הטיפול והערכה של התרבות האנושית תא צורב הערמונית ראשי

Organoids הם כלי חשוב ללמוד organogenesis ומחלות. הם מספקים אלטרנטיבה פחות יקר חייתיים, החולה, נגזר organoids מתפתחים כאסטרטגיה רפואה אישית^1,2,3. מערכת תלת-מימדי (3D) תרבות זו כרוכה זריעת תאי גזע או קדמון (שנקטפו רקמות או המושרה בתאי גזע pluripotent) לתוך ג'ל של מטריצה חוץ-תאית רכיבים (מטריצה ג'ל)⁴. התאים להתרבות, להבדיל, וכתוצאה מכך מבנים organotypic לסכם את ההיררכיה הסלולר ואת המורפולוגיה של איבר יחידה פונקציונלית של ריבית. Organoids כבר גדלו באמצעות תאים שמקורם במגוון של איברים, כולל את בלוטת הרוק הקיבה, המעי, הכבד, ערמונית, הריאות, המוח⁴. אמנם ישנם פרוטוקולים רבים המתארת בצעדים כדי להגדירך הערמונית organoids^5,6, זה מאתגר למצוא שיטות מספיק מפורטת על איך להשיג נקודות קצה כמותית של organoids. מאמר זה מסכם את שיטות שפותחו עבור תאי הערמונית ראשי אדם ומפרט סדרה של נקודות קצה המוצע כדי להעריך את פנוטיפים תא צורב. טכניקות אלה עברו אופטימציה להצגה organoids הערמונית וייתכן החלים על תרבויות אחרות תא תלת-ממד.

תא צורב הערמונית תרבויות שהתגלו לאחרונה מודל ערך במבחנה חסר את המגבלות של טפט תרבויות באמצעות שנקבעו שורות תאים מונצח. שפירים אפיתל הערמונית וסרטן הערמונית הוא מאתגר דגם במבחנה באמצעות שורות תאים מונצח. מספר שורות תאים שפירים מוגבל, עברו כל שינוי עם oncogenes⁷. ראשי תאים אפיתל הערמונית monolayers לא להבדיל לתוך התאים luminal וחסרי קולטני אנדרוגן⁸. הרוב המכריע של שורות תאים סרטן הערמונית אין קולטני אנדרוגן פונקציונלי, מתווך משמעותית בתחילת המחלה, והמדינה חוסר שינויים גנטיים מפתח כי נמצאו גידולים החולה⁹. תא צורב הערמונית תרבויות ניתן לגדל בקלות מן שפירים אפיתל, הם בעלי ערך רב בלימוד מאפייני תא גזע, ובתאים, בידול ואפקטים של שינויים ניסיוני^4,microenvironment⁵. סרטן הערמונית organoids ניתן לגדל כחלק בגישה רפואה דיוק דוגמנות מחלת המטופל והתגובה טיפולים¹⁰.

פרוטוקול זה נאסף מן הפרוטוקולים הקיימים המשתמשות סוגי תאים שונים, אבל זה הותאם כאן לשימוש בתאי הערמונית ראשי אדם. אוהב את המגבעת פרוטוקולים המתוארים על ידי סויירס, Clevers שן^5,6 לתאר צמיחה, passaging, שדה בהיר הדמיה, הקפאה קריוגנית, ובידוד RNA ו- DNA של הערמונית עכבר ו- organoids האנושית. פרוטוקול כולה-הר משתנה מקונסטנס. et al. ¹¹, מי כאשר משתמשים במערכת העיכול organoids אפיתל חיים הדמיה וקפואים, שעוות פרפין הטבעה. . Borten et al. ¹² תיאר את הניתוח של השד, המעי הגס, סרטן המעי הגס מורפולוגיה תא צורב של שדה בהיר הדמיה. בנוסף, ריצ'רדס ואח. ¹³ לשימוש שיטה להערכת מורפולוגיות organoids הערמונית. לבסוף, Hu. et al. ¹⁴ תיאר שיטה של הערמונית הקפדה organoids לשקופית קאמרית לילה לפני ההכתמה immunofluorescent להתבונן תאים בודדים, פיזור של הספירות לניתוח cytometry זרימה.

המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים באופן מפורט השיטות טכנית מאתגר כמו פרוטוקול אחד, כולל תא זריעה; מטריקס ומדיה ג'ל תחזוקה; אוסף של תאים עבור cytometry זרימה; RNA DNA, חלבונים החילוץ; הערכת מורפולוגיות מניתוח בהיר-שדה z-מחסנית; הטבעה, עיבוד, חלוקתה עבור צביעת היסטולוגית; כל-הרכבה עבור מבחני בדיקה immunofluorescence או פלורסנט. הרלוונטיות ביולוגי ופרשנות של נקודות קצה שונים אלה משתנים בין הנבחנים נוגדנים המשמש לניתוח. דרך הניצול של פרוטוקול זה, המשתמשים צריך להרגיש מוכנים לבנות ניסוי עם ערכת כלים של נקודות קצה.

האדם העיקרי הערמונית (קדם) בתאי אפיתל הוקמו במעבדה על-ידי הפרוטוקול המתואר על-ידי^15,Peehl¹⁶ ומתוחזק למספר מוגבל של מעברים (עד ארבעה) כפי שתואר לעיל¹⁷, אבל הם גם ולמשקאות מסחרי. Hepatocyte ללא סרום מבוסס מדיה⁶, המבוסס על KSFM¹³ו R-spondin ממוזגים-1⁵ מדיה מתפרסמים כל כמו שיש בהצלחה המיוצר organoids. מבוסס על KSFM דורש את המספר הנמוך ביותר של תוספים, אז זה מתואר כאן.

להלן כללי התנהגות אופטימלי באמצעות ראשי הערמונית אפיתל תאי אדם מן הרקמה החולה ב אוניברסיטת אילינוי שיקגו בבית החולים. לכל רקמות אנושיות המשמש עבור ניסויים אלה היו שנרכשו דרך מוסדיים המנהלים שאושרו על-ידי פרוטוקול ו/או פטור ב אוניברסיטת אילינוי בשיקגו. בזמן התנאים תרבות ישתנו בהתאם לסוג התא עניין, ניתן ליישם את נקודות הקצה organoids של רקמות אחרות.

1. זריעת תאי אפיתל לתוך מטריצה ג'ל ושינוי מדיה

1. לאסוף את החומרים הדרושים: האדם העיקרי הערמונית תאים אפיתל (מראש), מטריקס ג'ל על קרח, microplate 96-ובכן, תקין ללא סרום מדיה (KSFM) על קרח, פחם הפשיטו סרום שור עוברית (FBS) ולאחר דיהידרוטסטוסטרון (DHT).
2. היכונו מדיה מבוססי KSFM תא צורב על ידי שילוב 47.5 מ של KSFM עם 2.5 מ של פחם FBS הפשיטו ואת דיהידרוטסטוסטרון (DHT) ריכוז סופי של 10 ננומטר DHT, אז המילואים על קרח.
3. צלחת תאים לתוך מטריצה תלת-ממד בשכונה תרבות תא בטכניקה סטרילי.
   1. בעדינות קר תמהיל מדיה מבוססי KSFM תא צורב עם ג'ל מטריקס כקרח כדי לקבל מטריצה 50% ג'ל תערובת מאת לאט pipetting למעלה ולמטה, הימנעות בועות.
      הערה: מטריקס ג'ל צריך להיות הקרת בן לילה ב 4 ° C, שמרה על קרח במידת האפשר. זה עפור במהירות בטמפרטורת החדר (RT).
   2. טרום רטוב טיפ פיפטה תוך קר התקשורת והעברת 40 – 50 μL של מטריקס 50% ג'ל על גבי כל הבאר כדי לשמש על צלחת 96-ובכן. מעיל בתחתית הבאר כדי ליצור שכבת הבסיס.
      הערה: לא מלא מדבקות/ברקודים אל התחנה השנייה על פיפטה, כמו זה יכול ליצור בועות.
   3. למקם את הצלחת 96-ובכן חממה 37 מעלות צלזיוס למשך 30-45 דקות שבמהלכו שכבת הבסיס.
      הערה: לא לוחית רישוי לתאי האפיתל על גבי שכבת הבסיס עד זה התחזק, או תאים עשויים ליפול דרך המטריקס אל החלק התחתון של הלוח, ינבכ טפט.
   4. מערבבים בתאי אפיתל מושעה בתקשורת מבוססת-KSFM תא צורב עם מטריקס ג'ל כדי להשיג ריכוז הסופי של μL תאים/100 100 – 1000 ו- 33% מטריקס ג'ל. תאים אפיתל צלחת על גבי בסיס שכבות באמצעות μL 100 של מטריקס 33% ג'ל תא תערובת לכל טוב.
      הערה: ניסויים קודמים הראו כי זריעת תאי אפיתל גם בצפיפות ב- 3D להגביל את גודל תא צורב צמיחה, בעוד זריעה יכול לגרום גם בדלילות תשואה נמוכה מאוד¹³. חשוב למטב את התנאים זריעה עבור סוג התא של עניין, המבוסס על יעילות היווצרות תא צורב החולה הספציפי.
4. הכנס את הצלחת 96-ובכן חממה 37 מעלות צלזיוס למשך 30-45 דקות לאפשר את הג'ל מטריקס לגבש, ואז בעדינות להוסיף 100 μL של מדיה מבוססי KSFM תא צורב על גבי תאים על-ידי pipetting לאט כנגד הקצה של הבאר.
5. לשנות את המדיה כל 2-3 ימים. Pipetting כנגד הצד של הבאר עם רווח בין הג'ל מדיה, מטריקס, בזהירות להסיר את μL 50 של מדיה והחלף μL 50 של מדיה חדשה.
   הערה: עבור תרבות לטווח ארוך, הג'ל מטריקס צריך להיות שונה כל 2-3 שבועות. אם התרבות ג'ל ' מטריקס ' מופיעה לא יציב ומציגה את הקמטים שקוף מתחת למיקרוסקופ, לאחר מכן הג'ל מטריקס התקלקלה, צריך להחליף.

2. אוסף של Organoids של מטריצה ג'ל

הערה: אוסף של organoids הוא הכרחי עבור מטריצה ג'ל שינויים, passaging או נקודות קצה של החילוץ-RNA, הפקת דנ א, חלבון החילוץ cytometry זרימה.

1. חם neutral פרוטאז פרוטאז, הנקס מאוזנת תמיסת מלח (HBSS) בתוך אמבט מים 37 º C.
2. הסר בזהירות מדיה מבארות מבלי לשבש את פעולת הג'ל מטריקס.
3. להוסיף ~ 200 μL של neutral פרוטאז פרוטאז מכל קידוח ב ~ 1:2 יחס של מטריקס ג'ל: נייטרלי פרוטאז דגירה כעשרים דקות ב 37 º C.
4. מכנית מביצועם התערובת פרוטאז ג'ל: נייטרלי מטריקס על-ידי pipetting למעלה ולמטה.
5. תקופת דגירה של 20 דקות ב 37 º C.
6. להעביר את התערובת ג'ל-תא פרוטאז נייטרלי-מטריקס microcentrifuge צינור או צינור חרוטי, בהתאם לנפח. צנטריפוגה ב x 300 גרם למשך 3-5 דקות הצניפה תאים.
   הערה: אם אין גלולה תא מופיע, הג'ל מטריקס עשוי לא להיות לגמרי הפומבית, להיות visualized בתור שלב שקוף בחלק התחתון של צינור שונה מזו תגובת שיקוע ורוד. להסיר את תגובת שיקוע, להוסיף פרוטאז ניטרלי יותר ביחס של 1:2 מטריקס בגדר ג'ל, תקופת דגירה של עוד 20-40 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, וחזור צנטריפוגה ב x 300 גרם.
7. כאשר נרכש של גלולה תא צורב, להסיר את תגובת שיקוע. להמשיך עם passaging (ראה שלב 2.7.1), פירוק תא צורב לחילוץ RNA, דנ א או חלבון (ראה שלב 2.7.2), עיבוד חד תאים על ידי cytometry זרימה, תא בודד רצף (ראה שלב 2.7.3).
   1. לתרבות לטווח ארוך, בעדינות resuspend organoids שלם ב- 33% מטריקס טריים ג'ל וצלחת על-ידי ביצוע השלבים המתוארים בשלבים 1.1-1.5. מביצועם organoids ו replate כמו תאים בודדים, resuspend בגדר ב 1 מ"ל של אנזימים תא חם-דיסוציאציה, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות, לשטוף פעם עם 5 מ של HBSS, לוחית רישוי מחדש הג'ל מטריקס טריים בעקבות צעדים 1.1-1.5.
   2. Resuspend בגדר תא צורב ב מאגר פירוק המתאים עבור החילוץ-RNA, הפקת דנ א או חלבון החילוץ, כפי שמפורט בטבלה של חומרים ופעל הפרוטוקול של היצרן.
   3. Resuspend organoids ב 1 מ"ל של אנזימים תא חם-דיסוציאציה, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות לבטל את organoids לתוך תאים בודדים. לשטוף פעם עם 5 מ של HBSS והמשך עם פרוטוקול לזרום cytometry⁵ או תא בודד רצף¹⁸.
      הערה: מביצועם לתוך תאים בודדים בריכוזים נמוכים של מטריקס ג'ל, neutral פרוטאז פרוטאז לא ייתכן שיהיה צורך, אנזימי התא-דיסוציאציה יכול להיות מיושם ישירות אל הבאר לאחר שלב 2.2.

3. ייבוא תמונות שלם-ובכן וניתוח של מורפולוגיה תא צורב

1. לרכוש תמונות כל-טוב z-מחסנית באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך המשודרת עם ממונע X / Y לסריקה הבמה (זרימת עבודה מאויר באיורים איור 1 א').
   1. עם המיקום מוקד מותאם לתחתית הבאר, מתחילים תוך התמקדות כלפי מעלה עד תא צורב הראשון, אשר יהיה במרכז הבאר עקב מניסקוס של שכבת הבסיס. הגדר z המישור התחתון בעמדה זו.
   2. המשך התמקדות כלפי מעלה עד תא צורב האחרון יהיה בפוקוס, אשר יהיה בפריפריה של הבאר. הגדר המישור העליון z בעמדה זו.
      הערה: לאחר הגדרת העליון והתחתון של הערימה-z, ודא כי תפקידים אלה ללכוד את organoids בתוך כל בארות הנותרים ולהתאים את העליון/תחתון כנדרש. דבר זה מאפשר z-טווח שישמש עבור סריקה אחת הכוללת את כל תא צורב בתוך כל טוב.
   3. לכידת 15 – 35 z-מטוסים לכל טוב, באמצעות מספר גדול יותר עבור רזולוציה גדולה יותר. לכידת התמונה כולה היטב, מיזוג ולאסוף הגזרות או סעיפים קטנים במידת הצורך.
      הערה: מומלץ לקחת z-מישורים מרובים להבדיל יחיד z-המטוס, כמופיע ב איור 1B שבה organoids הם מחוץ לפוקוס בעת לכידת z-מטוס אחד בלבד.
   4. שמור תמונות z-מחסנית לניתוח במורד הזרם.
2. ניתוח תמונות באמצעות תמונה תוכנה עם יכולות ציור צורה חופשית.
   1. פתחו תמונה מטוס ה-z יחיד של שלב 3.1.4.
   2. אם יש צורך, אריח את התמונות שצולמו כל בודדים של z-מטוס לתמונה בודדת, כל-טוב. לשמור את התמונה החדשה כקובץ נפרד. חזור על תהליך זה עבור כל מטוס-z רכשה.
   3. באמצעות תמונה תוכנה, לפתוח את התמונה כולה-ובכן עבור כל מטוס ה-z מבאר יחיד וליצור של עומק שדה (EDF) התמונה המורחבת מתוך הערימה של z-מטוסים.
      הערה: תמונה מסוג זה תביא לבחירת האזור המוקד הטוב ביותר של כל מטוס-z כדי ליצור תמונה אחת בפוקוס של הבאר.
   4. קבע את קנה המידה של פיקסל של התוכנה הבר קנה המידה של התמונה שנמדד.
   5. באמצעות כלי הציור צורה חופשית של התוכנה תמונה, להתחקות אחר ההיקף של כל תא צורב בבאר.
   6. להשיג את המדדים מדידה עבור תא צורב עקיבה ההיקפים של התוכנה תמונה.
      הערה: פרמטרים מומלצים הם אזור מעגליות, יחס מקסימום/מינימום רדיוס. התוצאות נציג הממחישות את היישום של מדדים אלה מוצגים באיור 1C. אזור מחושבת של המצולע שהוגדרו על-ידי ההיקף של תא צורב. מעגליות הוא היחס של האזור של תא צורב לאזור של עיגול עם חמוס המרבי קוטר שווה תא צורב של, כאשר 0 הוא פחות עגול ו 1 הוא יותר עגול. יחס מקסימום/מינימום רדיוס הוא היחס בין הרדיוס המרבי מינימום רדיוס תא צורב לעקוב אחריו.
      מעגליות =
      יחס רדיוס =

4. פורמלין קיבעון, פרפין ההטמעה של Organoids עבור נקודות קצה היסטולוגית

1. להכין אספקה ההטבעה: HBSS, 2% אגר פתרון, צבע סימון היסטולוגית, היסטולוגיה ג'ל, פיפטה עצה עובש, קלטת, משאבת מזרק אינסולין 1 סמ ק, שקית קרח, קלטות, 10% פורמלין במאגר נייטרלי (NBF), עיפרון, 75% אתנול כיתה היסטולוגית (EtOH).
   1. להכין שני צינורות microcentrifuge של 2% אגר פתרון. דגירה באמבט מים או על גוש חום ב 100-110 מעלות צלזיוס כדי לשמור על אגר בצורת נוזל. להוסיף 1-2 טיפות של היסטולוגית סימון צבע באחד הפתרונות אגר 2%, אשר מציינות העליון של אגר חבר ולסייע בשמירה על התמצאות במהלך ההטמעה. מערבבים היטב.
   2. לחמם את הג'ל היסטולוגיה בבלוק מים באמבטיה או חום-55-65 מעלות צלזיוס.
   3. באמצעות טיפ פיפטה 1000 μL, ליצור תבניות על ידי חיתוך קטע קטן של קצה פיפטה לעשות גליל המחזיקה ~ 50 μL. צור תבנית השני, רחב יותר אשר עוטף התבנית הראשונה.
   4. ליצור בלוק קר על ידי עטיפת שקית קרח עם קלטת (דבק בצד למעלה) והקפדה בתבניות בקלטת.
   5. צור פומפה על-ידי הסרת הבוכנה מזרק אינסולין 1 סמ ק.
2. להטביע את organoids פקק ג'ל היסטולוגיה לעיבוד, בעקבות זרימת העבודה מצטיירת איור 2A.
   1. לבטל את הג'ל מטריקס, גלולה organoids על-ידי ביצוע השלבים 2.1 – 2.7.
   2. רחץ בגדר תא צורב פעם אחת עם 1 מ"ל של HBSS, גלולה מחדש על-ידי ספינינג למשך 3-5 דקות ב x 300 גרם והסרה של תגובת שיקוע.
   3. מחדש להשעות בגדר תא צורב ב 30 – 50 μL של ג'ל נוזלי כלים. מערבבים בעדינות על-ידי pipetting למעלה ולמטה לאט. להעביר את התערובת ג'ל/תא צורב היסטולוגיה לתוך תבנית על הבלוק קר ולאפשר את הדגימה לחזק לתוך פקק וחותכים.
   4. השתמש פומפה לדחוף את הפקק מתוך כייר קטן, לתבנית גדולה יותר. פיפטה אגר 2% ברורה סביב התקע כדי למלא את התבנית גדול יותר.
   5. פיפטה היסטולוגית ציפוי צבע 2% אגר על גבי התקע לציון העליון של המדגם.
   6. לאחר מקורר, להשתמש פומפה להעביר את התקע לתוך קלטת כפפות. לתייג את הקלטת באמצעות קלטת עיפרון ומקום לתוך 10% NBF עבור קיבוע בין לילה.
   7. להעביר את הקלטת מ- 10% NBF לכיתה היסטולוגית 70% EtOH.
3. תהליך הג'ל היסטולוגיה מתחברים באמצעות פרוטוקול ביופסיה שנקבע מראש על מעבד, אם הם זמינים. אם מראש אינה זמינה, קלט את רצף הבאות ואת אורך: 70% EtOH במשך 6 דקות, 70% EtOH במשך 10 דקות, 80% EtOH למשך 10 דקות, 95% EtOH 2 כפול 10 דקות, 100% EtOH 3 פעמים במשך 10 דקות, קסילן 3 פעמים למשך 15 דקות , ואת פרפין 3 פעמים במשך 15 דקות לסטות המומלץ רצף העיבוד יכול לגרום קרע organoids (איור 3 א).
4. להטביע את התקע ג'ל היסטולוגיה עם החלק צבעוניים פונה כלפי מעלה, כמו זה יאפשר את החלק דהוי המכיל את organoids כדי להיות למחלקה לתוך הראשון.
5. סעיף היסטולוגיה FFPE ג'ל רחובות:
   1. לאסוף במצרכים: היסטולוגיה FFPE ג'ל בלוקים, היסטולוגיה עט, רקמת ציפה תנורים, דלי קרח עם קרח, מיקרוטום, להבים מיקרוטום, הטבעה תחנת עבודה, טעונה באופן חיובי שקופיות מיקרוסקופ, תנור מעבדה.
   2. מילוי המים הרותחים עד מאוד מלאה, מוגדר כ- 40 ° C, אז מעבדה חמה מראש תנור ל- 45-50 מעלות צלזיוס.
   3. להכין דלי קרח, ואז למלא עם קרח, מוסיפים מים ליצירת של slurry קרח-מים. מקררים הבלוקים על הקרח עד שהם מאוד קר.
      הערה: ניתן להגדיר גושי קרח עד 1 ליום, אבל אם נשאר ללון, הבלוקים להפוך להתייבש יצטרכו להיות reprocessed.
   4. הכנס בלוק מיקרוטום קלטת קלאמפ, להוסיף את הלהב המחזיק סכין, ולפתוח כל אמצעי נעילה הגנה על המכונה.
   5. להתחיל זמירה את הפנים של בלוק פראפין (מול)-עובי 10 מיקרומטר. ברגע מקטע עולה המכיל אזור הכנס, תחנת זמירה, לנעול הרוטור מיקרוטום, וכן להעביר את הבניין בחזרה אל הקרח ולהירגע. אם מספר גושי בניינים כדי להיות למחלקה, הפנים-off כל לחסום לפני המעבר לשלב 4.5.6.
   6. להזיז את הלהב לחלק חדש ולא משומש, להעביר את גוש בחזרה המלחציים. לפתוח את המכשיר ולהתחיל חיתוך ב 5 μm לכל סעיף.
      הערה: 5 μm מומלץ לקבלת התוצאות הטובות ביותר, אך גם מקובל μm 3 – 10.
   7. באמצעות פינצטה, להעביר את המקטע האמבט במים 40 ° צלזיוס ולאפשר את המקטע להפיץ. להעביר את המקטע לשקופית בטבילת אנכית לתוך המים.
      הערה: טובלים בזווית יכול להעביר בועות בתחתית האמבט בסעיף ולגרום לעיוות של המדגם.
   8. דמיינו את המקטע תחת מיקרוסקופ (איור 2Bג).
      הערה: אם נוכח תא צורב הוא יופיע הדומה החץ האדום איור 2B. בועות (איור 2B, חץ כחול) יכול מופיעים דומים organoids, קל יותר להבחין בשקופית טריים כמו organoids יבשה מופיעים שקוף (איור 2C). ואם organoids לא קיימים, סעיף נוסף לתוך הרחוב.
6. כאשר שקופיות המכילה organoids שרכשו, להקיף את האזור סביב הסעיף בצד האחורי של שקופיות עם היסטולוגיה עט, אופים במשך הלילה ב- 45-50 מעלות צלזיוס.
7. לאסוף את השקופיות והמשך H & E (ראה שלב 4.9.1), immunohistochemical (ראה שלב 4.9.2), או immunofluorescent מכתים (ראה שלב 5).
   הערה: תוצאות נציג מוצגים באיור 3B.
   1. כדי לבצע H & E מכתים, לקבל ערכת מהרשימה חומרים ופעל במפרטי היצרן.
   2. כדי לבצע נוגדן, להשיג קיט עם נוגדן ראשוני מתוך רשימת חומרים ופעל במפרטי היצרן.

5. immunofluorescent מכתים של FFPE ו- Organoids משרטוטי

1. לאסוף אספקה: שקופית אפוי משלב 4, קסילן, 100% EtOH, 95% EtOH, 70% EtOH יונים (DI H₂O), מים coplin צנצנות, 1 x אנטיגן אחזור פתרון (מאגר סודיום ציטרט או EDTA-טריס מאגר), באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), 5% סוס רגיל סרום ( NHS) עם חומר ניקוי ללא יונית 0.1% ב- PBS, 1% שור אלבומין (BSA) עם חומר ניקוי ללא יונית 0.3% ב- PBS, צביעת ארון תקשורת, מכתימה את המנה, למגינים קאמרית, עט הידרופובי המכשול, לחות קאמרית, 1 ° ו 2 ° נוגדנים של עניין, counterstains של ריבית.
2. Deparaffinize, נתרענן השקופיות על-ידי חיטט coplins מלא את הפתרונות הבאים: קסילן (3 מטבלים, 5 דקות), 100% EtOH (מטבלים 2, 3 דקות כל אחד), 95% EtOH (מטבלים 2, 3 דקות כל אחד), 70% EtOH (מטבלים 2, 3 דקות כל אחד), ו- DI H₂O (2 מטבלים 3 דקות).
3. למלא את הצלחת מכתימים עם אנטיגן אחזור פתרון וחום קדם למגינים קאמרית עד 100 ° C.
4. לבצע אחזור אנטיגן במועט מחליק לתוך המנה מכתימים מחומם מראש וכן תקופת דגירה של 5 – 10 דקות ב- 100 מעלות צלזיוס. לאחר המחזור יושלם, לאפשר תא decloaking לשבת 20 דקות לפני פתיחת המכסה.
5. לאחר המנה שקופית יש מקורר RT, במקום המנה מכתימים תחת זורמים DI H₂O לשטוף את השקופיות במשך 5 דקות.
6. להסיר את השקופיות המנה מוכתמים, מעגל סביב הדגימה עם עט הידרופובי המכשול, ולהניח על השקופית על תא לחות.
7. לחסום כל נוגדן שאינם ספציפיים צביעת על-ידי החלת NHS 5% עם סבון ללא יונית 0.1% ב- PBS למעגל הידרופוביות בסביבת המדגם (μL כ-30 נדרש כדי לכסות את הדגימה).
8. שטיפת בשקופיות coplins מלא PBS 3 פעמים במשך 5 דקות.
9. הוסף את הנוגדנים 1° (טבלה של חומרים) מדולל ב 1% BSA עם דטרגנט ללא יונית 0.3% ב- PBS למעגל הידרופוביות בסביבת המדגם (μL בערך 30 אמור לכסות את הסעיף), ואז תקופת דגירה של h 1 ב RT או ללון ב 4 מעלות צלזיוס בתא לחות.
10. לשטוף את השקופיות ב coplins מלא עם PBS 3 פעמים במשך 5 דקות.
11. הוספת הנוגדן 2° מדולל ב 1% BSA עם דטרגנט ללא יונית 0.3% ב- PBS למעגל הידרופוביות בסביבת המדגם (μL כ-30 יכסה את האזור), ואז תקופת דגירה של h 1 RT בתא לחות.
12. לשטוף את השקופיות ב coplin מלא עם PBS 3 פעמים במשך 5 דקות.
13. להוסיף דאפי, מדולל למפרטי היצרן, ב- 1% BSA עם סבון ללא יונית 0.3% ב- PBS למעגל הידרופוביות בסביבת המדגם, ולאחר מכן תקופת דגירה של 2-5 דקות ב RT בחושך (30 μL).
14. לשטוף את השקופיות ב coplins מלא עם PBS 3 פעמים במשך 5 דקות.
15. הר של השקופיות עם תקשורת הרכבה antifade, coverslip, ולאחר מכן להמחיש את התוצאות תחת מיקרוסקופ.

6. השלם-הרכבה של Organoids עבור צביעת Immunofluorescent

1. לאסוף אספקה: שקופית קאמרית או צלחת קונאפוקלית, באגירה פוספט מלוחים (PBS), מקבע, 50 מ מ NH₄Cl ב- PBS, דטרגנט ללא יונית 0.1% ב- PBS, 5% NHS עם סבון ללא יונית 0.1% ב- PBS, 1% BSA עם סבון ללא יונית 0.3% ב- PBS, 1 ° ו 2 ° נוגדנים של עניין, counterstains עניין.
2. הסר בזהירות כמה שיותר מדיה ככל האפשר מבלי לשבש את פעולת התרבות תא צורב על-ידי pipetting כנגד הצד של, ובכן, עוזב את החלל בין מדיה, מטריקס ג'ל.
3. באמצעות קיצצה, טרום רטוב עם מדיה או PBS, עצה 1,000 μL פיפטה, לצייר על טיפת דם אחת (25-50 μL) של מטריקס ג'ל המכיל את organoid(s) של עניין, לוותר על אמצע קאמרית שקופית טוב או קונאפוקלית תבשיל.
   הערה: 33% מטריקס ג'ל אינו מוצק... זה נוזל ז'לטין שמטפל דומה ג'לי זה לא הגדיר באופן מלא. טיפ פיפטה החתוך עם חור גדול ימנע organoids שבירת במהלך העברות.
4. אם organoids נשארים בתרבות האב, החלף המדיה מדיה מבוססי KSFM חמים.
5. בעין או היקף ויבתר, וארוקן את הג'ל מטריקס ומדיה עודף משקופית קאמרית עם פיפטה פיין-טיפ (200-10 μL).
   הערה: זה אופציונלי pretreat את השקופית קאמרית עם ריאגנט הדבקות.
6. צלחת אמצעי שווה של מטריקס ג'ל לבאר הריק השקופית הקאמרית בתור פקד אופציונלי כדי לצפות autofluorescence של שאריות של מטריקס.
7. מקום השקופית הקאמרית חממה 37 מעלות צלזיוס למשך 30-45 דקות על מנת לקדם את תא צורב לדבוק הזכוכית ולמנוע אובדן של דגימות במהלך שטיפת מדרגות.
8. Pipetting באיטיות כדי למנוע ניתוק שקופיות, לשטוף את organoids עם μL 200 ל- PBS 1 x עבור 5 דקות ב RT תוך מנענע בעדינות.
9. הסר את 1-PBS ותיקון עם 200 μL של 4% paraformaldehyde למשך 30 דקות ב- RT תוך מנענע בעדינות. ודא כי הג'ל מטריצה מופיע ברור לאחר שלב זה.
   הערה: קיבוע מתנול או פורמלין הינן גם אפשריות. צריך להיות ממוטב שיטת קיבוע נוגדנים ספציפיים כמו שיטות קיבוע מסוימות עשוי crosslink האנטיגנים של עניין או להרוות פלורסנט-תיוג-חלבונים עניין.
10. הסרת מקבע את ולשטוף פעמיים עם μL 200 ל- PBS 1 x במשך 5 דקות תוך כדי טלטול בעדינות.
    הערה: האורך של שטיפת מדרגות צריך להיות מוטבת תלוי בגודל תא צורב. חמש דקות הוא נקודת התחלה מספיק, אבל יכול להיות מאורכים השלב הכביסה בהתאם לצורך.
11. להרוות את autofluorescence עם μL 200 של 50 מ מ NH₄Cl ב- 1 x PBS למשך 30 דקות ב- RT תוך מנענע בעדינות.
    הערה: שלב זה להרוות autofluorescence פסולת לומן של תא צורב ומן ביטוי חלבון פלואורסצנטי (כגון GFP) שעלול להציג עיצוב ניסיוני. זה צריך להיות כלול אם זה רצוי להשתמש fluorophore בערוץ 488 אך ניתן לדלג במידת הצורך כדי לשמר את האות ה-GFP.
12. הסר NH₄קלרנית, לשטוף פעמיים עם μL 200 ל- PBS 1 x במשך 5 דקות תוך כדי טלטול בעדינות.
13. Permeabilize organoids ב μL 200 של 0.1% ללא יונית דטרגנט ל 100 1 x PBS למשך 30 דקות ב- RT תוך מנענע בעדינות.
14. להסיר את 0.1% ללא יונית דטרגנט-100 1-PBS ולשטוף פעמיים עם μL 200 ל- PBS 1 x עבור 5 דקות בזמן מנענע בעדינות.
15. בלוק עם 5% NHS עם 200 μL של 0.1% סבון ללא יונית X-100 ב- PBS, תקופת דגירה של 60 דקות ב RT תוך מנענע בעדינות.
16. הסר את המאגר חסימה, לשטוף פעמיים עם μL 200 ל- PBS 1 x במשך 5 דקות תוך כדי טלטול בעדינות.
17. לדלל הנוגדן 1° ב 1% BSA עם 0.3% טריטון X-100 ב 1 x PBS, להוסיף 200 μL של השקופית קאמרית ולאחר מכן תקופת דגירה של 1-3 ימים ב- 4 מעלות צלזיוס.
18. להסיר את הנוגדן 1°, לשטוף פעמיים עם μL 200 ל- PBS 1 x במשך 5 דקות תוך כדי טלטול בעדינות.
19. לדלל הנוגדן 2° ב 1% BSA עם 0.3% טריטון X-100 ב 1 x PBS, להוסיף 200 μL של השקופית קאמרית ולאחר מכן תקופת דגירה של 1-3 ימים ב 4 ° C בחושך.
    הערה: משך הדגירה פעמים צריך להיות ממוטב וגודל תא צורב נוגדן. כמה ידרוש זמן רב יותר כדי לחדור דרך תא צורב. ריכוז נוגדן יהיה גם צורך ניתן למטב. באופן כללי, 2 x ריכוז המשמש עבור מקטעים FFPE מתאים 1° נוגדנים, ריכוז זהה עבור מקטעים FFPE מתאים 2° נוגדנים.
20. להסיר את הנוגדן 2°, לשטוף פעמיים עם μL 200 ל- PBS 1 x במשך 5 דקות תוך כדי טלטול בעדינות.
21. Counterstain של אקטין עם phalloidin והגרעין עם דאפי או Hoescht, מדולל לפי המלצות היצרן ב- 1% BSA עם 0.3% טריטון-X ב- 1 x PBS. להוסיף 200 μL קאמרית שקופית ולאחר מכן תקופת דגירה-RT של 40 דקות בחושך.
22. לעלות ב- 200 μL של טרי 1 x PBS או הרכבה מדיה על התמונה מיד (זריחה צריכה להישמר עד 5 ימים, אם לא יותר). התוצאות נציג מוצגים באיור 3C.
    הערה: אזיד הנתרן יכולים להוסיף דוגמאות כדי למנוע זיהום אם דימות קונאפוקלית אינם זמינים. הוספת סוכן ניקוי יכול לשפר את ההדמיה.

7. שלם-הרכבה של Organoids עבור מבחני וזונדים פלורסנט

הערה: ישנם מבחני זמינים מסחרית, רגשים/צבעי פלורסנט (דוגמאות נכללים ברשימת החומרים) amendable לשימוש רכוב כל organoids לבחון מגוון רחב של נקודות קצה שימושי¹⁹. הפרוטוקול הבא הוא עבור מתויג fluorescently אדו התפשטות ערכת, אולם ורקמות. יכול להיות שונה לשימוש עם מדגם רכוב שלם.

1. בזהירות להסיר את μL 50 של מדיה והחלף 50 μL של 20 μM 2 x עבודה אדו פתרון על-ידי pipetting כנגד הצד של, ובכן, עוזב את החלל בין מדיה, מטריקס ג'ל.
2. דגירה ב 4 ° C 1 – 3 ימים (לאורך הרצוי של זמן עבור עידו התאגדות צריך להיות אופטימיזציה עבור סוג התא של הבחירה).
3. בצע את שלבים 6.2 – 6.8 להעביר את organoids עניין קאמרית שקופיות או תבשיל קונפוקלי.
4. הסר PBS ותקן עם 200 μL של 3.7% paraformaldehyde למשך 30 דקות ב- RT תוך מנענע בעדינות. להבטיח כי המטריקס ג'ל מופיעים ברורה לאחר שלב זה.
5. הסרת מקבע את ולשטוף פעמיים עם μL 200 ל- PBS 1 x במשך 5 דקות תוך כדי טלטול בעדינות. להסיר PBS ולהוסיף 200 μL של 0.5% ללא יונית דטרגנט-100 ב- 1 x PBS למשך 30 דקות ב- RT תוך מנענע בעדינות.
6. להכין 1 x קוקטייל על פי מפרט היצרן פלורסנט התגובה.
7. הסר דטרגנט ללא יונית 0.5%-100, לשטוף פעמיים עם 200 μL של BSA 3% ב- PBS 1 x במשך 5 דקות תוך כדי טלטול בעדינות.
8. הוסף תגובה קוקטייל, תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT בחושך.
9. הסר התגובה פלורסנט קוקטייל, תשטוף פעם אחת עם 200 μL של BSA 3% 1 x PBS במשך 5 דקות תוך כדי טלטול בעדינות. Counterstain ו הר על-ידי ביצוע השלבים 6.21 – 6.22 (דמות תלת-ממד).

על תרבות מוצלח של האדם organoids הערמונית העיקרי, מורפולוגיה ובידול יכול להיות מוערך באמצעות ניתוח שדה בהיר תמונות, FFPE, טכניקות צביעת כולה-הר.

התהליך של לכידת התמונה בהיר-שדה מודגם ב איור 1A. Organoids גדלו ב מטריצה תלת-ממד, התפזרו על פני מטוסים מוקד שונים. לצפות organoids בפוקוס על פני מטוסים רבים, הוא הציע להשתמש בתמונה חה כ (איור 1B, נכון) במקום z-מטוס בודד (איור 1B, משמאל). במעבדה, organoids גדלו בתנאים ניסיוני שונים עלולים לגרום לשינויים מורפולוגיה. שימוש באזור, מעגליות (המוגדר על-ידי תא צורב עד כמה דומה הוא מעגל), מקסימום/מינימום רדיוס (מידת אורך) לתת למשתמשים אינדיקציה תא צורב הגודל והצורה ומספקים readout לכימות של מורפולוגיה. כדי להדגיש את התועלת של אמצעים אלה, להחליפן בתמונות של organoids עם אזור דומות אבל שונות מורפולוגיה מוצגים באיור 1C, בו תא צורב ארוך להיות פחות מעגלית, יש יחס מקסימום/מינימום גדול יותר מאשר כדורית תא צורב.

הטבעת organoids עבור היסטולוגיה היא נקודת קצה של שימושי להתבונן הפנימי של דגימות ולהבטיח שנמק הזה אינו נוכח בתוך תוכו של תא צורב. זרימת עבודה עבור תהליך זה ואת התוצאות נציג של הדגימות וללא רבב, המחולקת למקטעים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר ניתנים איור 2AB, C. איור 3A מראה כושלת תא צורב (משמאל) בהשוואה כראוי מסר organoids איור 3A (מימין), דמות 3B. כדי לקבוע את המצב-הבידול של המדגם, מומלץ להסתכל על התאים הבזליים סמנים (cytokeratin 5 ו p63)8 יחד עם סמנים (cytokeratin 8) תא luminal8. אם זה רצוי כתם organoids בחיי עיר, כולה-הר מכתים היא אלטרנטיבה נוחה ומסופקים התוצאות נציג דמות 3Cד

איור 1: מורפולוגיה הערכה של organoids בתרבות תלת-ממד. (א) תמונת אוסף ודחיסה זרימת עבודה עבור האדם organoids הערמונית העיקרי שרכשה אור המשודרת הפוכה מיקרוסקופ עם ממונע X / Y לסריקה הבמה ותוכנות לוויה. (B) להחליפן בתמונות של z יחיד-מחסנית (משמאל) לעומת. תמונה חה כ (מימין) של מדגם כל-טוב של האדם organoids הערמונית העיקרי, מראה כי הם organoids יותר מיקוד כאשר z-אוספים מרובים משולבים לתמונה המוקרנת אחת (סולם בר = 1000 מיקרומטר). (C) להחליפן בתמונות עבור יחס שטח מעגליות, מקסימום/מינימום של מורפולוגית שונה אנושי ראשוני הערמונית organoids אשר יש באותו האזור (סולם בר = מיקרומטר 200). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: תא צורב הטבעה זרימת העבודה ונציג חלוקתה תוצאות. (א) אנושי ראשוני הערמונית תא צורב הטבעה של זרימת עבודה. (B) תמונת הנציגה של שקופית וללא רבב, טריים המכילים האנושי organoids הערמונית הראשי תחת מיקרוסקופ שדה בהיר המתארים אגר (חץ ירוק), היסטולוגיה ג'ל (חץ שחור), בועה (חץ כחול), organoids (חצים אדומים) (סולם בר = 1000? מ')-(C) מוכתם. טרי חתוך שקופית (משמאל) לעומת. שקופית יבש וללא רבב (מימין), organoids (חצים אדומים) מופיעים שקוף כאשר יבש (סולם בר = 500 מיקרומטר), שקשה להבחין במיקרוסקופ שדה בהיר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: צביעת היסטולוגית על משרטוטי וטיפס על-ידי כל organoids. (א) H & E כתמים שבור אנושי ראשוני הערמונית תא צורב מן הנזק (pipetting אגרסיבי, הלא עיבוד פרוטוקול, משמאל) לצד תא צורב מהימנות (מימין) (סולם בר = 100 מיקרומטר). (B) אנושי ראשוני הערמונית תא צורב כי כבר פורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע, למחלקה, ואת עם תמונה עם מיקרוסקופ קונפוקלי (מוכתם הבזליים cytokeratin 5 או luminal cytokeratin 8 (למעלה) או הבזליים p63 ו luminal cytokeratin 8 (למטה) סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). (C) התלויות על כל אדם ראשי הערמונית תא צורב מוכתם הבזליים cytokeratin 5 או luminal cytokeratin 8, counterstained עם phalloidin, דאפי, עם תמונה עם מיקרוסקופ קונפוקלי (סולם בר = 100 מיקרומטר). (D) תא צורב התלויות על כל ראשי הערמונית תאים אנושיים מוכתם fluorescently שכותרתו אדו, מונה צבעונית עם Hoescht, עם תמונה עם מיקרוסקופ קונפוקלי (סולם בר = 500 מיקרומטר) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

המחברים אין לחשוף.