרטים.

איור 3. השוואה של גריי vs אלקטרודות שחור Pt. שני סוגים של אלקטרודות (אפור ושחור Pt) הושוו זה לצד זה באמצעות 12 תרבויות MEA עצמאית, 6 על כל סוג MEA. (א) המספר הכולל של מחדשאלקטרודות sponding לכל ניסוי מוצגת. (ב) סף משרעת כדי לעורר תגובה, הנמדד על 30-35 זוגות אלקטרודה עצמאיים 6 ניסויי MEA עצמאיים מוצג. הנתונים מוצגים כפי SD +/- Mean. (P t מבחן סטודנט <0.001) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

למחברים אין מה לחשוף.